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INSTRUCTIONS FOR USE 

BINDAZYME Human Anti- ß 2 GP1 IgA S 

Enzyme Immunoassay Kit 

MK141 

This kit is for in-vitro diagnostic use 

Product manufactured by: 

The Binding Site Ltd., PO Box 11712, Birmingham B14 4ZB, U.K. 

www.bindingsite.co.uk 

Telephone: +44 (0)121 436 1000 

Fax: +44 (0)121 430 7061 

e-mail: info@bindingsite.co.uk 

1 INTENDED USE 

This assay is intended for the in-vitro measurement of IgA autoantibodies 

against β 2 -glycoprotein 1 (β 2 GP1) present in human serum. This kit may be 

used in conjunction with other serological assays and clinical information to aid 

the diagnosis of thrombosis in at-risk patients, for instance those with primary 

antiphospholipid syndrome (APS) or APS secondary to systemic lupus 

erythematosus (SLE). 

Sufficient materials are supplied to allow a maximum of 41 samples to be tested 

in duplicate or 89 in single, with a calibration curve and a positive and negative 

control. 

2 BACKGROUND 

APS is characterised by the clinical syndrome of arterial and venous thrombosis 

and/or recurrent pregnancy morbidity in association with the presence of 

antiphospholipid antibodies (aPL) 1 . aPL comprise of a range of autoantibodies 

that bind to cardiolipin alone, to cardiolipin complexed to cofactor and to 

cofactor alone. This cofactor has been identified as the 50kD plasma protein 

β 2 GP1 (apolipoprotein H) 2,3 . β 2 GP1 inhibits the intrinsic coagulation pathway 4 , 

binds to platelets 5 and inhibits ADP mediated platelet aggregation 6 . 

Anticardiolipin autoantibodies from patients with SLE and primary APS bind to 

an altered form of β 2 GP1 produced by the interaction with negatively charged 

phospholipid 7 . This modified β 2 GP1 can be reproduced by binding β 2 GP1 

directly to polystyrene plates 7 , where clustering or the high density of antigen 

allows bi- or multivalent autoantibody binding and subsequent detection by 

ELISA methods. Eliminating the phospholipid and using only β 2 GP1 in this 

format produces an assay with an enhanced specificity for APS in view of their 

predominance as the major autoantibody in the sera of APS patients 8 . 

Recently IgG and IgM anti-β 2 GP1 have been included as laboratory criteria for 

APS when present at sufficiently high level, and the same committee concluded 

that IgA anti-β 2 GP1 are the most frequently detected antibodies in patients in 

specific ethnic groups 1 . 

3 PRINCIPLE OF THE ASSAY 

Microwells are pre-coated with human β 2 GP1 antigen. The calibrators, controls 

and diluted patient samples are added to the wells and autoantibodies 

recognising the β 2 GP1 antigen bind during the first incubation. After washing 

the wells to remove all unbound proteins, purified peroxidase labelled rabbit 

anti-human IgA (α chain specific) conjugate is added. The conjugate binds to 

the captured human autoantibody and the excess unbound conjugate is 

removed by a further wash step. Bound conjugate is visualised with 3,3’,5,5’ 

tetramethylbenzidine (TMB) substrate which gives a blue reaction product, the 

intensity of which is proportional to the concentration of autoantibody in the 

sample. Phosphoric acid is added to each well to stop the reaction. This 

produces a yellow end-point colour, which is read at 450nm. 

4 PRECAUTIONS 

4.1 WARNING 

• All human sera supplied have been tested at donor level and found negative for 

Hepatitis B surface antigens and antibodies to HIV 1 and 2 and Hepatitis C virus. 

However, these tests cannot guarantee the absence of infectious agents. Proper 

handling and disposal methods should be established and only personnel 

qualified in handling of potentially infectious materials should be permitted to use 

this kit. 

• Sodium azide may react with lead and copper plumbing to form explosive metal 

azides. On disposal of reagents flush with a large volume of water, to prevent 

azide build-up. 

• The buffers and serum supplied in this kit contain various enzyme inhibitors as 

listed below. These should be handled with care. 

INHIBITOR 

CONCENTRATION 

Kathon 

0.02% 

Sodium azide 

0.099% 

ProClin 300 

0.045% 

Bromonitrodioxane 

0.002% 

Methylisothiazone 

0.002% 

ProClin is a trademark of Rohm and Haas Corp. Philadelphia, PA 

• Kathon is an irritant and may cause sensitisation by skin contact. 

• The stop solution contains 3M phosphoric acid, which is an irritant. Avoid contact 

with skin and eyes. 

• Reagent spills should be cleaned up appropriately, observing local and 

environmental regulations. 

4.2 CAUTION 

• This product should only be used by appropriately trained personnel. 

• Strict adherence to the protocol is recommended. Any deviation may affect assay 

performance, and the results obtained. Pay attention to specific ‘Notes’ and 

warnings throughout these Instructions for Use. 

• Calibrator, control, conjugate and plate batch numbers are not 

interchangeable. Substitution of such components with batch numbers that 

differ from those that are provided in the kit could lead to inconsistent and 

inaccurate results. All strips must be taken from the same foil pouch. 

• To avoid reagent contamination, only use new or clean plastic / glassware. 

Never return unused reagents to the bottles. 

• Do not leave reagent bottles uncapped; any resulting evaporation or 

contamination will lead to inconsistent results. 

• TMB substrate must not be exposed to light or water. 

• Microbially contaminated, haemolysed or lipaemic serum and specimens 

containing particulate matter should not be used. 

• Inaccurate sample dilution cannot be checked, as kit controls are ready to use. 

The use of calibrated pipettes and appropriate internal QC samples is 

recommended. 

• The use of automated assay systems, sample dilutors and other automated 

equipment may lead to differences in results when compared to the manual 

procedure. It is the responsibility of any laboratory to fully validate the system, 

and ensure the results fall within the limits as defined in this insert and 

associated QC certificate. 

• All equipment used must be calibrated and maintained according to the 

manufacturer’s instruction. 

4.3 STORAGE AND STABILITY 

• The kit should be stored at 2-8°C and should not be frozen. Inappropriate 

storage temperatures will affect the results. 

• Wash buffer diluted into a clean container can be stored at room temperature 

(20-24°C) for a maximum of 4 weeks. 

• The expiry date of the kit is shown on the outer label. 

5 SAMPLE COLLECTION AND STORAGE 

• Blood samples should be collected by venepuncture allowed to clot naturally 

and the serum separated. 

• The serum may be stored at 2-8°C for up to 7 days prior to assay 9 , or for 

prolonged storage, aliquoted and stored at -20°C or below. 

• Repeated thawing and freezing should be avoided. 

• Serum samples should not be heat-inactivated, as this may give false positive 

results. 

6 MATERIALS 

6.1 MATERIALS SUPPLIED 

Each kit contains the following product-specific reagents: 

• Instruction leaflet: Giving full assay details. 

• QC Certificate: Indicating the expected performance of the batch. 

• β 2 GP1 S Coated Wells: 12 breakapart 8-well strips coated with human β 2 GP1 

antigen. The plate is packaged in a re-sealable foil bag containing two 

desiccant pouches. 

• APS Sample Diluent: 2 bottles containing 50mL of buffer for sample dilution. 

Coloured yellow, ready to use. 

• APS Wash Buffer (20x Concentrate): 1 bottle containing 50mL of a 20-fold 

concentrated buffer for washing the wells. 

• β 2 GP1 IgA S Calibrators: 5 bottles each containing 1.2mL of diluted human 

serum, with the following concentrations of anti-β 2 GP1 autoantibody: 300, 100, 

33.3, 11.1, 3.7 U/mL. Ready to use. 

• β 2 GP1 IgA S Positive Control: 1 bottle containing 1.2mL of diluted human 

serum. The expected value is given on the QC certificate. Ready to use. 

• β 2 GP1 S Negative Control: 1 bottle containing 1.2mL of diluted human serum. 

The expected value is given on the QC certificate. Ready to use. 

• β 2 GP1 IgA S Conjugate: 1 bottle containing 12mL of purified peroxidase 

labelled antibody. Coloured green. Ready to use. 

• TMB Substrate: 1 bottle containing 14mL TMB substrate. Ready to use. 

• Stop Solution: 1 bottle containing 14mL of 3M phosphoric acid. Ready to use. 

6.2 ADDITIONAL MATERIALS AND EQUIPMENT - not supplied 

• Automatic microplate plate washer: This is recommended, however, plate 

washing can be performed manually. 

• Plate reader: Capable of measuring optical densities at 450nm referenced on 

air. 

• Distilled or deionised water: This should be of the highest quality available. 

• Calibrated micropipettes: For dispensing 1000, 100 & 10µL. 

• Multichannel pipette: Recommended for dispensing 100µL volumes of 

conjugate, substrate and stop solution. 

• Glass/plastic tubes: For sample dilution. 

7 ASSAY METHOD 

7.1 PRE-ASSAY STEPS 

1. Bring the kit to room temperature 

• The kit is designed for room temperature operation (20-24°C). 

• Remove the kit from storage and stand at room temperature for approximately 

60 minutes. Wells must not be removed from the foil bag until they have 

reached room temperature. 

Note: The kits may be maintained at room temperature for up to 1 week. 

2. Kit components 

Gently mix each kit component before use. 

3. Wash buffer dilution 

Add 50mL of the wash buffer concentrate to 950mL of distilled water (1 in 20 

dilution) into a clean container and mix. Smaller volumes can be diluted as 

appropriate. 

Note: Diluted wash buffer can be stored at room temperature for up to 4 weeks, 

therefore only dilute the appropriate amount. 

Insert Code: E141, Version: 17 January 2008, Page 1 of 13

4. Sample dilution 

Dilute 10µL of each sample with 1000µL of sample diluent (1:100) and mix well. 

Note: Diluted sample must be used within 8 hours. 

5. Strip and frame handling 

Place the required number of wells in the strip holder. Position from well A1, 

filling columns from left to right across the plate. When handling the plate, 

squeeze the long edges of the frame to prevent the wells falling out. 

Note: Return unused wells to the foil bag immediately with the two desiccant 

pouches and re-seal tightly to minimise exposure to moisture. Take care not to 

puncture or tear the foil bag, see below. 

WARNING: Exposure of wells to moisture or contamination by dust or 

other particulate matter will result in antigen degradation, leading to poor 

assay precision and potentially false results. 

7.2 ASSAY METHOD 

Maintain the same dispensing sequence throughout the assay. 

1. Sample addition 

Dispense 100µL of each calibrator, control and diluted (1:100) sample into the 

appropriate wells of the plate provided. 

Note: Samples should be added as quickly as possible to the plate to minimise 

assay drift, and the timer started after the addition of the last sample. 

Incubate at room temperature for 30 minutes. 

2. Washing 

The washing procedure is critical and requires special attention. An improperly 

washed plate will give inaccurate results, with poor precision and high 

backgrounds. 

After incubation remove the plate and wash wells 3 times with 250-350µL wash 

buffer per well. Wash the plate either by using an automatic plate washer or 

manually as indicated below. After the final automated wash, invert the plate 

and tap the wells dry on absorbent paper. 

Plates can be washed manually as follows: 

a. Flick out the contents of the plate into a sink. 

b. Tap the wells dry on absorbent paper. 

c. Fill each well with 250-350µL of wash buffer using a multichannel pipette. 

d. Gently shake the plate on a flat surface. 

e. Repeat a-d twice. 

f. Repeat a and b. 

3. Conjugate addition 

Dispense 100µL of conjugate into each well, blot the top of the wells with a 

tissue to remove any splashes. 

Note: To avoid contamination, never return excess conjugate to the reagent 

bottle. 

Incubate at room temperature for 30 minutes. 

4. Washing 

Repeat step 2. 

5. Substrate (TMB) addition 

Dispense 100µL of TMB substrate into each well, blot the top of the wells with a 

tissue to remove any splashes. 

Note: To avoid contamination, never return excess TMB to the reagent bottle. 

Incubate at room temperature in the dark for 30 minutes. 

6. Stopping 

Dispense 100µL of stop solution into each well. This causes a change in colour 

from blue to yellow. 

7. Optical density measurement 

Read the optical density (OD) of each well at 450nm on a microplate reader, 

within 30 minutes of stopping the reaction. 

8 RESULTS AND QUALITY CONTROL 

1. Quality control 

In order for an assay to be valid, all the following criteria must be met: 

• Calibrators and positive and negative controls must be included in each run. 

