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au 1/20) et mélanger. De plus petits volumes peuvent être dilués si nécessaire. Note: Le tampon de lavage dilué peut être conservé à température ambiante jusqu’à 4 semaines, cependant il est recommandé de diluer uniquement la quantité appropriée. 4. Dilution de l’échantillon Diluer 10µL de chaque échantillon avec 1000µL de diluant échantillon (1/100) et mélanger bien. Note : Les échantillons dilués doivent être utilisés dans les huit heures. 5. Manipulation des barrettes et du support Placer le nombre de puits requis sur le support de la position A1 en remplissant les colonnes de gauche à droite. Manipuler la plaque par les bords longs du support de plaque afin d’empêcher les puits de tomber. Note : Remettre immédiatement les puits non utilisés dans leur emballage aluminium avec les deux dessiccateurs et refermer soigneusement afin de minimiser l’exposition à l’humidité. Faire attention à ne pas percer ou déchirer le sachet, cf. ci-dessous. ATTENTION: L’exposition des puits à l’humidité, à la poussière ou à des particules de matière peut induire une dégradation de l’antigène conduisant à une mauvaise précision et à des résultats potentiellement faux. 7.2 METHODE DE TEST Maintenir la même séquence tout au long du test. 2. Dépôt des échantillons Déposer 100µL de chaque contrôle et échantillon dilué (1:100) dans les puits appropriés de la plaque fournie. Note : Les échantillons doivent être déposés sur la plaque aussi rapidement que possible afin de minimiser les écarts. Le décompte du temps doit commencer après l’addition du dernier échantillon. Incuber à température ambiante pendant 30 minutes. 2. Lavage La procédure de lavage est très importante et requiert une attention spéciale. Une plaque mal lavée peut donner de mauvais résultats avec une mauvaise précision et du bruit de fond. Après l’incubation, vider la plaque et laver 3 fois les puits avec 250 à 350 µL de tampon de lavage par puits. Laver la plaque manuellement ou avec un lecteur de plaque automatique comme indiqué ci-dessous. Après le lavage final, renverser la plaque et taper les puits sur du papier absorbant. Les plaques peuvent être lavées manuellement comme indiqué cidessous : a. Vider le contenu de la plaque dans un réservoir. b. Taper les puits sur du papier absorbant. c. Remplir chaque puits avec 250 à 350µL de tampon de lavage en utilisant une pipette multicanaux. d. Agiter doucement la plaque. e. Répéter 2 fois les étapes a à d. f. Répéter les étapes a et b. 3. Dépôt du conjugué Déposer 100µL de conjugué par puits. Enlever les éclaboussures autour des puits à l’aide d’un tissu. Note: Afin d’éviter les contaminations, ne jamais remettre l’excès de conjugué dans le flacon d’origine. Incuber à température ambiante pendant 30 minutes. 4. Lavage Répéter l’étape 2. 5. Dépôt du substrat (TMB) Déposer 100µL de substrat TMB dans chaque puits. Enlever les éclaboussures autour des puits à l’aide d’un tissu. Note: Afin d’éviter les contaminations, ne jamais remettre l’excès de TMB dans le flacon d’origine. Incuber à température ambiante dans l’obscurité pendant 30 minutes. 6. Solution d’arrêt Déposer 100µL de solution d’arrêt dans chaque puits. Ceci induit un changement de couleur du bleu au jaune. 7. Mesure de la densité optique Lire la densité optique (DO) de chaque puits à 450nm avec un lecteur de microplaques dans les 30 minutes suivant l’arrêt de la réaction. 8 RESULTATS ET CONTRÔLE DE QUALITE 1. Contrôle de Qualité Afin de valider le test, tous les critères suivants doivent être respectés : • Tous les calibrateurs, les contrôles positif et négatig spécifiques doivent être inclus dans chaque test. • Les valeurs obtenues pour les contrôles doivent être dans la gamme spécifiée sur le certificat de contrôle de qualité. • L’allure de la courbe doit être similaire à l’allure de la courbe de calibration se trouvant sur le certificat de contrôle qualité. Si les critères ci-dessus ne sont pas respectés, le test est invalide et doit être répété. 2. Calcul de la moyenne des densités optiques (pour les tests lancés en duplicats) Pour chaque calibrateur, les contrôles et les échantillons, calculer la moyenne des DO obtenues. Le pourcentage du coefficient de variation (% C.V.) pour chaque duplicats doit être inférieur à 15%. 