INSTRUCTIONS FOR USE BINDAZYME Human Anti ... - inova

au 1/20) et mélanger. De plus petits volumes peuvent être dilués si nécessaire.
Note: Le tampon de lavage dilué peut être conservé à température ambiante
jusqu’à 4 semaines, cependant il est recommandé de diluer uniquement la
quantité appropriée.
4. Dilution de l’échantillon
Diluer 10µL de chaque échantillon avec 1000µL de diluant échantillon (1/100)
et mélanger bien.
Note : Les échantillons dilués doivent être utilisés dans les huit heures.
5. Manipulation des barrettes et du support
Placer le nombre de puits requis sur le support de la position A1 en remplissant
les colonnes de gauche à droite. Manipuler la plaque par les bords longs du
support de plaque afin d’empêcher les puits de tomber.
Note : Remettre immédiatement les puits non utilisés dans leur emballage
aluminium avec les deux dessiccateurs et refermer soigneusement afin de
minimiser l’exposition à l’humidité.
Faire attention à ne pas percer ou déchirer le sachet, cf. ci-dessous.
ATTENTION: L’exposition des puits à l’humidité, à la poussière ou à des
particules de matière peut induire une dégradation de l’antigène
conduisant à une mauvaise précision et à des résultats potentiellement
faux.
7.2 METHODE DE TEST
Maintenir la même séquence tout au long du test.
2. Dépôt des échantillons
Déposer 100µL de chaque contrôle et échantillon dilué (1:100) dans les puits
appropriés de la plaque fournie.
Note : Les échantillons doivent être déposés sur la plaque aussi rapidement
que possible afin de minimiser les écarts. Le décompte du temps doit
commencer après l’addition du dernier échantillon.
Incuber à température ambiante pendant 30 minutes.
2. Lavage
La procédure de lavage est très importante et requiert une attention spéciale.
Une plaque mal lavée peut donner de mauvais résultats avec une mauvaise
précision et du bruit de fond.
Après l’incubation, vider la plaque et laver 3 fois les puits avec 250 à 350 µL de
tampon de lavage par puits. Laver la plaque manuellement ou avec un lecteur
de plaque automatique comme indiqué ci-dessous. Après le lavage final,
renverser la plaque et taper les puits sur du papier absorbant.
Les plaques peuvent être lavées manuellement comme indiqué cidessous
:
a. Vider le contenu de la plaque dans un réservoir.
b. Taper les puits sur du papier absorbant.
c. Remplir chaque puits avec 250 à 350µL de tampon de lavage en
utilisant une pipette multicanaux.
d. Agiter doucement la plaque.
e. Répéter 2 fois les étapes a à d.
f. Répéter les étapes a et b.
3. Dépôt du conjugué
Déposer 100µL de conjugué par puits. Enlever les éclaboussures autour des
puits à l’aide d’un tissu.
Note: Afin d’éviter les contaminations, ne jamais remettre l’excès de conjugué
dans le flacon d’origine.
Incuber à température ambiante pendant 30 minutes.
4. Lavage
Répéter l’étape 2.
5. Dépôt du substrat (TMB)
Déposer 100µL de substrat TMB dans chaque puits. Enlever les éclaboussures
autour des puits à l’aide d’un tissu.
Note: Afin d’éviter les contaminations, ne jamais remettre l’excès de TMB dans
le flacon d’origine.
Incuber à température ambiante dans l’obscurité pendant 30 minutes.
6. Solution d’arrêt
Déposer 100µL de solution d’arrêt dans chaque puits. Ceci induit un
changement de couleur du bleu au jaune.
7. Mesure de la densité optique
Lire la densité optique (DO) de chaque puits à 450nm avec un lecteur de
microplaques dans les 30 minutes suivant l’arrêt de la réaction.
8 RESULTATS ET CONTRÔLE DE QUALITE
1. Contrôle de Qualité
Afin de valider le test, tous les critères suivants doivent être respectés :
• Tous les calibrateurs, les contrôles positif et négatig spécifiques doivent être
inclus dans chaque test.
• Les valeurs obtenues pour les contrôles doivent être dans la gamme spécifiée
sur le certificat de contrôle de qualité.
• L’allure de la courbe doit être similaire à l’allure de la courbe de calibration se
trouvant sur le certificat de contrôle qualité.
Si les critères ci-dessus ne sont pas respectés, le test est invalide et doit
être répété.
2. Calcul de la moyenne des densités optiques (pour les tests lancés en
duplicats)
Pour chaque calibrateur, les contrôles et les échantillons, calculer la moyenne
des DO obtenues. Le pourcentage du coefficient de variation (% C.V.) pour
chaque duplicats doit être inférieur à 15%.
3. Réalisation de la courbe de calibration
La courbe de calibration peut être tracée automatiquement ou manuellement en
reportant la concentration des autoanticorps anti-β 2 GP1 en abscisse avec une
échelle logarithmique et la DO de chaque calibrateur en ordonnée:
• Automatiquement - utiliser le logiciel approprié et l’allure de la courbe qui
correspond le mieux aux données.