• The values obtained for the positive and negative controls should be in the 

ranges specified on the QC Certificate. 

• The curve shape should be similar to the calibration curve, shown on the QC 

Certificate. 

If the above criteria are not met, the assay is invalid and the test should 

be repeated. 

2. Calculate mean optical densities (for assays run in duplicate only) 

For each calibrator, control and sample calculate the mean OD of the duplicate 

readings. The percentage coefficient of variation (% CV) for each duplicate OD 

should be less than 15%. 

3. Plot calibration curve 

The calibration curve can be plotted either automatically or manually by plotting 

the anti-β 2 GP1 autoantibody concentration on the log scale against the OD on 

the linear scale for each calibrator: 

• Automatic - use appropriately validated software, and the curve fit that best fits 

the data. 

• Manual - using log/linear graph paper, draw a smooth curve through the points 

(not a straight line or point to point). 

4. Treatment of anomalous points 

If any one point does not lie on the curve, it can be removed. If the absence of 

this point means that the curve has a shape dissimilar to that of the sample 

calibration curve, or more than one point appears to be anomalous, then the 

assay should be repeated. 

5. Calculation of autoantibody levels in controls and samples 

Read the level of the anti-β 2 GP1 autoantibody in the controls and diluted 

samples directly from the calibration curve. The control values should fall within 

the ranges given on the QC Certificate. 

Note: The calibrator values have been adjusted by a factor of 100 to account 

for a 1:100 sample dilution. No further correction is required. 

6. Assay calibration 

The assay is calibrated in U/mL against an internal arbitrary reference 

calibrator, as no internationally recognised standard is currently available. 

7. Limitations 

• The results obtained from this assay are not diagnostic proof of the presence or 

absence of disease. 

• Where results produce a negative serum anti-β 2 GP1, in the presence of clinical 

indications, an anti-cardiolipin, lupus anti-coagulant or additional test is 

required. 

• Patient treatment must not begin on the basis of a positive anti-β 2 GP1 result 

alone. Clinical indications must also be present. 

9 PERFORMANCE CHARACTERISTICS 

9.1 PRECISION 

The intra-assay precision was measured using six samples tested 20 times 

within one assay across the range of the calibration curve. The concentration 

and % C.V. for each sample are given below: 

INTRA-ASSAY PRECISION 

n=20 Concentration (U/mL) % CV 

Sample 1 6.4 5.8 

Sample 2 16.0 2.9 

Sample 3 20.5 2.9 

Sample 4 37.4 4.6 

Sample 5 48.7 3.6 

Sample 6 66.4 4.1 

The inter-assay precision was measured using six samples tested in duplicate 

six times over three days. The concentration and % C.V. for each sample are 

given below. 

INTER-ASSAY PRECISION 


Sample 1 6.1 10.7 

Sample 2 15.8 3.6 

Sample 3 19.5 5.1 

Sample 4 37.9 4.4 

Sample 5 49.3 3.7 

Sample 6 65.4 2.6 

9.2 NORMAL RANGE 

Anti-β 2 GP1 autoantibody levels were measured in serum from 100 male and 

100 female normal blood donors. The results are displayed in the graph below. 

Based on a positive cut-off of 20.0U/mL, the two positive samples obtained 

were confirmed positive using an alternative manufacturer’s anti-β 2 GP1 IgA kit. 

Number of samples 

120 

100 

80 

60 

40 

20 

This normal range is provided as a guide only. It is recommended that each 

laboratory determine its own normal range. 

9.3 RELATIVE SPECIFICITY, SENSITIVITY, AGREEMENT 

The relative specificity, sensitivity and agreement have been determined 

against an alternative anti-β 2 GP1 IgA kit using 114 clinical and normal samples. 

The samples were from 46 SLE patients who had previously tested positive for 

anti-phospholipid antibodies, 8 from patients with primary anti-phospholipid 

syndrome, 20 RA patients, 20 SLE patients with unknown APS status and 20 

normal sera from healthy blood donors. The status of the samples was 

determined applying a positive cut-off of 20.0U/mL with a borderline region of 

15-20U/mL for the BINDAZYME IgA S assay and that recommended in the 

alternative kit. 

EIA 

BINDAZYME 

Anti-β 2 GP1 IgA S EIA 

Alternative EIA 

+ *Borderline - 

+ 18 2 1 

Borderline 3 3 3 

- 1^ 5 78 

Relative sensitivity 94.7% 

Relative specificity 98.7% 

Relative agreement 98.0% 

*Samples in the borderline range were excluded from the analysis 

^The discrepant sample tested negative in an alternate kit 

9.4 ANALYTICAL SENSITIVITY 

Confirmation that the anti-β 2 GP1 IgA S assay can distinguish between two 

samples with values close to the bottom of the measuring range (173 and 199% 

of the lowest calibrator) was obtained by statistical analysis (Student’s t-test) of 

the results obtained from testing multiple replicates of each sample. 

9.5 MEASURING RANGE 

0 

20.0 

IgA Anti-B2GP1 U/mL 

The measuring range of the assay is 3.7-300U/mL. 


9.6 INTERFERING SUBSTANCES 

A range of interfering substances was spiked into anti-β 2 GP1 IgA positive and 

negative samples, which were subsequently assayed. The method used to 

check the effect of these substances used the Interference Check A plus kit 

from Kokusai, Shiyaku, Japan. 

Substance 

Concentration 

Bilirubin F (free) 

18.0mg/dL 

Bilirubin C (conjugate) 

19.3mg/dL 

Haemolysed haemoglobin 

482mg/dL 

Chyle 

1430FT Units 

Rheumatoid Factor 

50.0 IU/mL 

No interference was observed in samples tested. 

10 EXPECTED VALUES 

The positive cut-off based on the assay of 100 male and 100 female normal 

serum samples has been determined for the anti-β 2 GP1 IgA assay to be 

20.0U/mL, with a borderline region of 15.0-20.0U/mL. The ranges are provided 

as a guide only. ELISA assays are very sensitive and capable of detecting small 

differences in sample populations 

11 REFERENCES 

IgA anti-β 2 GP1 

< 15.0 U/mL Negative result 

15.0-20.0 U/mL Borderline 

>20.0 U/mL Positive result 

1. Miyakis S, Lockshin MD, Atsumi T, Branch DW, Brey RL, et al. (2006). 

International concensus statement on an update of the classification criteria for 

definite antiphospholipid syndrome. J Thromb Haemost; 4: 295-306. 

2. Galli M, Comfurius P, Maassen C, Hemker HC, de Baets MH, et al. (1990). 

Anticardiolipin antibodies (ACA) directed not to cardiolipin but to a plasma 

protein cofactor. Lancet; 335: 1544-7. 

3. McNeil HP, Simpson RJ, Chesterman CN & Krilis SA. (1990). Anti-phospholipid 

antibodies are directed against a complex antigen that includes a lipid-binding 

inhibitor of coagulation: beta 2-glycoprotein I (apolipoprotein H). Proc Natl Acad 

Sci USA; 87:4120-4124. 

4. Schousboe I. (1985). β 2 -Glycoprotein I: A plasma inhibitor of the contact 

activation of the intrinsic blood coagulation pathway. Blood; 66: 1086-1091. 

5. Nimpf J, Bevers EM, Bomans PH, Till U, Wurm H, et al. (1986). Prothrombinase 

activity of human platelets is inhibited by β 2 -glycoprotein-I. Biochim. Biophys. 

Acta; 884: 142-149. 

6. Nimpf J, Wurm H & Kostner GM. (1987). β 2 -Glycoprotein-I (apo-H) inhibits the 

release reaction of human platelets during ADP-induced aggregation. 

Atherosclerosis; 63: 109-114. 

7. Matsuura E, Igarashi Y Yasuda T, et al (1994). Anticardiolipin antibodies 

recognize beta 2-glycoprotein I structure altered by binding with an oxygenated 

modified solid phase surface. J Exp Med; 179:457-462. 

8. Matsuura E, & Koike T. (1996) in: Autoantibodies, pp 109-114, Peter JB & 

Shoenfeld Y (eds), Elsevier Science, Amsterdam. 

9. Protein Reference Unit Handbook of Autoimmunity (3rd Edition) 2004 Ed A 

Milford Ward. J. Sheldon, GD Wild. Publ. PRU Publications, Sheffield. 14. 

12 PLATE TEMPLATE 

Please see back of insert. 

Summary of procedure 

1. Add 100µL of each calibrator, control and 1:100 diluted sample to 

the appropriate wells. 

Incubate for 30 minutes. 

Wash. 

2. Add 100µL of conjugate to each well. Incubate for 30 minutes. 

Wash. 

3. Add 100µL of substrate to each well. 

Incubate for 30 minutes. 

4. Add 100µL of stop solution to each well. 

Measure the absorbance at 450nm. 

BINDAZYME is a trademark of 

The Binding Site Ltd. 

P.O. Box 11712, Birmingham 

B14 4ZB England 


ARBEITSANLEITUNG 

BINDAZYME TM Human Anti-ß 2 GP1 IgA S 

Enzym-Immunoassay-Kit 

MK141 

Nur zur in-vitro Diagnostik 

Hergestellt von: 

The Binding Site Ltd, PO Box 11712, Birmingham, B14 4ZB, UK. 

www.bindingsite.co .uk 

Vertrieb in Deutschland und Österreich durch: 

The Binding Site GmbH, Robert-Bosch-Straβe 2A 

D-68723 Schwetzingen, Deutschland 

Telefon: +49 (0) 6202 92 62 0 

Fax: +49 (0) 6202 92 62 222 

e-mail: office@bindingsite.de 

1 VERWENDUNGSZWECK 

Dieser Kit dient der in-vitro Bestimmung von IgA-Autoantikörpern gegen 

ß 2 -Glykoprotein 1 (ß 2 GP1) in Humanserum. Der Test kann zusammen mit 

anderen serologischen und klinischen Befunden bei der Diagnosestellung von 

Thrombosen bei Risikopatienten mit z.B. primärem Antiphospholipid-Syndrom 

(APS) oder sekundärem APS, bei dem in der Regel ein systemischer Lupus 

erythematodes (SLE) zugrunde liegt, helfen. 

Der Kit enthält ausreichend Material, um maximal 41 Proben in Doppelbestimmung 

oder 89 Proben in Einzelbestimmung, eine Kalibrationskurve und 

je eine Positiv- und eine Negativkontrolle messen zu können. 

2 EINFÜHRUNG 

APS ist klinisch durch arterielle und venöse Thrombosen und/oder 

wiederkehrende habituelle Aborte gekennzeichnet, wobei sich jeweils 

Antiphospholipid-Antikörpern (aPL) nachweisen lassen 1 . Zu diesen Antiphospholipid-Antikörpern 

gehören eine Reihe verschiedener Autoantikörper, die 

entweder nur an Cardiolipin, an den Cardiolipin-Cofaktor-Komplex oder nur an 

den Cofaktor binden. Als Cofaktor wurde das 50kD Plasmaprotein β 2 GP1 

(Apolipoprotein H) identifiziert 2,3 . β 2 GP1 inhibiert die intrinsische Gerinnungskaskade 

4 , bindet an Thrombozyten 5 und inhibiert die ADP-vermittelte 

Thrombozyten-Aggregation 6 . 

Anti-Cardiolipin-Autoantikörper von SLE- und APS-Patienten binden an eine durch 

die Wechselwirkung mit negativ geladenem Phospholipid veränderte Form von 

β 2 GP1 7 . Dieses modifizierte β 2 GP1 kann durch direkte Bindung von β 2 GP1 an 

Polystyrolplättchen 7 reproduziert werden, an denen die Clusterbildung oder hohe 

Dichte des Antigens eine bi- oder multivalente Bindung des Autoantikörpers 

erlaubt und demzufolge im ELISA nachweisbar ist. Durch Eliminierung des 

Phospholipids und ausschließliche Verwendung dieser Form von β 2 GP1 erhält 

man einen Test, der in Hinblick auf das vorherrschende Auftreten dieses 

Autoantikörpers in den Seren von APS-Patienten eine erhöhte Spezifität für APS 

aufweist 8 . 