3. Réalisation de la courbe de calibration La courbe de calibration peut être tracée automatiquement ou manuellement en reportant la concentration des autoanticorps anti-β 2 GP1 en abscisse avec une échelle logarithmique et la DO de chaque calibrateur en ordonnée: • Automatiquement - utiliser le logiciel approprié et l’allure de la courbe qui correspond le mieux aux données. • Manuellement - utiliser du papier grphique millimétré logarithmique, dessiner une courbe reliant les points (pas une ligne droite). 4. Traitement des points anormaux Si un point ne se trouve pas sur la courbe, il peur être enlevé. Une fois ce point enlevé, le test devra être refait si l’aspect de la courbe obtenue est différent de celui de la courbe de calibration donnée sur le certificat de contrôle qualité, ou si plus d’un point deviennent anormaux. 5. Calcul du taux d’autoanticorps dans les échantillons et les contôles Lire le taux d’autoanticorps anti-β 2 GP1 dans les échantillons dilués et les contrôles directement à partir de la courbe de calibration. Les valeurs des contrôles doivent être comprises dans les gammes données sur le certificat de contrôle qualité. Note : Les valeurs des calibrateurs doivent être ajustées par un facteur 100 pour prendre en compte la dilution au 1 : 100 de l’échantillon. 6. Calibration du test Ce test est calibré en U/Ml contre un calibratuer référence interne arbitraire, etétn donné qu’aucun standard internantional n’est disponible actuellement. 7. Limites • Les résultats obtenus avec ces coffrets ne sont pas une preuve diagnostique de la présence ou de l’absence de maladies. • Lorsque les résultats sont négatifs et que des indications cliniques sont fournies, un test anti-cardiolipides, anticoagulant de type lupique ou un test suplémentaire devra être réalisé. • Le traitement d’un patient ne doit pas être réalisé sur la seule base d’un résultat anti-β 2 GP1 positif. D’autres données cliniques doivent être présentes. 9 PERFORMANCES ET CHARACTERISTIQUES 9.1 PRECISION La précision intra-essai a été mesurée en utilisant 6 échantillons testés 20 fois dans le même test. La concentration et le pourcentage de Coefficient de Variation (C.V.) pour chaque échantillon sont donnés ci-dessous : PRECISION INTRA-ESSAI n=20 Concentration (U/mL) % CV Echantillon 1 6,4 5,8 Echantillon 2 16,0 2,9 Echantillon 3 20,5 2,9 Echantillon 4 37,4 4,6 Echantillon 5 48,7 3,6 Echantillon 6 66,4 4,1 La précision inter-essai a été mesurée en utilisant six échantillons testés en duplicats six fois de suite sur trois jours. La concentration et le %CV de chaque échantillon sont indiqués ci-dessous. PRECISION INTER-ESSAI n=6 Concentration (U/mL) % CV Echantillon 1 6,1 10,7 Echantillon 2 15,8 3,6 Echantillon 3 19,5 5,1 Echantillon 4 37,9 4,4 Echantillon 5 49,3 3,7 Echantillon 6 65,4 2,6 9.2 GAMME NORMALE Les taux d’auto-anticorps anti- ß 2 GP1 ont été mesurés dans le sérum de 100 hommes et 100 femmes normaux. Les résultats obtenus sont montrés dans le graphique ci-dessous. En se basant sur un cut-off de 20,0 U/mL, des deux échantillons positifs ont été confirmés en utilisant un coffret anti-β 2 GP1 IgA alternatif d’une autre fabricant. Nombre d’échantillons 120 100 80 60 40 20 0 Cette gamme normale est fournie à titre indicatif. IL est fortement recommandé à chaque laboratoire d’établir sa propore gamme normale. 9.3 SPECIFICITE, SENSIBILITE, CORRELATION La spécificité relative, la sensibilité et la correlation ont été déterminées contre un autre coffret de dosage d’IgA anti-β 2 GP1 en utilisant 114 échantillons cliniques et normaux. Ces échantillons provenaient de 46 patients atteints de LED auparavant testés positifs pour les anticorps anti-phospholipides; 8 patients atteints du Syndrome primaire des antiphospholipides; 20 patients atteints d’Arthrite Rhumatoïde; 20 patients atteints de LED et de statut inconnu pour le SAPL et 20 sérums normaux issus d’adultes sains. Le statut des échantillons a été determiné en appliquant un cut-off positif de 20.0 U/mL avec une zone douteuse de 15-20 U/mL pour le coffret BINDAZYME IgA S et le coffret alternatif. Coffret EIA Alternatif EIA BINDAZYME Anti-β 2 GP1 IgA S EIA 20.0 IgA Anti-B2GP1 U/mL + *Douteux - + 18 2 1 Douteux 3 3 3 - 1^ 5 78 Sensibilité Relative 94,7% Spécificité Relative 98,7% Corrélation Relative 98,0% * Les échantillons douteux ont été exclus de l’analyse. ^ Ces échantillons ont tous été testés négatifs avec un autre coffret. Insert Code: E141, Version: 17 January 2008, Page 8 of 13
