INSTRUCTIONS FOR USE BINDAZYME Human Anti ... - inova

2. Componentes del kit
Mezcle cuidadosamente cada componente del kit antes de su uso.
3. Dilución del tampón de lavado
Añada 50mL del tampón de lavado concentrado a 950mL de agua destilada
(dilución 1/20) en un recipiente limpio y mezcle. Pueden prepararse volúmenes
más pequeños diluyendo adecuadamente.
Nota: El tampón de lavado diluido puede conservarse a temperatura ambiente
hasta 4 semanas, por tanto diluya únicamente la cantidad necesaria.
4. Dilución de la muestra
Diluya 10µL de cada muestra con 1000µL de diluyente de muestra (1:100) y
mezcle bien.
Nota: La muestra diluida debe utilizarse dentro de las 8 horas siguientes a la
dilución.
5. Manipulación de tira y marco
Coloque el número de pocillos necesarios en el soporte de las tiras. Posicione
a partir del pocillo A1, rellenando las columnas de izquierda a derecha a través
de la placa. Cuando manipule la placa, apriete los largos bordes del marco
para evitar que los pocillos caigan fuera.
Nota: Vuelva a colocar inmediatamente los pocillos no utilizados en su
envoltorio junto a las dos bolsitas de desecante, y séllelo fuertemente para
minimizar su exposición a la humedad.
Tenga cuidado de no perforar o rasgar el envoltorio, ver más abajo.
ATENCIÓN: La exposición de los pocillos a la humedad o a
contaminación por polvo u otro material particulado provocará la
degradación del antígeno, dando como resultado una pobre precisión del
método y potencialmente resultados falsos.
7.2 METODOLOGÍA DE ENSAYO
Mantenga la misma secuencia de dispensación durante todo el proceso.
1. Adición de la muestra
Dispense 100µL de cada calibrador, control y muestra diluida (1:100) en los
pocillos adecuados de la placa.
Nota: Las muestras deben añadirse lo más rápidamente posible a la placa para
minimizar la deriva del ensayo, y conectar el timer tras la adición de la última
muestra.
Incube a temperatura ambiente durante 30 minutos.
2. Lavado
El procedimiento de lavado es crítico y requiere una atención especial. Un
lavado inadecuado de la placa dará resultados inexactos, con una pobre
precisión y fondos elevados.
Tras la incubación retire la placa y lave 3 veces con 250-350µL de tampón de
lavado por pocillo. Puede lavar la placa tanto con un lavador de placas
automático o manualmente como se indica a continuación. Después del último
lavado automático, invierta la placa y golpee los pocillos sobre papel secante.
Las placas pueden lavarse de modo manual como sigue:
a. Sacuda el contenido de la placa en un fregadero
b. Golpee los pocillos sobre papel secante
c. Pipetee 250-350µL de tampón de lavado en cada pocillo
con una pipeta multicanal
d. Agite la placa suavemente en una superficie plana
e. Repita a-d dos veces.
f. Repita a y b.
3. Adición del conjugado
Dispense 100µL de conjugado en cada pocillo, seque la parte superior de los
pocillos con un pañuelo de papel para eliminar salpicaduras.
Nota: No devuelva cantidades que sobren de conjugado al vial original del
reactivo, con el fin de evitar su contaminación.
Incube a temperatura ambiente durante 30 minutos.
4. Lavado
Repita el paso 2.
5. Adición del sustrato (TMB)
Dispense 100µL de sustrato TMB en cada pocillo, seque la parte superior de
los pocillos con un pañuelo de papel para eliminar salpicaduras.
Nota: Nunca devuelva cantidades sobrantes de TMB a la botella de reactivo,
para evitar su contaminación.
Incube a temperatura ambiente en la oscuridad durante 30 minutos.
6. Parada
Dispense 100µL de solución de parada en cada pocillo. De este modo se
produce un cambio de color de azul a amarillo.
7. Medición de la densidad óptica
Lea la densidad óptica (OD) de cada pocillo a 450nm en un lector de
microplacas, dentro de los 30 minutos siguientes a la parada de la reacción.
8 RESULTADOS Y CONTROL DE CALIDAD
1. Control de calidad
Para que un ensayo sea válido se han de cumplir los siguientes requisitos:
• Se han de incluir calibradores y controles positivo y negativo en cada ensayo.
• El valor obtenido para el control positivo y negativo ha de entrar en el rango
especificado en el certificado QC.
• La forma de la curva ha de ser similar a la curva de calibración que se muestra
en el certificado QC.
Si estos requisitos no se cumplen el ensayo no es válido y debe repetirse.