Unlängst wurden anti-ß 2 GP1-Antikörper vom IgG- und IgM-Typ unter der 

Vorausssetzung, dass sie einen entsprechend hohen Titer aufweisen, in die 

Laborkriterien zur Diagnose eines definitiven APS neu aufgenommen; hinsichtlich 

der anti-ß 2 GP1-Antikörper vom IgA-Typ wurde von demselben Komitee 

abschließend festgehalten, dass sie am häufigsten bei spezifischen ethnischen 

Gruppen nachweisbar sind 1 . 

3 TESTPRINZIP 

Die Vertiefungen (Wells) der Mikrotiterplatten sind mit humanem β 2 GP1 

beschichtet. Die Kalibratoren, Kontrollen und verdünnten Patientenproben 

werden in den Vertiefungen inkubiert, so dass in diesem ersten 

Inkubationsschritt Autoantikörper an das immobilisierte ß 2 GP1-Antigen binden 

können. Nach dem Waschen der Vertiefungen - um ungebundenes Protein zu 

entfernen - wird Peroxidase-markiertes Kaninchen anti-Human-IgA-Konjugat 

(spezifisch für die α-Kette) zugegeben. Das Konjugat bindet an die gebundenen 

humanen Autoantikörper. Ungebundenes Konjugat wird durch einen weiteren 

Waschschritt entfernt. Das gebundene Konjugat wird mit Hilfe von 3,3’,5,5’ 

Tetramethylbenzidin (TMB) sichtbar gemacht. TMB ergibt ein blaues Reaktionsprodukt, 

dessen Intensität proportional zur Autoantikörper-Konzentration der 

Probe ist. Um die Reaktion zu stoppen, wird in jede Vertiefung Phosphorsäure 

pipettiert. Das gelbe Reaktionsprodukt wird bei 450nm gemessen. 

4 WARNUNGEN UND VORSICHTSMAßNAHMEN 

4.1 WARNUNGEN 

• Jede Einzelspende wurde bezüglich Antikörpern gegen Human- 

Immunschwäche-Virus (HIV 1 & 2), Hepatitis C-Virus und Hepatitis-B-Oberflächenantigen 

(HBsAg) untersucht und als negativ befunden. 

• Es gibt aber zur Zeit keine absolut sicheren Testmethoden zum Ausschluss von 

Infektionsträgern. Deshalb sollten die Reagenzien als potenziell infektiös 

behandelt werden. Umgangs- und Entsorgungsmethoden sollten denen für 

potenziell infektiösem Material entsprechen und der Test nur von entsprechend 

geschultem Personal durchgeführt werden. 

• Natriumazid kann mit Blei- oder Kupferrohren explosive Metallazide bilden. 

Nach der Entsorgung mit ausreichender Menge Wasser nachspülen, um 

Azidablagerungen zu vermeiden. 

• Alle Puffer und Seren im Kit enthalten die unten aufgelisteten Enzym-Inhibitoren 

als Konservierungsmittel. Diese sollten mit der entsprechenden Vorsicht 

behandelt werden. 

INHIBITOR 

KONZENTRATION 

Kathon 

Natriumazid 

ProClin 300 

Bromonitrodioxan 

Methylisothiazon 

0,02% 

0,099% 

0,045% 

0,002% 

0,002% 

ProClin ist ein eingetragenes Warenzeichen der Rohm and Haas Corp. Philadelphia, PA 

• Kathon wirkt reizend und kann bei Hautkontakt zu einer Sensibilisierung führen. 

• Die Stopp-Lösung enthält 3M Phosphorsäure. Sie ist reizend, deshalb Kontakt 

mit Haut und Augen vermeiden. 

• Verschüttete Reagenzien entsprechend beseitigen, dabei sind ökologische und 

gesetzliche Bestimmung zu beachten. 

4.2 VORSICHTSMAßNAHMEN 

• Dieser Test sollte nur von entsprechend geschultem Laborpersonal 

durchgeführt werden. 

• Testdurchführung strikt nach Arbeitsanleitung. Jegliche Abweichung kann die 

Testqualität und Ergebnisse beeinflussen. Beachten Sie die spezifischen 

‚Hinweise‘ und Warnungen in dieser Arbeitsanleitung. 

• Die Chargen von Kalibratoren, Kontrollen, Konjugat und Mikrotiterstreifen sind 

nicht austauschbar. Wird eine dieser Komponenten durch eine andere Charge, 

die nicht in dem gelieferten Kit enthalten ist, ersetzt, kann es zu inkonsistenten 

und inakkuraten Ergebnissen kommen. Alle Mikrotiterstreifen müssen aus 

demselben Folienbeutel entnommen werden. 

• Zur Vermeidung von Kontaminationen der Reagenzien immer saubere Plastikoder 

Glasgefäße verwenden. Niemals unbenutztes Reagenz in die Flaschen 

zurückgeben. 

• Reagenzienflaschen nicht für längere Zeit offen stehen lassen. Die daraus 

resultierende Verdunstung oder Verunreinigung führt zu widersprüchlichen 

Ergebnissen. 

• TMB darf weder mit Licht noch mit Wasser in Berührung kommen! 

• Die Verwendung von mikrobiell oder mit Partikeln verunreinigter, hämolytischer 

oder lipämischer Seren vermeiden. 

• Falsche Probenverdünnungen können nicht erkannt werden, da die Kit- 

Kontrollen gebrauchsfertig sind. Es wird empfohlen, kalibrierte Pipetten und 

geeignete interne Kontrollen zu verwenden. 

• Die Verwendung von ELISA-Automaten, Pipettierautomaten oder anderen 

automatisierten Geräten kann im Vergleich zur manuellen Testdurchführung zu 

abweichenden Ergebnissen führen. Jedes Labor muss das System vollständig 

validieren und sicherstellen, dass die Ergebnisse innerhalb der im QC-Zertifikat 

angegebenen Spezifikationen liegen. Das QC-Zertifikat ist dieser 

Arbeitsanleitung beigefügt. 

• Die verwendeten Geräte und Pipetten müssen gemäß der Herstellerangaben 

kalibriert und gewartet werden. 

4.3 LAGERUNG UND STABILITÄT 

• Den Kit bei 2-8°C lagern, nicht einfrieren. Lagerung bei falscher Temperatur 

beeinflusst die Ergebnisse. 

• Der verdünnte Waschpuffer ist in einem sauberen Gefäß bei Raumtemperatur 

(20-24°C) bis maximal 4 Wochen haltbar. 

• Die Haltbarkeit des Kits wird auf dem Außenetikett angegeben. 

5 PROBENENTNAHME UND -VORBEREITUNG 

• Blutproben über Venenpunktur sammeln und auf natürliche Weise gerinnen 

lassen. Serum vom Gerinnsel trennen. 

• Die Seren können bei 2-8°C bis zu 7 Tage vor dem Test gelagert werden 9 . Für 

eine längere Lagerung empfiehlt es sich, die Seren unverdünnt und aliquotiert 

bei mindestens -20°C einzufrieren. 

• Wiederholtes Einfrieren und Auftauen der Proben vermeiden. 

• Serumproben nicht hitzeinaktivieren, dies kann zu falsch-positiven Ergebnissen 

führen. 

6 MATERIALIEN 

6.1 GELIEFERTE MATERIALIEN 

• Arbeitsanleitung: mit genauen Angaben zur Testdurchführung. 

• QC-Zertifikat: mit Angabe der Leistungsdaten der Charge. 

• ß 2 GP1 S Coated Wells (mit ß 2 GP1 S beschichtete Wells): 12 Mikrotiterstreifen 

mit 8 vereinzelbaren Vertiefungen, die mit humanem ß 2 GP1 beschichtet sind. 

Die Streifen sind in einem wiederverschließbaren Folienbeutel, der ein 

Trockenmittel enthält, verpackt. 

• APS Sample Diluent (APS-Probendiluens): 2 Flaschen mit je 50mL 

gebrauchsfertigem Puffer zur Probenverdünnung. Farbcodierung: gelb. 

• APS Wash Buffer (20x Concentrate) (APS-Waschpuffer, 20fach-Konzentrat): 

1 Flasche mit 50mL eines 20-fach konzentrierten Puffers zum Waschen der 

Vertiefungen der Mikrotiterstreifen. 

• ß 2 GP1 IgA S Calibrators (ß 2 GP1 IgA S Kalibratoren): 5 Flaschen mit jeweils 

1,2mL vorverdünntem Humanserum, das folgende Konzentrationen an Antiß 

2 GP1-Autoantikörpern enthält: 300; 100; 33,3; 11,1 und 3,7 U/mL. 

Gebrauchsfertig. 

• ß 2 GP1 IgA S Positive Control (ß 2 GP1 IgA S Positivkontrolle): 1 Flasche mit 

1,2mL vorverdünntem Humanserum. Der Sollwert ist auf dem QC-Zertifikat 

angegegen. Gebrauchsfertig. 

• ß 2 GP1 S Negative Control (ß 2 GP1 S Negativkontrolle): 1 Flasche mit 1,2mL 

vorverdünntem Humanserum. Der Sollwert ist auf dem QC-Zertifikat 

angegegen. Gebrauchsfertig. 

• ß 2 GP1 IgA S Conjugate (ß 2 GP1 IgA S-Konjugat): 1 Flasche mit 12mL 

gereinigtem, Peroxidase-markiertem Antikörper. Farbcodierung: grün. 


• TMB Substrate (TMB-Substrat): 1 Flasche mit 14mL TMB-Lösung. Gebrauchsfertig. 

• Stop Solution (Stopp-Lösung): 1 Flasche mit 14mL 3M Phosphorsäure. 


6.2 BENÖTIGTE, NICHT IM KIT ENTHALTENE MATERIALIEN 

• Automatisches Mikrotiterplatten-Waschgerät: ist empfehlenswert, aber die 

Platten können auch manuell gewaschen werden. 

• Mikrotiterplatten-Reader: Messung der optischen Dichte (OD) in den 

Vertiefungen bei 450nm gegen Luft 

• Destilliertes Wasser: Es sollte von höchster Qualität und frei von Metallionen 

sein. 


• Kalibrierte Mikropipetten: zum Pipettieren von 1000, 100 & 10µL. 

• Mehrkanal-Pipette: zum Pipettieren eines Volumens von 100µL von Konjugat, 

Substrat und Stopp-Lösung. 

• Glas- oder Plastikgefäße: zur Probenverdünnung. 

7 TESTDURCHFÜHRUNG 

7.1 TESTVORBEREITUNG 

1. Kit auf Raumtemperatur erwärmen: 

• Die optimale Temperatur für die Testdurchführung liegt bei 20-24°C. 

• Den Kit nach Entnahme aus dem Kühlschrank ca. 60 Minuten bei Raumtemperatur 

stehen lassen. Die Wells dürfen erst nach Erreichen der 

Raumtemperatur aus dem Folienbeutel entnommen werden. 

Hinweis: Der Kit kann bis zu 1 Woche bei Raumtemperatur gelagert werden. 

2. Kit-Komponenten 

Jede Kit-Komponente vor Gebrauch kurz schütteln. 

3. Verdünnung des Waschpuffers (20fach-Konzentrat): 

50mL Waschpuffer-Konzentrat und 950mL destilliertes Wasser (1/20- 

Verdünnung) in ein sauberes Gefäß geben und mischen. Es können auch 

entsprechend kleinere Volumina verdünnt werden. 

Hinweis: Der verdünnte Puffer ist bei Raumtemperatur bis zu 4 Wochen 

haltbar; deshalb nur die benötigte Menge verdünnen. 

4. Verdünnung der Proben 

10µL jeder Probe mit 1000µL Probendiluens verdünnen (1:100) und gut mischen. 

Hinweis: Die verdünnten Proben müssen innerhalb von 8 h gemessen werden. 

5. Umgang mit Streifen und Rahmen 

Die benötigte Anzahl Wells aus dem Folienbeutel entnehmen und in den 

Rahmen setzen. Dabei von Position A1 ausgehend die Spalten von links nach 

rechts auffüllen. Achten Sie darauf, die langen Seiten des Rahmens 

zusammenzudrücken, damit die Wells nicht herausfallen können. 

Hinweis: Um die Kontaktzeit mit der Luftfeuchtigkeit zu minimieren, die nicht 

verwendeten Wells sofort in den wiederverschließbaren Folienbeutel mit dem 

Trockenmittel geben und gut verschließen. Darauf achten, dass der 

Folienbeutel nicht beschädigt wird. 

ACHTUNG: Kontakt mit Feuchtigkeit oder Verunreinigung durch Staub 

oder anderen Partikeln kann einen Antigen-Abbau verursachen. Daraus 

resultieren eine schlechte Präzision und potenziell falsche Ergebnisse. 

