Syndrome métabolique et diabète chez l'Homme. Composition ...

SOMMAIRE
I.1. Ultracentrifugation séquentielle à temps courts : ............................................................................ 92
I.2. FPLC :.................................................................................................................................................. 92
II. Dosage des protéines : ............................................................................................................................... 94
III. Dosage du cholestérol total : ................................................................................................................... 94
IV. Dosage des triacylglycérols :.................................................................................................................... 95
V. Composition en acides gras des classes lipidiques : ................................................................................ 96
V.1. Extraction lipidique :......................................................................................................................... 96
V.2. Séparation des classes lipidiques par chromatographie sur couche mince : ................................ 96
V.3. Transméthylation des acides gras des classes lipidiques :.............................................................. 97
V.4. Analyse par chromatographie en phase gazeuse : .......................................................................... 97
VI. Quantification des lysophosphatidylcholines, des sphingomyélines et du cholestérol non estérifié par
HPLC couplée à un DDL :............................................................................................................................. 99
VII. Quantification des acides gras monohydroxylés totaux :.................................................................. 100
VII.1. Extraction lipidique :.................................................................................................................... 100
VII.2. Extraction des acides gras monohydroxylés totaux :................................................................. 101
VII.3. Analyse par HPLC couplée à un détecteur UV : ....................................................................... 101
VIII. Quantification de la 8-iso-prostaglandine F 2α totale :...................................................................... 102
VIII.1. Extraction lipidique : .................................................................................................................. 102
VIII.2. Purification et dérivation de la 8-iso-prostaglandine F 2α :....................................................... 102
VIII.3. Analyse par chromatographie en phase gazeuse couplée à un spectromètre de masse équipé
d’une trappe d’ions : ............................................................................................................................... 103
IX. Dosage du dialdéhyde malonique : ....................................................................................................... 105
IX.1. Dérivation et extraction : ............................................................................................................... 105
IX.2. Analyse par HPLC couplée à un détecteur fluorimétrique : ...................................................... 105
X. Dosage de la vitamine E :........................................................................................................................ 106
X.1. Extraction :....................................................................................................................................... 106
X.2. Analyse par HPLC couplée à un détecteur fluorimétrique : ....................................................... 107
XI. Dosage immuno-enzymatique de l’insuline : ....................................................................................... 107
XII. Détermination de la taille des LDL :................................................................................................... 108
METHODES RELATIVES AUX PLAQUETTES ........................................................................................ 110
I. Isolement et numération des plaquettes : ............................................................................................... 110
I.1. Isolement des plaquettes :................................................................................................................. 110
I.2. Numération des plaquettes :............................................................................................................. 110
II. Dosage des protéines : ............................................................................................................................. 110
III. Mesure de l’agrégation plaquettaire :.................................................................................................. 111
IV. Interactions des LDL avec les plaquettes : .......................................................................................... 111
IV.1. Conditions d’incubation : .............................................................................................................. 111
IV.2. Conditions de lyse plaquettaire :................................................................................................... 112
V. Analyse par immuno-empreinte de l’état de phosphorylation de la p38 MAPK et de la phospholipase
A 2 cytosolique : ............................................................................................................................................. 112
V.1. Electrophorèse : ............................................................................................................................... 112
V.2. Electro-transfert : ............................................................................................................................ 113
V.3. Traitements des membranes de nitrocellulose : ............................................................................ 113
V.4. Révélation :....................................................................................................................................... 113
VI. Dosage immuno-enzymatique du thromboxane B 2 : ........................................................................... 114
PROTOCOLE CLINIQUE ECLIPSE............................................................................................................ 116
ANALYSES STATISTIQUES ......................................................................................................................... 118
RESULTATS ET DISCUSSION ............................................................................. 119
COMPARAISON DE DEUX METHODES DE SEPARATION DES LDL................................................ 120
I. Composition lipidique des LDL :............................................................................................................. 120
I.1. Classes lipidiques des LDL :............................................................................................................. 120
I.2. Composition en acides gras des classes lipidiques :........................................................................ 121
I.2.a. Esters de cholestérol : ............................................................................................................... 121
Romain COLAS
Institut National des Sciences Appliquées
Mémoire de thèse
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