Histologie : les tissus - Faculté de médecine Pierre et Marie Curie ...

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1.1.3.4 La lectinohistochimie Matériel et méthodes de l’histologie médicale. Le concept de tissu La lectinohistochimie (ou lectinocytochimie) repose sur l’utilisation de lectines, protéines d’origine animale, végétale ou bactérienne, capables de reconnaître et de se lier à des copules hydrocarbonées des composants cellulaires, notamment des sucres du cell-coat revêtant les membranes plasmiques. Les lectines sont spécifiques d’un sucre donné. 1.1.3.5 L’hybridation in situ L’hybridation in situ (HIS) détecte et localise des séquences d’ADN ou d’ARN. Elle utilise des sondes d’acides nucléiques qui mettent en évidence et localisent, dans des cellules ou des tissus, des séquences d’acides nucléiques complémentaires de la sonde par leurs bases. L’HIS est un outil incomparable pour étudier l’expression des gènes. Elle est proche, dans son principe, des Southern et des Northern blots et repose, comme eux, sur l’hybridation d’une sonde d’acide nucléique (ADN ou ARN) marquée dont la séquence est complémentaire des acides nucléiques que l’on cherche à identifier et à localiser. Alors que les Southern et Northern blot se font sur des broyats de tissus, l’HIS s’effectue sur coupe histologique, apportant ainsi des informations précises sur la localisation des acides nucléiques étudiés. Les sondes utilisées sont le plus souvent de l’ADN, un ARN-messager ou des oligonucléotides synthétiques. Le marquage des sondes peut être réalisé par des isotopes radio-actifs (« sondes chaudes » : tritium H3, phosphore P32 ou P33, soufre S35). La révélation se fait par autoradiographie. Le comptage des grains d’argent sur les autoradiographies permet une étude semi-quantitative. Le marquage des sondes peut également se faire par des produits non radio-actifs (sondes dites « froides ») [voir plus loin] 1.1.3.6 Les procédés de marquage, de révélation et d’observation Qu’il s’agisse de l’anticorps utilisé en immunohistochimie, de la lectine utilisée en lectinohistochimie ou de la sonde utilisée en hybridation in situ, les procédés de marquage et de révélation sont analogues. 20/119 Histologie : les tissus - André, Catala, Morère, Escudier, Katsanis, Poirier 2007 - 2008
Molécule à visualiser ANTIGENE (protéine) SUCRE (membranes plasmiques) ADN/ ARN Matériel et méthodes de l’histologie médicale. Le concept de tissu Réaction Marquage ANTICORPS 1aire = [I.C.C] AC 2aire = LECTINE [L.C.C] SONDE [H.I.S] froide FLUOROCHROME fluorescéine rhodamine, etc ENZYME ORCOLLOIDAL BIOTINE DIGOXYGENINE ISOTOPES chaude RADIO-ACTIFS Il s’agit de coupler (conjuguer) l’anticorps, la lectine ou la sonde avec : Révélation chromogène (DAB) chromogène AVIDINE AC-ANTI- Biotine AC-ANTI- DIG RADIO- AUTO- GRAPHIE Observation MO/UV M.confocal MO/(brun) MO/(rose) — soit un fluorochrome (c’est à dire un produit fluorescent, comme la fluorescéine ou la rhodamine) que l’on visualisera par l’observation au MO à lumière ultra-violette ou au microscope confocal. La technique de FISH (ou Fluorescent In Situ Hybridization) consiste à utiliser des sondes complémentaires des différents chromosomes et à les visualiser à l’aide d’anticorps fluorescents. — soit une enzyme (comme la peroxydase du raifort ou la phosphatase alcaline) que l’on fait agir sur son substrat ; le produit de la réaction enzymatique est révélé par un chromogène (comme la diaminobenzidine par exemple) qui le colore (en brun, en rose ou de toute autre couleur) et que l’on peut observer en MO. La sensibilité et la fiabilité des techniques immunohistochimiques utilisant les marquages par une enzyme (méthodes dites immuno-enzymatiques) ont été améliorées par plusieurs méthodes d’amplification du signal : couplage de l’anticorps secondaire avec un complexe peroxydase-anticorps anti-peroxydase (PAP), un complexe enzymatique (Alcalin Phosphatase Anti Alcalin Phosphatase, dite technique APAAP) ou un complexe avidine-biotine conjugué à un système de révélation (cf plus loin). La technique peroxydase-antiperoxydase (PAP) est la méthode de choix pour le diagnostic histopathologique de routine. L’anticorps secondaire 2007 - 2008 Histologie : les tissus - André, Catala, Morère, Escudier, Katsanis, Poirier 21/119 HRP AP ME MO ME
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