7.2 TESTDURCHFÜHRUNG 

Alle Reagenzien in der gleichen Reihenfolge pipettieren. 

1. Pipettieren der Kontrollen und Proben 

100µL von jeder Kontrolle und verdünnten (1:100) Proben in das dafür laut 

Plattenschema vorgesehene Well pipettieren. 

Hinweis: Die Proben müssen so schnell wie möglich pipettiert werden, um eine 

‚Assay-Drift’ zu vermeiden; die Inkubationszeit läuft ab Zugabe der letzten 

Probe. 

30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. 

2. Waschen der Platte 

Sorgfältiges Waschen der Wells ist wichtig für eine hohe Präzision und genaue 

Testergebnisse. Bei nicht korrekt gewaschenen Wells können ungenaue 

Ergebnisse mit schlechter Präzision und hohem Hintergrund auftreten. 

Nach der Inkubation die Wells dreimal mit 250-350µL Waschpuffer waschen. 

Das Waschen kann mit einem automatischen Platten-Waschgerät oder 

manuell, wie nachfolgend beschrieben, erfolgen. Nach dem letzten Waschschritt 

die Wells durch leichtes Klopfen auf eine absorbierende Unterlage (z.B. 

Papiertücher) trocknen. 

Manuelles Waschen: 

a. Den Inhalt der Wells in den Ausguss schütten, dabei die 

langen Seiten des Rahmens zusammendrücken. 

b. Die Wells auf einer absorbierenden Unterlage (z.B. 

Papiertücher) leicht ausklopfen. 

c. 250-350µL Waschpuffer in der Arbeitskonzentration mit 

einer Mehrkanalpipette in die Wells pipettieren. 

d. Die Mikrotiterplatte auf einer flachen Unterlage stehend 

leicht schütteln. 

e. Zweimaliges Wiederholen der Schritte a bis d. 

f. Die Wells wie unter a und b entleeren. 

3. Pipettieren des Konjugats 

100µL Konjugat in jedes Well pipettieren. Die Ränder der Wells mit Filterpapier 

abtrocknen, um Spritzer zu entfernen. 

Hinweis: Um Verunreinigungen zu vermeiden, niemals überschüssiges 

Konjugat in die Konjugat-Flasche zurückgeben. 

30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. 

4. Waschen der Platte 

Siehe Abschnitt 2. 

5. Pipettieren von Substrat (TMB) 

Nach dem Waschen 100µL TMB in jedes Well pipettieren. Die Ränder der 

Wells mit Filterpapier abtrocknen, um Spritzer zu entfernen. 

Hinweis: Um Verunreinigungen zu vermeiden, niemals überschüssiges TMB in 

die TMB-Flasche zurückgeben. 

30 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren. 

6. Reaktionsende 

100µL Stopp-Lösung in jedes Well pipettieren. Die Farbe schlägt von blau nach 

gelb um. 

7. Farbmessung 

Die optische Dichte (OD) bei 450nm in jedem Well mit einem Mikrotiterplatten- 

Reader innerhalb von 30 Minuten nach Zugabe der Stopp-Lösung bestimmen. 

8 ERGEBNISSE UND QUALITÄTSKONTROLLE 

1. Qualitätskontrolle 

Nur, wenn alle nachfolgend aufgeführten Kriterien erfüllt sind, ist der Test gültig. 

• Alle angegebenen Kalibratoren sowie die positiven und negativen Kontrollen 

müssen bei jedem Testansatz mitgeführt werden. 

• Alle für die Kontrollen erzielten Ergebnisse müssen in dem angegebenen 

Wertebereich (siehe QC-Zertifikat) liegen. 

• Der Kurvenverlauf der erzielten Kalibrationskurve sollte in etwa dem auf dem 

QC-Zertifikat gezeigen entsprechen. 

Sind die oben aufgeführten Kriterien nicht erfüllt, ist der Test ungültig und 

muss wiederholt werden. 

2. Berechnung der OD-Mittelwerte (Nur bei Doppelbestimmungen) 

Berechnen Sie für jeden Kalibrator, jede Kontrolle und jede Probe den 

Mittelwert aus den beiden OD-Messergebnissen. Der prozentuale Variationskoeffizient 

(VK%) der beiden OD-Messwerte sollte dabei jeweils unter 15% 

liegen. 

3. Erstellung der Kalbrationskurve 

Die Kalibrationskurve kann automatisch oder manuell erstellt werden, indem 

man die Anti-Cardiolipin-Autoantikörper-Konzentrationen (logarithmische Skala) 

halblogarithmisch gegen die zugehörigen OD-Werte der Kalibratoren (lineare 

Skala) aufträgt. 

• Automatisch – verwenden Sie eine geeignete und validierte Software und die 

die Daten am besten widerspiegelnde Kurvenanpassung. 

• Manuell – verwenden Sie halblogarithmisches Millimeterpapier und zeichen Sie 

eine glatte Kurve durch die Punkte (keine Gerade oder Punkt-zu-Punkt- 

Verbindung). 

4. Handhabung abweichender Kalibrationspunkte 

Sollte irgendein Messpunkt nicht auf der Kurve liegen, kann er gestrichen 

werden. Hat diese Streichung allerdings zur Folge, dass der Kurvenverlauf von 

dem im QC-Zertifikat vorgegebenen abweicht, oder müssten mehrere Punkte 

der Kalibration gestrichen werden, sollte die gesamte Kalibration wiederholt 

werden. 

5. Berechnung der Autoantikörper-Konzentrationen in den Kontrollen und 

Proben 

Lesen Sie die Anti-ß2GP1-Autoantikörper-Konzentrationen in den Kontrollen 

und verdünnten Patientenproben direkt aus der Kalibrationskurve ab. Die 

Kontrollwerte sollten in den im QC-Zertifikat vorgegebenen Konzentrationsbereich 

fallen. 

Hinweis: Die Standardprobenverdünnung von 1:100 ist in der Kalibrationskurve 

bereits berücksichtigt. Es sind keine weiteren Korrekturen nötig. 

6. Kalibration des Tests 

Der Test ist gegen einen intenternen Standard kalibriert (in U/mL), da kein 

anerkannter internationaler Standard verfügbar ist. 

7. Grenzen des Tests 

• Die Testergebnisse können nicht als diagnostischer Beweis für das 

Vorhandensein bzw. Nichtvorhandensein einer Krankheit verwendet werden. 

• Falls der Nachweis von ß 2 GP1-Autoantikörpern im Serum trotz klinischer 

Indikationen negativ ausfällt, ist eine Testung auf Anti-Cardiolipin-Antikörper, 

Lupus Antikoagulans oder einen weiteren Test erforderlich. 

• Die Behandlung eines Patienten darf nicht allein aufgrund eines positiven 

ß 2 GP1-Ergebnisses begonnen werden; sie muss auch klinisch indiziert sein. 

9 LEISTUNGSDATEN 

9.1 PRÄZISION 

Die Intra-Assay-Präzision wurde durch eine 20-fache Messung von 6 innerhalb 

der Kalibrationskurve liegenden Proben in einem Assay ermittelt. Die 

Konzentrationen und Variationskoeffizienten (VK%) jeder einzelnen Probe sind 

nachfolgend aufgelistet: 

INTRA-ASSAY PRÄZISION 

n=20 Konzentration (U/mL) VK % 

Probe 1 6,4 5,8 

Probe 2 16,0 2,9 

Probe 3 20,5 2,9 

Probe 4 37,4 4,6 

Probe 5 48,7 3,6 

Probe 6 66,4 4,1 

Für die Bestimmung der Inter-Assay-Präzision wurden sechs Proben in 

Doppelbestimmung in 6 verschiedenen Testansätzen in einem Zeitraum von 3 

Tagen gemessen. Die Konzentrationen und Variationskoeffizienten (VK%) jeder 

einzelnen Probe sind nachfolgend aufgelistet. 

INTER-ASSAY PRÄZISION 

n=6 Konzentration (U/mL VK % 

Probe 1 6,1 10,7 

Probe 2 15,8 3,6 

Probe 3 19,5 5,1 

Probe 4 37,9 4,4 

Probe 5 49,3 3,7 

Probe 6 65,4 2,6 

9.2 NORMALBEREICH 

Die Serumwerte an ß 2 GP1 IgA-Autoantikörpern wurden bei je 100 männlichen und 

100 weiblichen normalen Blutspendern bestimmt; die Ergebnisse sind in der 

nachfolgenden Graphik dargestellt. Basierend auf einem positiven Cut-off-Wert von 

20,0 U/mL waren zwei Proben positiv; dieses positive Ergebnis wurde mit einem 

alternativen anti-ß 2 GP1-IgA-Kit jeweils bestätigt. 

Anzahl an Proben 

120 

100 

80 

60 

40 

20 

0 

20,0 

IgA Anti-ß 2 GP1 U/mL 

Dieser Normalbereich dient nur zur Orientierung. Jedes Labor sollte seine eigenen 

Normalbereiche festlegen. 


9.3 SPEZIFITÄT, SENSITIVITÄT UND ÜBEREINSTIMMUNG 

Die relative Spezifität, Sensitivität und Übereinstimmung wurde im Vergleich zu 

einem alternativen Anti-ß 2 GP1 IgA-Kit anhand von 114 klinischen und normalen 

Proben bestimmt. Diese Proben stammten von 46 SLE-Patienten, die zuvor auf 

Antiphospholipid-Antikörper positiv getestet worden waren, 8 Patienten mit 

primärem Antiphospholipid-Syndrom (APS), 20 RA-Patienten, 20 SLE- 

Patienten mit unbekanntem APS-Status und 20 gesunden Blutspendern. Die 

Bewertung der Proben erfolgte beim BINDAZYME IgA S Assay bei einem 

grenzwertigen „Grauzonenbereich“ von 15-20 U/mL und eines positiven Cut-off- 

Wertes von 20,0 U/mL bzw. dem im Alternativtest angegebenen Cut-off. 

EIA 

BINDAZYME 


Alternativer EIA 

+ *Grenzwertig - 

+ 18 2 1 

Grenzwertig 3 3 3 

- 1^ 5 78 

Relative Sensitivität 94,7% 

Relative Spezifität 98,7% 

Relative Übereinstimmung 98,0% 

*Die im grenzwertigen Konzentrationsbereich liegenden Proben wurden bei der 

Auswertung nicht berücksichtigt 

^Die eine unterschiedlich befundete Probe war bei Testung mit einem weiteren 

Kit negativ. 

9.4 ANALYTISCHE SENSITIVITÄT 

Der Beweis, dass der Anti-ß 2 GP1 IgA S auch noch zwischen zwei Proben mit 

Werten im unteren Messbereich (173 und 199% des niedrigsten Kalibrators) 

unterscheiden kann, wurde durch statistische Analyse (t-Test, Vergleich von 

Mittelwerten aus unabhängigen Stichproben) der Ergebnisse mehrfacher 

Messungen jeder einzelnen Probe erbracht. 

9.5 MESSBEREICH 

Der Messbereich des Kits liegt zwischen 3,7 und 300 U/mL. 

9.6 INTERFERIERENDE SUBSTANZEN 

Anti-ß 2 GP1 IgA negative und positive Seren wurden mit verschiedenen 

interferierenden Substanzen versetzt und anschließend mit diesem Kit 

gemessen. Hierzu wurde ein Interference Check A Plus TM (Kokusai Shiyaku, 

Japan) verwendet. 

Substanz 

Bilirubin F (frei) 

Bilirubin C (konjugiert) 

Hämolysiertes Hämoglobin 

Chylus (Milchsaft) 

Rheumafaktor 

Konzentration 

18,0 mg/dL 

19,3 mg/dL 

482 mg/dL 

1430 FT Units 

50,0 IU/mL 

12 PLATTENSCHEMA 

Siehe Ende der Arbeitsanleitung. 

KURZARBEITSANLEITUNG 

1. 100µL von jeder Kontrolle und 1:100 verdünnten 

Probe in das entsprechende Well pipettieren. 

30 Minuten inkubieren. Waschen. 

2. 100µL Konjugat in jedes Well geben. 

30 Minuten inkubieren. Waschen. 

3. 100µL Substrat in jedes Well geben. 

30 Minuten im Dunkeln inkubieren. 

4. 100µL Stopp-Lösung in jedes Well pipettieren. 

