THESE DE DOCTORAT DE L'UNIVERSITE PARIS 6 Capucine ...

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6 Table des matières 2.2 Choix de la stratégie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 94 2.2.1 Choix du système Tet-Off . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 94 2.2.2 Choix d’une stratégie antisens . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 94 2.3 Description du système de régulation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 95 2.4 Constructions plasmidiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 96 2.5 Stratégie antisens . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 97 2.5.1 Inhibition in vitro de l’expression d’un gène par un ARN antisens . . . . . 98 2.5.2 Spécificité de l’antisens in vitro . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 98 2.5.3 Inhibition in vivo de l’expression d’un gène par un ARN antisens . . . . . 100 2.6 Système de régulation par un antisens conditionnel . . . . . . . . . . . . . . . . . 103 2.6.1 Evaluation du système de régulation in vitro . . . . . . . . . . . . . . . . 103 2.6.2 Régulation à long terme de l’expression de la hSeAP in vivo avec un sys- tème à trois plasmides . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 108 2.6.3 Régulation à long terme de l’expression de la hSeAP in vivo avec un sys- tème à deux plasmides . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 109 2.6.4 Régulation à long terme de l’expression de l’Epo in vivo . . . . . . . . . . 112 2.6.5 Remarque : étude de l’effet d’un ARN double brin dans une cellule . . . . 120 2.7 Conclusions et Perspectives . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 122 Chapitre 3 Obtention d’antisérums antitoxines botuliques 123 3.1 Les toxines botuliques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 123 3.1.1 Organisation fonctionnelle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 124 3.1.2 Mécanisme d’action . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 124 3.1.3 Le botulisme . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 126 3.1.4 Applications thérapeutiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 126 3.1.5 Bio-terrorisme . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 127 3.1.6 Stratégies actuelles anti-toxines . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 127 3.2 Procédés d’obtentions d’antisérums anti-BoNT . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 128 3.3 Fragment immunogène . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 129 3.4 Mécanisme de l’immunisation par ADN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 130 3.5 Description du projet . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 133 3.6 Première évaluation : antisérums anti-BoNTA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 134 3.6.1 Construction et validation du matériel génétique de départ . . . . . . . . . 134 3.6.2 Première évaluation in vivo : preuve du concept . . . . . . . . . . . . . . . 134 3.6.3 Test de neutralisation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 136 3.7 Optimisation du fragment immunogène . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 138
3.7.1 Optimisation des codons . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 138 3.7.2 Ajout d’un signal de sécrétion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 139 3.7.3 Constructions des vecteurs optimisés . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 140 3.7.4 Validation des vecteurs optimisés . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 140 3.7.5 Electrotransfert in vivo des différentes constructions . . . . . . . . . . . . 143 3.8 Optimisation du protocole . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 147 3.8.1 Effet de la hyaluronidase . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 149 3.8.2 Electrotransfert intradermique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 151 3.8.3 Injections multiples . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 153 3.9 Caractérisation des antisérums . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 155 3.10 Antisérums anti-BoNTB et anti-BoNTE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 158 3.10.1 Construction et validation du matériel génétique de départ . . . . . . . . . 158 3.10.2 Etude in vivo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 159 3.11 Sérums multivalents . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 160 3.12 Application de la technique au lapin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 163 3.12.1 Choix du protocole . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 163 3.12.2 Réalisation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 164 3.13 Conclusion et Perspectives . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 165 Chapitre 4 3.13.1 Remarques générales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 165 3.13.2 Bilan . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 165 3.13.3 Perspectives . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 166 Etude de l’état de l’ADN plasmidique après injection et électrotransfert 167 4.1 Contexte de travail . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 167 4.2 Détection du plasmide sous forme épisomale . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 168 4.3 Etude de la possible intégration de l’ADN plasmidique . . . . . . . . . . . . . . . 170 4.3.1 Stratégie n°1 : utilisation de séquences répétitives B1 et B2 . . . . . . . . 171 4.3.2 Stratégie n°2 : LAM-PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 173 4.3.3 Stratégie n°3 : amorce biotinylée + LAM-PCR . . . . . . . . . . . . . . . 175 4.3.4 Stratégie n°4 : la PCR RAIC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 177 4.3.5 Étude de la persistance du plasmide par PCR quantitative . . . . . . . . . 180 4.4 Etude de l’état de méthylation du promoteur CMV . . . . . . . . . . . . . . . . . 181 4.4.1 Introduction : la méthylation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 181 4.4.2 Objectif de l’étude . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 181 4.4.3 Traitement au bisulfite . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 182 4.4.4 Choix des amorces et mise au point avec le plasmide pXL3010 . . . . . . . 182 7
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100 Chapitre 2. Système de régula
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200 Bibliographie [107] M. J. Molna
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202 Bibliographie [153] J. J. Drabi
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204 Bibliographie [193] M. Dupuis,
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206 Bibliographie [239] M. Gossen e
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208 Bibliographie [284] H. Madry et
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210 Bibliographie [329] C. A. Torre
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212 Bibliographie [374] J. F. Coste
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Résumé Transfert de gène in vivo
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