9.4 SENSIBILITE ANALYTIQUE La confirmation que le test anti-β 2 GP1 IgA S permet de faire la distinction entre deux échantillons avec des valeurs proches de la limite haute de la gamme de mesure (173 et 199% du calibrateur le plus faible) a été obtenue par analyse statistique (Student’s t-test) des résultats obtenus après le test de plusieurs replicats de chaque échantillon. 9.5 GAMME DE MESURE La gamme de mesure de ce test est 3,7-300U/mL. 9.6 SUBSTANCES INTERFERANTES Une gamme de substances interférentes a été mise en évidence dans le dépistage des anticorps anti-ß 2 GP IgA sur des échantillons positifs et négatifs, qui ont été testés les uns après les autres. La méthode utilisée pour vérifier l’effet de ces substances est le coffret Interference Check A plus de Kokusai, Shiyaku, Japon. Substance Concentration Bilirubine F (libre) 18,0mg/dL Bilirubine C (conjuguée) 19,3mg/dL Hémoglobine hémolysée 482mg/dL Chyle 1430FT Units Facteur Rhumatoïde 50,0 IU/mL Aucune interférence n’a été observée dans les échantillons testés. 10 RESULTATS ET INTERPRETATION Le cut-off positif du test de 100 sérums normaux d’homme et de 100 sérums normaux de femmes a été déterminé à 20,0 U/mL avec une zone douteuse de 0,65-0,90µg/mL pour le test anti-β 2 GP1 IgA S. Ces gammes sont fournies à titre indicatif. Les tests ELISA sont très sensibles et permettent la détection de petites différences dans des populations de sérums 11 REFERENCES IgA anti-β 2 GP1 < 15,0 U/mL Résultat négatif 15,0-20,0 U/mL Douteux >20,0 U/mL Résultat positif 1. Miyakis S, Lockshin MD, Atsumi T, Branch DW, Brey RL, et al. (2006). International concensus statement on an update of the classification criteria for definite antiphospholipid syndrome. J Thromb Haemost; 4: 295-306. 2. Galli M, Comfurius P, Maassen C, Hemker HC, de Baets MH, et al. (1990). Anticardiolipin antibodies (ACA) directed not to cardiolipin but to a plasma protein cofactor. Lancet; 335: 1544-7. 3. McNeil HP, Simpson RJ, Chesterman CN & Krilis SA. (1990). Anti-phospholipid antibodies are directed against a complex antigen that includes a lipid-binding inhibitor of coagulation: beta 2-glycoprotein I (apolipoprotein H). Proc Natl Acad Sci USA; 87:4120-4124. 4. Schousboe I. (1985). β 2 -Glycoprotein I: A plasma inhibitor of the contact activation of the intrinsic blood coagulation pathway. Blood; 66: 1086-1091. 5. Nimpf J, Bevers EM, Bomans PH, Till U, Wurm H, et al. (1986). Prothrombinase activity of human platelets is inhibited by β 2 -glycoprotein-I. Biochim. Biophys. Acta; 884: 142-149. 6. Nimpf J, Wurm H & Kostner GM. (1987). β 2 -Glycoprotein-I (apo-H) inhibits the release reaction of human platelets during ADP-induced aggregation. Atherosclerosis; 63: 109-114. 7. Matsuura E, Igarashi Y Yasuda T, et al. (1994). Anticardiolipin antibodies recognize beta 2-glycoprotein I structure altered by binding with an oxygenated modified solid phase surface. J Exp Med; 179:457-462. 8. Matsuura E, & Koike T. (1996) in: Autoantibodies, pp 109-114, Peter JB & Shoenfeld Y (eds), Elsevier Science, Amsterdam. 9. Protein Reference Unit Handbook of Autoimmunity (3rd Edition) 2004 Ed A Milford Ward. J. Sheldon, GD Wild. Publ. PRU Publications, Sheffield. 14. 12 PLAN DE PLAQUE Veuillez regarder au dos de la Fiche Technique Résumé de la procédure 1. Déposer 100µL de chaque contrôle et de chaque échantillon dilué au 1/100 dans le puits approprié. Incuber 30 minutes. Laver 2. Ajouter 100µL de conjugué à chaque puits Incuber 30 minutes. Laver 3. Ajouter 100µL de Substrat à chaque puits Incuber 30 minutes. 4. Ajouter de solution stop à chaque puits. Lire l’absorbance à 450nm. BINDAZYME est une marque de The Binding Site Ltd. P.O. Box 11712, Birmingham B14 4ZB England Insert Code: E141, Version: 17 January 2008, Page 9 of 13
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