Absorption bei 450nm messen. 

BINDAZYME 

ist ein Warenzeichen von 

The Binding Site Ltd., UK. 


B14 4ZB. England 

Bei keiner der eingesetzten Substanzen wurde ein interferierender Einfluss in 

den getesteten Proben beobachtet. 

10 ERWARTETE WERTE 

Der positive Cut-off-Wert für den Anti-ß 2 GP1 IgA S Assay wurde basierend auf 

den Messergebnissen der Serumproben von 100 männlichen und 100 

weiblichen Blutspendern bei einem grenzwertigen „Grauzonenbereich“ von 15,0 

- 20,0 U/mL mit 20,0 U/mL festgelegt. Diese Bereiche dienen nur zur 

Orientierung. ELISAs sind sehr sensitive Tests, die kleinste Unterschiede in 

Probenpopulationen erkennen können. 

11 REFERENZEN 

IgA Anti-ß 2 GP1 

< 15,0 U/mL Negativ 

15,0 - 20,0 U/mL Grenzwertig 

> 20,0 U/mL Positiv 










Sci USA; 87:4120-4124. 





Acta; 884: 142-149. 




7. Matsuura E, Igarashi Y Yasuda T, et al. (1994). Anticardiolipin antibodies 








INSTRUCTIONS D’UTILISATION 

Coffret BINDAZYME S de dosage des 

anticorps humains Anti β 2 GP1 IgA S 

MK141 

Pour un usage en diagnostic in-vitro 

Produits fabriqués par: 

The Binding Site Ltd, PO Box 11712, Birmingham B14 4ZB, UK 


Distribués en France par la société : 

The Binding Site, 14 rue des Glairaux, BP226, 38522 Saint-Egrève Cedex. 

Téléphone : 04.38.02.19.19 

Fax : 04.38.02.19.20 

e-mail: info@bindingsite.fr 

1 INDICATIONS 

Ce coffret permet de mesurer in vitro les autoanticorps IgA spécifiques dirigés 

contre la ß 2 -glycoproteine 1 (ß 2 GP1) du sérum humain. Ce coffret doit être 

utilisé en conjonction avec d’autres tests sérologiques et informations cliniques 

pour aider au diagnostic chez les patients présentant par exemple un risque 

thrombotique; syndrome primaires des antiphospholipides (SAPL) ou consécutif 

à un lupus érythémateux disséminé (LED). 

Ce coffret permet de tester au maximum 41 échantillons en double ou 89 en 

simple, avec une courbe de calibration, un contrôle positif, un contrôle négatif. 

2 PRESENTATION GENERALE 

Le SAPL est caractérisé par des symptômes tels que des thromboses 

artérielles et veineuses et/ou des morts fœtales récurrentes en association 

avec la présence d’anticorps antiphospholipides (aPL) 1 . Les aPL comprennent 

toute une gamme d’autoanticorps qui se fixent aux cardiolipides seuls, aux 

cardiolipides complexés à un cofacteur et au cofacteur seul. Ce cofacteur a été 

identifié comme étant une protéine plasmatique de 50kD, la β 2 GP1 

(apolipoprotéine H) 2,3 . La β 2 GP1 inhibe la voie intrinsèque de la coagulation 4 , se 

fixe aux plaquettes 5 et inhibe l’agrégation des plaquettes médiées par les ADP 6 . 

Les autoanticorps anticardiolipides des patients atteints de LED et de SAPL 

primaire se fixent à une forme altérée de la β 2 GP1 produite par l’interaction 

avec des phospholipides 7 chargés négativement. Cette β 2 GP1 modifiée peut 

être reproduite en fixant de la β 2 GP1 directement dans les plaques de 

polystyrène 7 , lorsque le regroupement ou la forte densité de l’antigène permet 

un accrochage des autoanticorps bi ou polyvalent et la détection par des 

méthodes ELISA. Eliminer les phospholipides et utiliser uniquement la β 2 GP1 

sous ce format permet d’avoir un test avec une spécificité accrue pour le SAPL 

du fait de leur prédominance chez les patients atteints de le SAPL 8 . 

Récemment, les IgG et les IgM anti-β 2 GP1 ont été inclus dans les critères 

d’identification de le SAPL, quand ceux-ci sont présents à un taux suffisamment 

élevé 1 . Il a aussi été admis que les IgA anti-β 2 GP1 sont les anticorps spécifiques 

les plus fréquemment detéctés chez les patients de certains groupes ethniques 1 . 

3 PRINCIPE DU TEST 

Les micropuits sont recouverts de l’antigène ß 2 GP1. Les contrôles et les 

échantillons dilués sont déposés dans les puits permettant ainsi la liaison 

spécifique de l’anticorps à l’antigène fixé ß 2 GP1 pendant la première 

incubation. Après avoir rincé les puits pour éliminer toutes traces de protéines 

non accrochées, un anticorps de lapin anti IgG (spécifique de la chaîne γ) 

humain purifié par affinité et conjugué à la péroxydase est déposé. Le conjugué 

se fixe aux autoanticorps humains capturés puis l’excès de conjugué non fixé 

est éliminé par une étape de lavage supplémentaire. Le conjugué fixé sera 

visualisé lors de l’ajout du substrat 3,3’,5,5’ tetramethylbenzidine (TMB) qui 

donne une coloration bleue après réaction, l’intensité de celle-ci est 

proportionnelle à la concentration en autoanticorps de l’échantillon. De l’acide 

phosphorique est ajouté dans chaque puits pour stopper la réaction. Cela 

produit une couleur finale jaune, qui sera lue à 450nm. 

4 PRECAUTIONS 

4.1 AVERTISSEMENTS 

• Tous les sérums des donneurs humains ont subi un dépistage négatif pour les 

anticorps anti-VIH 1 et 2, les anticorps anti-VHC et l’Ag HBs. Toutefois, ces tests 

ne peuvent garantir une absence totale d’agents infectieux. De bonnes méthodes 

de manipulation et d’élimination doivent être établies et seul un personnel qualifié 

dans la manipulation d’échantillons potentiellement infectieux devrait être 

autorisé à utiliser ce coffret. 

• L’azide de sodium peut réagir avec les tuyauteries en plomb ou cuivre et former 

des azides de métaux explosifs. Il est nécessaire d’ajouter de grands volumes 

d’eau pour éviter la formation d’azides. 

• Les tampons et sérums fournis dans ce coffret contiennent plusieurs inhibiteurs 

d’enzymes listés ci-dessous. Les manipuler avec précautions. 

INHIBITEURS 

CONCENTRATION 

Kathon 

Sodium Azide 

ProClin 300 

Bromonitrodioxane 

Methylisothiazone 

0.02% 

0.099% 

0.045% 

0.002% 

0.002% 

ProClin est une marque déposée de Rohm and Haas Corp. Philadelphia, PA 

• Le kathon est un irritant et peut induire une sensibilisation en cas de contact 

avec la peau. 

• La solution d’arrêt contient de l’acide phosphorique 3M qui est un irritant. Eviter 

le contact avec la peau et les yeux. 

• Les éclaboussures de réactifs doivent être nettoyées en respectant la 

réglementation légale et environnementale. 

4.2 PRECAUTIONS 

• Ce coffret doit être utilisé par un personnel formé. 

• Il est recommandé de suivre scrupuleusement le protocole. Toute déviation par 

rapport à celui-ci peut affecter les performances et les résultats obtenus. Lire 

attentivement les ‘Notes’ et les avertissements dans cette fiche technique. 

• Les réactifs et les plaques des coffrets ayant des numéros différents ne sont 

pas interchangeables. La substitution d’un des réactifs peut induire des 

résultats incorrects. Toutes les barrettes doivent être issues du même sachet. 

• Afin d’éviter la contamination des réactifs, utiliser uniquement de nouveaux 

récipients ou des récipients propres en verre ou en plastique. Ne jamais 

remettre les réactifs non utilisés dans leur flacon d’origine. 

• Eviter de laisser les flacons ouverts; l’évaporation ou la contamination des 

réactifs peut induire des résultats incorrects. 

• Le substrat TMB ne doit pas être exposé à la lumière ou mis en contact avec de 

l’eau. 

• Les échantillons hémolysés, lipidiques, contaminés par des bactéries ou 

contenant des particules de matières ne doivent pas être utilisés. 

• Les dilutions des échantillons ne peuvent pas être vérifiées car les contrôles du 

coffret sont prêts à l’emploi. L’utilisation de pipettes calibrées et de contrôles 

qualité internes est recommandée. 

• L’utilisation d’automates, de diluteurs et d’autres équipements automatiques peut 

induire des différences de résultats par rapport à la technique manuelle. Il est de 

la responsabilité de chaque laboratoire de valider complètement le système et de 

s’assurer que les résultats sont conformes à la fiche technique et au certificat de 

contrôle qualité. 

• Tous les équipements doivent être calibrés et suivis selon les recommandations 

du fournisseur. 

4.3 STOCKAGE ET STABILITE 

• Ce coffret doit être conservé à 2-8°C et ne doit pas être congelé. Des 

températures de conservation inappropriées peuvent affecter les résultats. 

• Le tampon de lavage dilué dans un récipient propre peut être conservé à 

température ambiante (20-24°C) pendant 4 semaines. 

• La date de péremption du coffret se trouve sur l’étiquette extérieure 

5 ECHANTILLONS 

• Les échantillons doivent être prélevés par ponction veineuse et le sérum doit 

être séparé après coagulation. 

• Les sérums peuvent être conservés à 2-8°C jusqu’à 7 jours avant les tests 9 , ou 

aliquotés et congelés à -20°C pour une conservation prolongée. 

• Des congélations et décongélations répétées doivent être évitées. 

• Les sérums ne doivent pas être inactivés par la chaleur, ceci peut induire de 

faux positifs. 

6 MATERIEL 

6.3 MATERIEL FOURNI 

Chaque coffret contient les produits spécifiques ci-dessous: 

• Une fiche technique : donnant tous les détails de la technique. 

• Un certificat de contrôle qualité : indiquant les performances attendues du 

lot. 

• ß 2 GP1 S Coated Wells (puits) : 12 barrettes de 8 puits sécables coatés avec 

de l’antigène β 2 GP1. Chaque plaque est emballée dans un étui contenant deux 

dessiccateurs. 

• APS Sample Diluent (diluant échantillon pour SAPL) : 2 flacons contenant 

50mL de tampon pour diluer les échantillons. Coloré en jaune et prêt à l’emploi. 

• APS Wash Buffer (Tampon de lavage pour SAPL) : 1 flacon contenant 50mL 

de tampon concentré 20 fois pour le lavage des puits. 

• β 2 GP1 IgA S Calibrators (Calibrateurs β 2 GP1 IgG S) : 5 flacons, chacun 

contenant 1.2mL de sérum humain dilué avec les concentrations en autoanticorps 

anti-β 2 GP1 suivantes: 300; 100; 33,3; 11,1; 3,7 U/mL. Prêts à 

l’emploi. 

• β 2 GP1 IgA S Positive Control (Contrôle Positif β 2 GP1 IgA S) : 1 flacon 

contenant 1.2mL de sérum humain dilué. La valeur attendue est inscrite sur le 

certificat de contrôle qualité. Prêt à l’emploi. 

• β 2 GP1 S Negative Control (Contrôle Négatif): 1 flacon de contenant 1.2ml de 

sérum humain dilué. La valeur attendue est inscrite sur le certificat de contrôle 

qualité. Prêt à l’emploi. 

• β 2 GP1 IgA S Conjugate (Conjugué β 2 GP1 IgA S) : 1 flacon contenant 12mL 

d’anticorps marqué à la péroxidase purifié. Coloré en vert. Prêt à l’emploi. 

• TMB Substrate (Substrat TMB) : 1 flacon contenant 14mL de substrat TMB. 

Prêt à l’emploi. 

• Stop Solution (Solution d’arrêt) : 1 flacon contenant 14mL d’acide phosphorique 

3M. Prêt à l’emploi. 

6.2 MATERIEL NECESSAIRE - non fourni 

• Laveur automatique de plaque : recommandé, cependant les lavages 

manuels sont également possibles. 

• Lecteur de microplaques : capable de mesurer la densité optique à 450nm. 

• Eau distillée ou eau désionisée : elle doit être de très bonne qualité. 

• Micropipettes calibrées : pour la distribution de volumes de 1000, 100 et 10µL. 