2. Cálculo de densidades ópticas medias (Solo para ensayos que se lleven a
cabo en duplicado)
Calcule la media de DO de las lecturas duplicadas para cada calibrador, control
y muestra. El %CV para cada duplicado de DO ha de ser menor al 15%.
3. Trazado de la curva de calibración
Se puede trazar la curva de calibración de modo manual o automático, con los
valores de concentración de autoanticuerpo anti- β 2 GP1 en la escala log frente
a la DO en la escala lineal, para cada calibrador:
• Automático – utilice un software adecuado y validado y el ajuste de curva que
mejor se adapte a los datos.
• Manual – utilice papel gráfico log/lineal y dibuje una suave curva a través de los
puntos (no una línea recta o punto a punto).
4. Tratamiento de puntos anómalos
Si alguno de los puntos no entra en la curva, puede eliminarse. Si la ausencia
de dicho punto implica que la forma de la curva sea distinta a la curva de
calibración de muestra, o más de un punto parece ser anómalo, el ensayo debe
repetirse.
5. Cálculo del nivel de autoanticuerpo en controles y muestras
Lea el nivel de autoanticuerpo anti- β 2 GP1 de los controles y muestras diluidas
directamente de la curva de calibración. Los valores de control deben entrar
dentro del rango indicado en el certificado QC.
Nota: Los valores de calibrador han sido ajustados en un factor de 100 para
tener en cuenta la dilución de la muestra 1:100. Por tanto, no hace falta
ninguna corrección posterior.
6. Calibración del ensayo
El ensayo se encuentra calibrado en U/mL frente a un calibrador de referencia
interno arbitrario, ya que actualmente no existe un patrón internacional
reconocido.
7. Limitaciones
• Los resultados de este ensayo no son una prueba diagnóstica de la presencia
o ausencia de enfermedad.
• Cuando se obtiene un resultado negativo anti-β 2 GP1 en presencia de
indicaciones clínicas, se requiere realizar un ensayo de anti-cardiolipina, anticoagulante
lupus u otros ensayos adicionales.
• No se debe iniciar el tratamiento de un paciente únicamente en base a un
resultado positivo anti-β 2 GP1, se han de tener también en cuenta los datos
clínicos.
9 CARACTERÍSTICAS DEL ENSAYO
9.1 PRECISIÓN
Se midió la precisión intra-ensayo utilizando 6 muestras ensayadas 20 veces
dentro del mismo ensayo en el rango de la curva de calibración. Se muestra a
continuación la concentración y %CV para cada una:
PRECISIÓN INTRA-ENSAYO
n=20 Concentración (U/mL) % CV
Muestra 1 6,4 5,8
Muestra 2 16,0 2,9
Muestra 3 20,5 2,9
Muestra 4 37,4 4,6
Muestra 5 48,7 3,6
Muestra 6 66,4 4,1
Se midió la precisión inter-ensayo utilizando 6 muestras ensayadas en
duplicado seis veces durante 3 días. Se muestra a continuación la
concentración y %CV para cada una:
PRECISIÓN INTER-ENSAYO
n=6 Concentración (U/mL) % CV
Muestra 1 6,1 10,7
Muestra 2 15,8 3,6
Muestra 3 19,5 5,1
Muestra 4 37,9 4,4
Muestra 5 49,3 3,7
Muestra 6 65,4 2,6
9.2 RANGO NORMAL
Se midieron los niveles de autoanticuerpos anti-β 2 GP1 en sueros de donantes
de sangre normales (100 hombres y 100 mujeres) y los resultados se muestran
en la siguiente gráfica. Tomando como referencia un cut-off positivo de 20,0 U/mL,
las dos muestras positivas obtenidas se confirmaron como positivas utilizando
un kit alternativo de anti-β 2 GP1 IgA.
Número de muestras
120
100
80
60
40
20
0
20.0
Anti-B2GP1 IgA U/mL
Estos rangos de normalidad se indican únicamente como una guía. Es
recomendable que cada laboratorio establezca sus propios rangos normales.
9.3 ESPECIFICIDAD, SENSIBILIDAD Y CORRELACIÓN
La especificidad, sensibilidad y correlación relativa se determinaron frente a un
kit alternativo EIA anti- β 2 GP1 IgA, utilizando 114 muestras clínicas y normales.
Las muestras eran de 46 pacientes LES que dieron un resultado positivo previo
para anticuerpos anti-fosfolípido, 8 de pacientes con síndrome anti-fosfolípido,
20 pacientes AR, 20 pacientes LES con un estado SAF desconocido y 20
sueros normales de donantes de sangre sanos. El ensayo de las muestras se
realizó aplicando un cut-off de 20.0U/mL para el kit BINDAZYME IgA S y el
recomendado en el kit alternativo.
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