• Manuellement - utiliser du papier grphique millimétré logarithmique, dessiner
une courbe reliant les points (pas une ligne droite).
4. Traitement des points anormaux
Si un point ne se trouve pas sur la courbe, il peur être enlevé. Une fois ce point
enlevé, le test devra être refait si l’aspect de la courbe obtenue est différent de
celui de la courbe de calibration donnée sur le certificat de contrôle qualité, ou
si plus d’un point deviennent anormaux.
5. Calcul du taux d’autoanticorps dans les échantillons et les contôles
Lire le taux d’autoanticorps anti-β 2 GP1 dans les échantillons dilués et les
contrôles directement à partir de la courbe de calibration. Les valeurs des
contrôles doivent être comprises dans les gammes données sur le certificat de
contrôle qualité.
Note : Les valeurs des calibrateurs doivent être ajustées par un facteur 100
pour prendre en compte la dilution au 1 : 100 de l’échantillon.
6. Calibration du test
Ce test est calibré en U/Ml contre un calibratuer référence interne arbitraire,
etétn donné qu’aucun standard internantional n’est disponible actuellement.
7. Limites
• Les résultats obtenus avec ces coffrets ne sont pas une preuve diagnostique de
la présence ou de l’absence de maladies.
• Lorsque les résultats sont négatifs et que des indications cliniques sont
fournies, un test anti-cardiolipides, anticoagulant de type lupique ou un test
suplémentaire devra être réalisé.
• Le traitement d’un patient ne doit pas être réalisé sur la seule base d’un résultat
anti-β 2 GP1 positif. D’autres données cliniques doivent être présentes.
9 PERFORMANCES ET CHARACTERISTIQUES
9.1 PRECISION
La précision intra-essai a été mesurée en utilisant 6 échantillons testés 20 fois
dans le même test. La concentration et le pourcentage de Coefficient de
Variation (C.V.) pour chaque échantillon sont donnés ci-dessous :
PRECISION INTRA-ESSAI
n=20 Concentration (U/mL) % CV
Echantillon 1 6,4 5,8
Echantillon 2 16,0 2,9
Echantillon 3 20,5 2,9
Echantillon 4 37,4 4,6
Echantillon 5 48,7 3,6
Echantillon 6 66,4 4,1
La précision inter-essai a été mesurée en utilisant six échantillons testés en
duplicats six fois de suite sur trois jours. La concentration et le %CV de chaque
échantillon sont indiqués ci-dessous.
PRECISION INTER-ESSAI
n=6 Concentration (U/mL) % CV
Echantillon 1 6,1 10,7
Echantillon 2 15,8 3,6
Echantillon 3 19,5 5,1
Echantillon 4 37,9 4,4
Echantillon 5 49,3 3,7
Echantillon 6 65,4 2,6
9.2 GAMME NORMALE
Les taux d’auto-anticorps anti- ß 2 GP1 ont été mesurés dans le sérum de 100
hommes et 100 femmes normaux. Les résultats obtenus sont montrés dans le
graphique ci-dessous. En se basant sur un cut-off de 20,0 U/mL, des deux
échantillons positifs ont été confirmés en utilisant un coffret anti-β 2 GP1 IgA
alternatif d’une autre fabricant.
Nombre d’échantillons
120
100
80
60
40
20
0
Cette gamme normale est fournie à titre indicatif. IL est fortement recommandé
à chaque laboratoire d’établir sa propore gamme normale.
9.3 SPECIFICITE, SENSIBILITE, CORRELATION
La spécificité relative, la sensibilité et la correlation ont été déterminées contre
un autre coffret de dosage d’IgA anti-β 2 GP1 en utilisant 114 échantillons
cliniques et normaux. Ces échantillons provenaient de 46 patients atteints de
LED auparavant testés positifs pour les anticorps anti-phospholipides; 8
patients atteints du Syndrome primaire des antiphospholipides; 20 patients
atteints d’Arthrite Rhumatoïde; 20 patients atteints de LED et de statut inconnu
pour le SAPL et 20 sérums normaux issus d’adultes sains. Le statut des
échantillons a été determiné en appliquant un cut-off positif de 20.0 U/mL avec
une zone douteuse de 15-20 U/mL pour le coffret BINDAZYME IgA S et le
coffret alternatif.
Coffret EIA Alternatif
EIA
BINDAZYME
Anti-β 2 GP1 IgA S EIA
20.0
IgA Anti-B2GP1 U/mL
+ *Douteux -
+ 18 2 1
Douteux 3 3 3
- 1^ 5 78
Sensibilité Relative 94,7%
Spécificité Relative 98,7%
Corrélation Relative 98,0%
* Les échantillons douteux ont été exclus de l’analyse.
^ Ces échantillons ont tous été testés négatifs avec un autre coffret.
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