• Pipette multicanaux : recommandée pour la distribution de volumes de 100µL 

de conjugué, de substrat et de solution d’arrêt. 

• Tubes en verre ou plastique : pour la dilution des échantillons. 

7 PROCEDURE 

7.1 ETAPES PREALABLES 

1. Ramener le coffret à température ambiante 

• Le coffret est opérationnel à température ambiante (20-24°C). 

• Sortir le coffret et le ramener à température ambiante pendant approximativement 

60 minutes. Ne pas retirer les puits de leur sachet aluminium durant cette 

période. Attendre que les barrettes soient à température ambiante. 

Note : Le coffret peut être maintenu à température ambiante au plus 1 

semaine. 

2. Composants du coffret 

Mélanger doucement chaque composant du coffret avant utilisation. 

3. Tampon de lavage 

Ajouter 50mL de tampon de lavage concentré à 950mL d’eau distillée (dilution 


au 1/20) et mélanger. De plus petits volumes peuvent être dilués si nécessaire. 

Note: Le tampon de lavage dilué peut être conservé à température ambiante 

jusqu’à 4 semaines, cependant il est recommandé de diluer uniquement la 

quantité appropriée. 

4. Dilution de l’échantillon 

Diluer 10µL de chaque échantillon avec 1000µL de diluant échantillon (1/100) 

et mélanger bien. 

Note : Les échantillons dilués doivent être utilisés dans les huit heures. 

5. Manipulation des barrettes et du support 

Placer le nombre de puits requis sur le support de la position A1 en remplissant 

les colonnes de gauche à droite. Manipuler la plaque par les bords longs du 

support de plaque afin d’empêcher les puits de tomber. 

Note : Remettre immédiatement les puits non utilisés dans leur emballage 

aluminium avec les deux dessiccateurs et refermer soigneusement afin de 

minimiser l’exposition à l’humidité. 

Faire attention à ne pas percer ou déchirer le sachet, cf. ci-dessous. 

ATTENTION: L’exposition des puits à l’humidité, à la poussière ou à des 

particules de matière peut induire une dégradation de l’antigène 

conduisant à une mauvaise précision et à des résultats potentiellement 

faux. 

7.2 METHODE DE TEST 

Maintenir la même séquence tout au long du test. 

2. Dépôt des échantillons 

Déposer 100µL de chaque contrôle et échantillon dilué (1:100) dans les puits 

appropriés de la plaque fournie. 

Note : Les échantillons doivent être déposés sur la plaque aussi rapidement 

que possible afin de minimiser les écarts. Le décompte du temps doit 

commencer après l’addition du dernier échantillon. 

Incuber à température ambiante pendant 30 minutes. 

2. Lavage 

La procédure de lavage est très importante et requiert une attention spéciale. 

Une plaque mal lavée peut donner de mauvais résultats avec une mauvaise 

précision et du bruit de fond. 

Après l’incubation, vider la plaque et laver 3 fois les puits avec 250 à 350 µL de 

tampon de lavage par puits. Laver la plaque manuellement ou avec un lecteur 

de plaque automatique comme indiqué ci-dessous. Après le lavage final, 

renverser la plaque et taper les puits sur du papier absorbant. 

Les plaques peuvent être lavées manuellement comme indiqué cidessous 

: 

a. Vider le contenu de la plaque dans un réservoir. 

b. Taper les puits sur du papier absorbant. 

c. Remplir chaque puits avec 250 à 350µL de tampon de lavage en 

utilisant une pipette multicanaux. 

d. Agiter doucement la plaque. 

e. Répéter 2 fois les étapes a à d. 

f. Répéter les étapes a et b. 

3. Dépôt du conjugué 

Déposer 100µL de conjugué par puits. Enlever les éclaboussures autour des 

puits à l’aide d’un tissu. 

Note: Afin d’éviter les contaminations, ne jamais remettre l’excès de conjugué 

dans le flacon d’origine. 

Incuber à température ambiante pendant 30 minutes. 

4. Lavage 

Répéter l’étape 2. 

5. Dépôt du substrat (TMB) 

Déposer 100µL de substrat TMB dans chaque puits. Enlever les éclaboussures 

autour des puits à l’aide d’un tissu. 

Note: Afin d’éviter les contaminations, ne jamais remettre l’excès de TMB dans 

le flacon d’origine. 

Incuber à température ambiante dans l’obscurité pendant 30 minutes. 

6. Solution d’arrêt 

Déposer 100µL de solution d’arrêt dans chaque puits. Ceci induit un 

changement de couleur du bleu au jaune. 

7. Mesure de la densité optique 

Lire la densité optique (DO) de chaque puits à 450nm avec un lecteur de 

microplaques dans les 30 minutes suivant l’arrêt de la réaction. 

8 RESULTATS ET CONTRÔLE DE QUALITE 

1. Contrôle de Qualité 

Afin de valider le test, tous les critères suivants doivent être respectés : 

• Tous les calibrateurs, les contrôles positif et négatig spécifiques doivent être 

inclus dans chaque test. 

• Les valeurs obtenues pour les contrôles doivent être dans la gamme spécifiée 

sur le certificat de contrôle de qualité. 

• L’allure de la courbe doit être similaire à l’allure de la courbe de calibration se 

trouvant sur le certificat de contrôle qualité. 

Si les critères ci-dessus ne sont pas respectés, le test est invalide et doit 

être répété. 

2. Calcul de la moyenne des densités optiques (pour les tests lancés en 

duplicats) 

Pour chaque calibrateur, les contrôles et les échantillons, calculer la moyenne 

des DO obtenues. Le pourcentage du coefficient de variation (% C.V.) pour 

chaque duplicats doit être inférieur à 15%. 

3. Réalisation de la courbe de calibration 

La courbe de calibration peut être tracée automatiquement ou manuellement en 

reportant la concentration des autoanticorps anti-β 2 GP1 en abscisse avec une 

échelle logarithmique et la DO de chaque calibrateur en ordonnée: 

• Automatiquement - utiliser le logiciel approprié et l’allure de la courbe qui 

correspond le mieux aux données. 

• Manuellement - utiliser du papier grphique millimétré logarithmique, dessiner 

une courbe reliant les points (pas une ligne droite). 

4. Traitement des points anormaux 

Si un point ne se trouve pas sur la courbe, il peur être enlevé. Une fois ce point 

enlevé, le test devra être refait si l’aspect de la courbe obtenue est différent de 

celui de la courbe de calibration donnée sur le certificat de contrôle qualité, ou 

si plus d’un point deviennent anormaux. 

5. Calcul du taux d’autoanticorps dans les échantillons et les contôles 

Lire le taux d’autoanticorps anti-β 2 GP1 dans les échantillons dilués et les 

contrôles directement à partir de la courbe de calibration. Les valeurs des 

contrôles doivent être comprises dans les gammes données sur le certificat de 

contrôle qualité. 

Note : Les valeurs des calibrateurs doivent être ajustées par un facteur 100 

pour prendre en compte la dilution au 1 : 100 de l’échantillon. 

6. Calibration du test 

Ce test est calibré en U/Ml contre un calibratuer référence interne arbitraire, 

etétn donné qu’aucun standard internantional n’est disponible actuellement. 

7. Limites 

• Les résultats obtenus avec ces coffrets ne sont pas une preuve diagnostique de 

la présence ou de l’absence de maladies. 

• Lorsque les résultats sont négatifs et que des indications cliniques sont 

fournies, un test anti-cardiolipides, anticoagulant de type lupique ou un test 

suplémentaire devra être réalisé. 

• Le traitement d’un patient ne doit pas être réalisé sur la seule base d’un résultat 

anti-β 2 GP1 positif. D’autres données cliniques doivent être présentes. 

9 PERFORMANCES ET CHARACTERISTIQUES 

9.1 PRECISION 

La précision intra-essai a été mesurée en utilisant 6 échantillons testés 20 fois 

dans le même test. La concentration et le pourcentage de Coefficient de 

Variation (C.V.) pour chaque échantillon sont donnés ci-dessous : 

PRECISION INTRA-ESSAI 


Echantillon 1 6,4 5,8 






La précision inter-essai a été mesurée en utilisant six échantillons testés en 

duplicats six fois de suite sur trois jours. La concentration et le %CV de chaque 

échantillon sont indiqués ci-dessous. 

PRECISION INTER-ESSAI 








9.2 GAMME NORMALE 

Les taux d’auto-anticorps anti- ß 2 GP1 ont été mesurés dans le sérum de 100 

hommes et 100 femmes normaux. Les résultats obtenus sont montrés dans le 

graphique ci-dessous. En se basant sur un cut-off de 20,0 U/mL, des deux 

échantillons positifs ont été confirmés en utilisant un coffret anti-β 2 GP1 IgA 

alternatif d’une autre fabricant. 

Nombre d’échantillons 

120 

100 

80 

60 

40 

20 

0 

Cette gamme normale est fournie à titre indicatif. IL est fortement recommandé 

à chaque laboratoire d’établir sa propore gamme normale. 

9.3 SPECIFICITE, SENSIBILITE, CORRELATION 

La spécificité relative, la sensibilité et la correlation ont été déterminées contre 

un autre coffret de dosage d’IgA anti-β 2 GP1 en utilisant 114 échantillons 

cliniques et normaux. Ces échantillons provenaient de 46 patients atteints de 

LED auparavant testés positifs pour les anticorps anti-phospholipides; 8 

patients atteints du Syndrome primaire des antiphospholipides; 20 patients 

atteints d’Arthrite Rhumatoïde; 20 patients atteints de LED et de statut inconnu 

pour le SAPL et 20 sérums normaux issus d’adultes sains. Le statut des 

échantillons a été determiné en appliquant un cut-off positif de 20.0 U/mL avec 

une zone douteuse de 15-20 U/mL pour le coffret BINDAZYME IgA S et le 

coffret alternatif. 

Coffret EIA Alternatif 

EIA 

BINDAZYME 


20.0 

IgA Anti-B2GP1 U/mL 

+ *Douteux - 

+ 18 2 1 

Douteux 3 3 3 

- 1^ 5 78 

Sensibilité Relative 94,7% 

Spécificité Relative 98,7% 

Corrélation Relative 98,0% 

* Les échantillons douteux ont été exclus de l’analyse. 

^ Ces échantillons ont tous été testés négatifs avec un autre coffret. 


9.4 SENSIBILITE ANALYTIQUE 

La confirmation que le test anti-β 2 GP1 IgA S permet de faire la distinction entre 

deux échantillons avec des valeurs proches de la limite haute de la gamme de 

mesure (173 et 199% du calibrateur le plus faible) a été obtenue par analyse 

statistique (Student’s t-test) des résultats obtenus après le test de plusieurs 

replicats de chaque échantillon. 

9.5 GAMME DE MESURE 

La gamme de mesure de ce test est 3,7-300U/mL. 

9.6 SUBSTANCES INTERFERANTES 

Une gamme de substances interférentes a été mise en évidence dans le 

dépistage des anticorps anti-ß 2 GP IgA sur des échantillons positifs et négatifs, 

qui ont été testés les uns après les autres. La méthode utilisée pour vérifier 

l’effet de ces substances est le coffret Interference Check A plus de Kokusai, 

Shiyaku, Japon. 

Substance 

Concentration 

Bilirubine F (libre) 

18,0mg/dL 

Bilirubine C (conjuguée) 

19,3mg/dL 

Hémoglobine hémolysée 

482mg/dL 

Chyle 

1430FT Units 

Facteur Rhumatoïde 

50,0 IU/mL 

Aucune interférence n’a été observée dans les échantillons testés. 

10 RESULTATS ET INTERPRETATION 

Le cut-off positif du test de 100 sérums normaux d’homme et de 100 sérums 

normaux de femmes a été déterminé à 20,0 U/mL avec une zone douteuse de 

0,65-0,90µg/mL pour le test anti-β 2 GP1 IgA S. Ces gammes sont fournies à titre 

indicatif. Les tests ELISA sont très sensibles et permettent la détection de 

petites différences dans des populations de sérums 

11 REFERENCES 

IgA anti-β 2 GP1 

< 15,0 U/mL Résultat négatif 

15,0-20,0 U/mL Douteux 

>20,0 U/mL Résultat positif 










Sci USA; 87:4120-4124. 





Acta; 884: 142-149. 











12 PLAN DE PLAQUE 

Veuillez regarder au dos de la Fiche Technique 

Résumé de la procédure 

1. Déposer 100µL de chaque contrôle et de chaque échantillon dilué au 

1/100 dans le puits approprié. 

Incuber 30 minutes. 

Laver 

2. Ajouter 100µL de conjugué à chaque puits 


Laver 

3. Ajouter 100µL de Substrat à chaque puits 


4. Ajouter de solution stop à chaque puits. 

Lire l’absorbance à 450nm. 

BINDAZYME est une marque de 



B14 4ZB England 


INSTRUCCIONES DE USO 

Anti-β 2 GP1 IgA S Humana BINDAZYME TM 

Kit Enzimoinmunoensayo 

MK141 

Kit para diagnóstico in vitro únicamente 

Producto fabricado por: 

The Binding Site Ltd, PO Box 11712, Birmingham B14 4ZB, U.K. 


1 UTILIZACIÓN 

The Binding Site sucursal en España, 

C/ Balmes 243 4º 3ª, 08006 Barcelona 

Teléfono 902027750 

Fax: 902027752 

e-mail: info@bindingsite.es 

web: www.bindingsite.es 

Spanish 

Este kit está preparado para la medida in vitro de anticuerpos anti-β 2 - 

glicoproteína 1 IgA (β 2 GP1) en suero humano. Puede utilizarse junto a otros 

ensayos de laboratorio e información clínica como ayuda en el diagnóstico 

pacientes en riesgo de trombosis, por ejemplo pacientes con síndrome antifosfolípido 

primario (SAF) o SAF secundario a lupus eritematoso sistémico 

(LES). 

Se suministra material suficiente para analizar un máximo de 41 muestras en 

duplicado o bien 89 en un único ensayo, con una curva de calibración y 

controles positivo y negativo. 

2 GENERALIDADES 

El SAF se caracteriza por el síndrome clínico de trombosis arterial y venosa y/o 

morbilidad neonatal recurrente en asociación con la presencia de anticuerpos 

anti-fosfolípido (aPL) 1 . aPL incluyen un rango de autoanticuerpos que se unen 

a cardiolipina sola, a cardiolipina unida a cofactor y a cofactor solo. Este 

cofactor ha sido identificado como la proteína plasmática de 50kD β 2 GP1 

(apolipoproteína H) 2,3 . La β 2 GP1 inhibe la vía de coagulación intrínseca 4 , se 

une a las plaquetas 5 e inhibe la agregación de plaquetas mediada por ADP 6 . 

Los autoanticuerpos anti-cardiolipina de pacientes con SLE y SAF primaria se 

unen a una forma alterada de β 2 GP1 producida por la interacción con 

fosfolípidos cargados negativamente 7 . Esta β 2 GP1 modificada puede 

reproducirse mediante la unión de β 2 GP1 directamente a microplacas de 

poliestireno 7 , donde el acumulo o alta densidad de antígeno permite la unión bio 

multivalente de autoanticuerpos y su detección posterior por métodos ELISA. 

La eliminación del fosfolípido y la utilización de únicamente β 2 GP1 hace de este 

kit un ensayo con una especificidad mejorada para SAF dada su 

predominancia como el autoanticuerpo principal en el suero de pacientes SAF 8 . 

Recientemente se han incluido los ensayos anti-β 2 GP1 IgG e IgM como 

criterios de laboratorio para SAF cuando se encuentran presentes en un nivel 

suficientemente elevado, y el mismo comité concluyó que los anticuerpos antiβ 

2 GP1 IgA son los anticuerpos que se detectan con mayor frecuencia en 

pacientes de grupos étnicos específicos 1 . 

3 PRINCIPIO DEL MÉTODO 

Los pocillos se encuentran sensibilizados con β 2 -glicoproteína 1 (β 2 GP1) 

humana. Los calibradores, controles y muestras diluidas de pacientes se 

añaden a los pocillos y los autoanticuerpos que reconocen la β 2 GP1 se unen 

durante la primera incubación. Tras el lavado de los pocillos para eliminar las 

proteínas no unidas, se añade un conjugado de conejo purificado anti-IgA 

(específico de cadena α) humana marcado con peroxidasa. El conjugado se 

une al anticuerpo humano capturado y el exceso de conjugado no unido se 

elimina mediante un lavado posterior. El conjugado unido se visualiza con el 

sustrato 3,3’,5,5’ tetrametilbenzidina (TMB) que da un producto de color azul 

cuya intensidad es proporcional a la concentración de anticuerpo en la 

muestra. Se añade ácido fosfórico a cada pocillo para parar la reacción, lo que 

produce un color amarillo final que se lee a 450nm. 

4 PRECAUCIONES 

4.1 AVISOS 

• Todos los donantes de suero humano suministrado en este kit han sido 

analizados para la presencia de HBsAg, HIV1 y HIV2 y HCV, con resultados 

negativos. De todos modos dichos ensayos no pueden asegurar la ausencia de 

dichos agentes infecciosos, por tanto deben establecerse procedimientos 

adecuados para la manipulación y eliminación de material potencialmente 

infeccioso, y únicamente personal con entrenamiento adecuado debe llevar a 

cabo dichos procedimientos. 

• La azida sódica puede provocar la formación de azidas explosivas en contacto 

con el cobre y plomo de los desagües. Al eliminar los reactivos dejar correr 

abundantes cantidades de agua para evitar la formación de dichos compuestos. 

• Los tampones y suero suministrado con este kit contienen diversos inhibidores 

enzimáticos, como se indica a continuación. Deben manipularse con precaución. 

INHIBIDOR 

CONCENTRACIÓN 

Kathon 

Azida sódica 

ProClin 300 

Bromonitrodioxano 

Metilisotiazona 

0.02% 

0.099% 

0.045% 

0.002% 

0.002% 

ProClin es marca registrada de Rohm and Haas Corp. Philadelphia, PA 

• Kathon es irritante y puede causar sensibilización por contacto con la piel. 

• La solución de parada contiene ácido fosfórico 3M, que es irritante. Evite el 

contacto con la piel y los ojos. 

• Derrames de reactivo deben limpiarse adecuadamente, según las normativas 

locales y medioambientales. 

4.2 ADVERTENCIAS 

• Este producto debe ser utilizado únicamente por personas correctamente 

entrenadas. 

• Se recomienda seguir el protocolo de forma estricta. Cualquier desviación puede 

afectar a la funcionalidad de este ensayo y a los resultados obtenidos. Ponga 

especial atención a los avisos y “Notas” que encontrará en estas instrucciones 

de uso. 

• No se pueden intercambiar calibradores, controles, conjugados y microplacas de 

distintos lotes. La sustitución de cualquier componente por otro con un número 

de lote distinto al incluido en el kit puede conducir a resultados erróneos. Deben 

tomarse todas las tiras del mismo envoltorio. 

• Para evitar la contaminación de los reactivos utilice únicamente material plástico 

o de vidrio limpio. Nunca devuelva reactivos no utilizados a los viales. 

• No deje viales de reactivo abiertos; cualquier posible contaminación o 

evaporación dará resultados inconsistentes. 

• El sustrato TMB no debe exponerse a la luz o al agua. 

• No deben ser utilizadas muestras hemolizadas, lipémicas, con material 

particulado o contaminación microbiana. 

• No se puede comprobar una posible dilución de muestra incorrecta ya que los 

controles están listos para su uso. Se recomienda la utilización de pipetas 

calibradas y muestras CQ internas apropiadas. 

• La utilización de sistemas automáticos, dilutores de muestra u otro equipo 

automatizado puede llevar a diferencias en los resultados cuando se compara 

con el procedimiento manual. Cada laboratorio es responsable de validar el 

sistema completo y asegurar que los resultados entran dentro de los límites 

indicados en esta hoja de instrucciones y el certificado QC asociado. 

• Todo el equipamiento ha de ser calibrado y mantenido según las instrucciones 

del fabricante. 

4.3 CONSERVACIÓN Y ESTABILIDAD 

• El kit debe conservarse a 2-8ºC y no debe congelarse. Temperaturas de 

conservación no adecuadas afectarán a los resultados. 

• El tampón de lavado diluido en una botella limpia puede conservarse a 

temperatura ambiente (20-24ºC) durante un máximo de 4 semanas. 

• La fecha de caducidad de este kit se muestra en la etiqueta exterior. 

5 OBTENCIÓN Y CONSERVACIÓN DE LAS MUESTRAS 

• Las muestras de sangre se han de obtener por punción en vena, dejar que 

coagule de modo natural y separar el suero. 

• El suero puede conservarse a 2-8ºC hasta 7 días antes del ensayo 9 , o para 

periodos superiores, ha de alicuotarse y conservarse a -20ºC. 

• Evitar congelaciones y descongelaciones repetidas. 

• Las muestras de suero no deben ser inactivadas por calor ya que esto puede 

ocasionar resultados falsos positivos. 

6 MATERIALES 

6.1 MATERIAL SUMINISTRADO 

• Hoja de instrucciones: Indica todos los detalles del ensayo. 

• Certificado QC: Indica la funcionalidad esperada del lote. 

• β 2 GP1 S Coated Wells (Pocillos sensibilizados con β2GP1 S): 12 tiras de 8 

pocillos separables, sensibilizados con β2GP1 humana. La placa se suministra 

en una bolsa que puede volver a cerrarse y que contiene dos bolsas de 

desecante. 

• APS Sample Diluent (Diluyente de muestra SAF): 2 botellas con 50mL de 

tampón para dilución de la muestra. Listo para uso. Coloreado en amarillo. 

• APS Wash Buffer (20x Concentrate) (Tampón de lavado SAF (concentrado 

20x): 1 botella con 50mL de tampón concentrado 20 veces para el lavado de 

los pocillos. 

• β 2 GP1 IgA S Calibrators (Calibradores de β2GP1 IgA S): 5 viales cada uno 

con 1.2mL de suero humano diluido, con las siguientes concentraciones de 

autoanticuerpo anti-β2GP1: 300, 100, 33.3, 11.1, 3.7 U/mL. Listo para uso. 

• β 2 GP1 IgA S Positive Control (Control positivo β2GP1 IgA S): 1 vial con 

1.2mL de suero humano diluido. El valor esperado se indica en el certificado 

QC. Listo para uso. 

• β 2 GP1 S Negative Control (Control negativo β2GP1 S): 1 vial con 1.2mL de 

suero humano diluido. El valor esperado se indica en el certificado QC. Listo 

para uso. 

• β 2 GP1 IgA S Conjugate (Conjugado β2GP1 IgA S): 1 vial con 12 mL de 

anticuerpo humano purificado marcado con peroxidasa. Color verde. Listo para 

uso. 

• TMB Substrate (SustratoTMB): 1 botella con 14mL de sustrato TMB. Listo 

para uso. 

• Stop Solution (Solución de parada): 1 botella con 14 mL de ácido fosfórico 

3M. Listo para uso. 

6.2 MATERIAL ADICIONAL Y EQUIPO NO SUMINISTRADO 

• Lavador automático de microplacas: Su uso es recomendable, aunque las 

placas pueden lavarse manualmente. 

• Lector de microplacas: Capaz de medir densidades ópticas a 450nm en 

referencia al aire. 

• Agua destilada o desionizada: Ha de ser de la calidad más alta disponible. 

• Micropipetas calibradas: Para dispensar 1000, 100 y 10µL. 

• Pipeta multicanal: Recomendada para dispensar volúmenes de 100µL de 

conjugado, solución sustrato y solución de parada. 

• Tubos de vidrio/plástico: Para dilución de la muestra. 

7 METODOLOGÍA DE ENSAYO 

7.1 PASOS PRE-ENSAYO 

1. Lleve el kit a temperatura ambiente 

• Los kits están diseñados para su uso a temperatura ambiente (20-24°C). 

• Retire el kit de la cámara frigorífica y déjelo a temperatura ambiente durante 

aproximadamente 60 minutos. Los pocillos no deben sacarse de su envoltorio 

hasta que hayan alcanzado la temperatura ambiente. 

Nota: los kits pueden mantenerse a temperatura ambiente hasta una semana. 


2. Componentes del kit 

Mezcle cuidadosamente cada componente del kit antes de su uso. 

3. Dilución del tampón de lavado 

Añada 50mL del tampón de lavado concentrado a 950mL de agua destilada 

(dilución 1/20) en un recipiente limpio y mezcle. Pueden prepararse volúmenes 

más pequeños diluyendo adecuadamente. 

Nota: El tampón de lavado diluido puede conservarse a temperatura ambiente 

hasta 4 semanas, por tanto diluya únicamente la cantidad necesaria. 

4. Dilución de la muestra 

Diluya 10µL de cada muestra con 1000µL de diluyente de muestra (1:100) y 

mezcle bien. 

Nota: La muestra diluida debe utilizarse dentro de las 8 horas siguientes a la 

dilución. 

5. Manipulación de tira y marco 

Coloque el número de pocillos necesarios en el soporte de las tiras. Posicione 

a partir del pocillo A1, rellenando las columnas de izquierda a derecha a través 

de la placa. Cuando manipule la placa, apriete los largos bordes del marco 

para evitar que los pocillos caigan fuera. 

Nota: Vuelva a colocar inmediatamente los pocillos no utilizados en su 

envoltorio junto a las dos bolsitas de desecante, y séllelo fuertemente para 

minimizar su exposición a la humedad. 

Tenga cuidado de no perforar o rasgar el envoltorio, ver más abajo. 

ATENCIÓN: La exposición de los pocillos a la humedad o a 

contaminación por polvo u otro material particulado provocará la 

degradación del antígeno, dando como resultado una pobre precisión del 

método y potencialmente resultados falsos. 

7.2 METODOLOGÍA DE ENSAYO 

Mantenga la misma secuencia de dispensación durante todo el proceso. 

1. Adición de la muestra 

Dispense 100µL de cada calibrador, control y muestra diluida (1:100) en los 

pocillos adecuados de la placa. 

Nota: Las muestras deben añadirse lo más rápidamente posible a la placa para 

minimizar la deriva del ensayo, y conectar el timer tras la adición de la última 

muestra. 

Incube a temperatura ambiente durante 30 minutos. 

2. Lavado 

El procedimiento de lavado es crítico y requiere una atención especial. Un 

lavado inadecuado de la placa dará resultados inexactos, con una pobre 

precisión y fondos elevados. 

Tras la incubación retire la placa y lave 3 veces con 250-350µL de tampón de 

lavado por pocillo. Puede lavar la placa tanto con un lavador de placas 

automático o manualmente como se indica a continuación. Después del último 

lavado automático, invierta la placa y golpee los pocillos sobre papel secante. 

Las placas pueden lavarse de modo manual como sigue: 

a. Sacuda el contenido de la placa en un fregadero 

b. Golpee los pocillos sobre papel secante 

c. Pipetee 250-350µL de tampón de lavado en cada pocillo 

con una pipeta multicanal 

d. Agite la placa suavemente en una superficie plana 

e. Repita a-d dos veces. 

f. Repita a y b. 

3. Adición del conjugado 

Dispense 100µL de conjugado en cada pocillo, seque la parte superior de los 

pocillos con un pañuelo de papel para eliminar salpicaduras. 

Nota: No devuelva cantidades que sobren de conjugado al vial original del 

reactivo, con el fin de evitar su contaminación. 

Incube a temperatura ambiente durante 30 minutos. 

4. Lavado 

Repita el paso 2. 

5. Adición del sustrato (TMB) 

Dispense 100µL de sustrato TMB en cada pocillo, seque la parte superior de 

los pocillos con un pañuelo de papel para eliminar salpicaduras. 

Nota: Nunca devuelva cantidades sobrantes de TMB a la botella de reactivo, 

para evitar su contaminación. 

Incube a temperatura ambiente en la oscuridad durante 30 minutos. 

6. Parada 

Dispense 100µL de solución de parada en cada pocillo. De este modo se 

produce un cambio de color de azul a amarillo. 

7. Medición de la densidad óptica 

Lea la densidad óptica (OD) de cada pocillo a 450nm en un lector de 

microplacas, dentro de los 30 minutos siguientes a la parada de la reacción. 

8 RESULTADOS Y CONTROL DE CALIDAD 

1. Control de calidad 

Para que un ensayo sea válido se han de cumplir los siguientes requisitos: 

• Se han de incluir calibradores y controles positivo y negativo en cada ensayo. 

• El valor obtenido para el control positivo y negativo ha de entrar en el rango 

especificado en el certificado QC. 

• La forma de la curva ha de ser similar a la curva de calibración que se muestra 

en el certificado QC. 

Si estos requisitos no se cumplen el ensayo no es válido y debe repetirse. 

2. Cálculo de densidades ópticas medias (Solo para ensayos que se lleven a 

cabo en duplicado) 

Calcule la media de DO de las lecturas duplicadas para cada calibrador, control 

y muestra. El %CV para cada duplicado de DO ha de ser menor al 15%. 

3. Trazado de la curva de calibración 

Se puede trazar la curva de calibración de modo manual o automático, con los 

valores de concentración de autoanticuerpo anti- β 2 GP1 en la escala log frente 

a la DO en la escala lineal, para cada calibrador: 

• Automático – utilice un software adecuado y validado y el ajuste de curva que 

mejor se adapte a los datos. 

• Manual – utilice papel gráfico log/lineal y dibuje una suave curva a través de los 

puntos (no una línea recta o punto a punto). 

4. Tratamiento de puntos anómalos 

Si alguno de los puntos no entra en la curva, puede eliminarse. Si la ausencia 

de dicho punto implica que la forma de la curva sea distinta a la curva de 

calibración de muestra, o más de un punto parece ser anómalo, el ensayo debe 

repetirse. 

5. Cálculo del nivel de autoanticuerpo en controles y muestras 

Lea el nivel de autoanticuerpo anti- β 2 GP1 de los controles y muestras diluidas 

directamente de la curva de calibración. Los valores de control deben entrar 

dentro del rango indicado en el certificado QC. 

Nota: Los valores de calibrador han sido ajustados en un factor de 100 para 

tener en cuenta la dilución de la muestra 1:100. Por tanto, no hace falta 

ninguna corrección posterior. 

6. Calibración del ensayo 

El ensayo se encuentra calibrado en U/mL frente a un calibrador de referencia 

interno arbitrario, ya que actualmente no existe un patrón internacional 

reconocido. 

7. Limitaciones 

• Los resultados de este ensayo no son una prueba diagnóstica de la presencia 

o ausencia de enfermedad. 

• Cuando se obtiene un resultado negativo anti-β 2 GP1 en presencia de 

indicaciones clínicas, se requiere realizar un ensayo de anti-cardiolipina, anticoagulante 

lupus u otros ensayos adicionales. 

• No se debe iniciar el tratamiento de un paciente únicamente en base a un 

resultado positivo anti-β 2 GP1, se han de tener también en cuenta los datos 

clínicos. 

9 CARACTERÍSTICAS DEL ENSAYO 

9.1 PRECISIÓN 

Se midió la precisión intra-ensayo utilizando 6 muestras ensayadas 20 veces 

dentro del mismo ensayo en el rango de la curva de calibración. Se muestra a 

continuación la concentración y %CV para cada una: 

PRECISIÓN INTRA-ENSAYO 

n=20 Concentración (U/mL) % CV 

Muestra 1 6,4 5,8 

Muestra 2 16,0 2,9 

Muestra 3 20,5 2,9 

Muestra 4 37,4 4,6 

Muestra 5 48,7 3,6 

Muestra 6 66,4 4,1 

Se midió la precisión inter-ensayo utilizando 6 muestras ensayadas en 

duplicado seis veces durante 3 días. Se muestra a continuación la 

concentración y %CV para cada una: 

PRECISIÓN INTER-ENSAYO 

n=6 Concentración (U/mL) % CV 

Muestra 1 6,1 10,7 

Muestra 2 15,8 3,6 

Muestra 3 19,5 5,1 

Muestra 4 37,9 4,4 

Muestra 5 49,3 3,7 

Muestra 6 65,4 2,6 

9.2 RANGO NORMAL 

Se midieron los niveles de autoanticuerpos anti-β 2 GP1 en sueros de donantes 

de sangre normales (100 hombres y 100 mujeres) y los resultados se muestran 

en la siguiente gráfica. Tomando como referencia un cut-off positivo de 20,0 U/mL, 

las dos muestras positivas obtenidas se confirmaron como positivas utilizando 

un kit alternativo de anti-β 2 GP1 IgA. 

Número de muestras 

120 

100 

80 

60 

40 

20 

0 

20.0 

Anti-B2GP1 IgA U/mL 

Estos rangos de normalidad se indican únicamente como una guía. Es 

recomendable que cada laboratorio establezca sus propios rangos normales. 

9.3 ESPECIFICIDAD, SENSIBILIDAD Y CORRELACIÓN 

La especificidad, sensibilidad y correlación relativa se determinaron frente a un 

kit alternativo EIA anti- β 2 GP1 IgA, utilizando 114 muestras clínicas y normales. 

Las muestras eran de 46 pacientes LES que dieron un resultado positivo previo 

para anticuerpos anti-fosfolípido, 8 de pacientes con síndrome anti-fosfolípido, 

20 pacientes AR, 20 pacientes LES con un estado SAF desconocido y 20 

sueros normales de donantes de sangre sanos. El ensayo de las muestras se 

realizó aplicando un cut-off de 20.0U/mL para el kit BINDAZYME IgA S y el 

recomendado en el kit alternativo. 


EIA alternativo 

EIA 

+ *Dudoso - 

+ 18 2 1 

BINDAZYME 

Dudoso 3 3 3 


- 1^ 5 78 

Sensibilidad relativa 94,7% 

Especificidad relativa 98,7% 

Correlación relativa 98,0% 

*Las muestras en el rango dudoso se excluyeron del análisis. 

^La muestra discrepante fue negativa en el kit alternativo. 

9.4 SENSIBILIDAD ANALÍTICA 

Se ensayaron múltiples replicados de cada muestra y se estudiaron mediante 

el análisis estadístico t-Student. Dicho estudio confirmó que el ensayo antiβ 

2 GP1 IgA S puede diferenciar entre dos muestras con valores cercanos al 

valor inferior del rango de medida (173% y 199% del calibrador inferior). 

9.5 RANGO DE MEDIDA 

El rango de medida del ensayo es de 3,7 – 300 U/mL. 

9.6 SUSTANCIAS INTERFERENTES 

Se añadieron distintas sustancias interferentes a muestras anti-β 2 GP1 IgA 

positivas y negativas, que fueron posteriormente analizadas. El método 

utilizado para comprobar el efecto de dichas sustancias fue el kit Interference 

Check A plus TM de Kokusai, Shiyaku, Japón. 

Sustancia 

Bilirrubina L (libre) 

Bilirrubina C (conjugada) 

Hemoglobina hemolizada 

Quilo 

Factor reumatoide 

Concentración 

18.0mg/dL 

19,3mg/dL 

482mg/dL 

1430 Unidades FT 

50,0 UI/mL 

No se observaron interferencias en las muestras ensayadas. 

10 VALORES ESPERADOS 

Se determinó el cut-off positivo en base al ensayo de muestras normales (100 

hombres y 100 mujeres) para el ensayo anti-β 2 GP1 IgA S, siendo el resultado 

de 20,0U/mL, con una zona dudosa de 15,0 – 20,0U/mL. Los rangos indicados 

son únicamente orientativos. Los ensayos ELISA son muy sensibles y capaces 

de detectar pequeñas diferencias en grupos de población. 

11 REFERENCIAS 

Anti-β 2 GP1 IgA 

< 15,0 U/mL Resultado negativo 

15,0-20,0 U/mL Dudoso 

>20,0 U/mL Resultado positivo 










Sci USA; 87:4120-4124 





Acta; 884: 142-149 






modified solid phase surface. J Exp Med; 179:457-462 




Milford Ward. J. Sheldon, GD Wild. Publ. PRU Publications, Sheffield. 14 

12 PLANTILLA DE PLACA 

Vea la parte posterior de la hoja de instrucciones. 

Resumen del procedimiento 

1. Añada 100µL de cada calibrador, control y muestra diluida 1:100 en 

los pocillos correspondientes. 

Incube durante 30 minutos. 

Lave. 

2. Añada100µL de conjugado a cada pocillo. 


Lave. 

3. Añada 100µL de sustrato a cada pocillo. 


4. Añada 100µL de solución de parada a cada pocillo. 

Mida la absorbancia a 450 nm. 

BINDAZYME es una marca de 



B14 4ZB. England 


Plate Template 

Plattenschema 

Plan de plaque 

Plantilla de placa 

A 

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 

B 

C 

D 

E 

F + 

G 

H

INSTRUCTIONS FOR USE BINDAZYMEï£ª Human Anti ... - inova

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