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ARBEITSANLEITUNG BINDAZYME TM Human Anti-ß 2 GP1 IgA S Enzym-Immunoassay-Kit MK141 Nur zur in-vitro Diagnostik Hergestellt von: The Binding Site Ltd, PO Box 11712, Birmingham, B14 4ZB, UK. www.bindingsite.co .uk Vertrieb in Deutschland und Österreich durch: The Binding Site GmbH, Robert-Bosch-Straβe 2A D-68723 Schwetzingen, Deutschland Telefon: +49 (0) 6202 92 62 0 Fax: +49 (0) 6202 92 62 222 e-mail: office@bindingsite.de 1 VERWENDUNGSZWECK Dieser Kit dient der in-vitro Bestimmung von IgA-Autoantikörpern gegen ß 2 -Glykoprotein 1 (ß 2 GP1) in Humanserum. Der Test kann zusammen mit anderen serologischen und klinischen Befunden bei der Diagnosestellung von Thrombosen bei Risikopatienten mit z.B. primärem Antiphospholipid-Syndrom (APS) oder sekundärem APS, bei dem in der Regel ein systemischer Lupus erythematodes (SLE) zugrunde liegt, helfen. Der Kit enthält ausreichend Material, um maximal 41 Proben in Doppelbestimmung oder 89 Proben in Einzelbestimmung, eine Kalibrationskurve und je eine Positiv- und eine Negativkontrolle messen zu können. 2 EINFÜHRUNG APS ist klinisch durch arterielle und venöse Thrombosen und/oder wiederkehrende habituelle Aborte gekennzeichnet, wobei sich jeweils Antiphospholipid-Antikörpern (aPL) nachweisen lassen 1 . Zu diesen Antiphospholipid-Antikörpern gehören eine Reihe verschiedener Autoantikörper, die entweder nur an Cardiolipin, an den Cardiolipin-Cofaktor-Komplex oder nur an den Cofaktor binden. Als Cofaktor wurde das 50kD Plasmaprotein β 2 GP1 (Apolipoprotein H) identifiziert 2,3 . β 2 GP1 inhibiert die intrinsische Gerinnungskaskade 4 , bindet an Thrombozyten 5 und inhibiert die ADP-vermittelte Thrombozyten-Aggregation 6 . Anti-Cardiolipin-Autoantikörper von SLE- und APS-Patienten binden an eine durch die Wechselwirkung mit negativ geladenem Phospholipid veränderte Form von β 2 GP1 7 . Dieses modifizierte β 2 GP1 kann durch direkte Bindung von β 2 GP1 an Polystyrolplättchen 7 reproduziert werden, an denen die Clusterbildung oder hohe Dichte des Antigens eine bi- oder multivalente Bindung des Autoantikörpers erlaubt und demzufolge im ELISA nachweisbar ist. Durch Eliminierung des Phospholipids und ausschließliche Verwendung dieser Form von β 2 GP1 erhält man einen Test, der in Hinblick auf das vorherrschende Auftreten dieses Autoantikörpers in den Seren von APS-Patienten eine erhöhte Spezifität für APS aufweist 8 . Unlängst wurden anti-ß 2 GP1-Antikörper vom IgG- und IgM-Typ unter der Vorausssetzung, dass sie einen entsprechend hohen Titer aufweisen, in die Laborkriterien zur Diagnose eines definitiven APS neu aufgenommen; hinsichtlich der anti-ß 2 GP1-Antikörper vom IgA-Typ wurde von demselben Komitee abschließend festgehalten, dass sie am häufigsten bei spezifischen ethnischen Gruppen nachweisbar sind 1 . 3 TESTPRINZIP Die Vertiefungen (Wells) der Mikrotiterplatten sind mit humanem β 2 GP1 beschichtet. Die Kalibratoren, Kontrollen und verdünnten Patientenproben werden in den Vertiefungen inkubiert, so dass in diesem ersten Inkubationsschritt Autoantikörper an das immobilisierte ß 2 GP1-Antigen binden können. Nach dem Waschen der Vertiefungen - um ungebundenes Protein zu entfernen - wird Peroxidase-markiertes Kaninchen anti-Human-IgA-Konjugat (spezifisch für die α-Kette) zugegeben. Das Konjugat bindet an die gebundenen humanen Autoantikörper. Ungebundenes Konjugat wird durch einen weiteren Waschschritt entfernt. Das gebundene Konjugat wird mit Hilfe von 3,3’,5,5’ Tetramethylbenzidin (TMB) sichtbar gemacht. TMB ergibt ein blaues Reaktionsprodukt, dessen Intensität proportional zur Autoantikörper-Konzentration der Probe ist. Um die Reaktion zu stoppen, wird in jede Vertiefung Phosphorsäure pipettiert. Das gelbe Reaktionsprodukt wird bei 450nm gemessen. 4 WARNUNGEN UND VORSICHTSMAßNAHMEN 4.1 WARNUNGEN • Jede Einzelspende wurde bezüglich Antikörpern gegen Human- Immunschwäche-Virus (HIV 1 & 2), Hepatitis C-Virus und Hepatitis-B-Oberflächenantigen (HBsAg) untersucht und als negativ befunden. • Es gibt aber zur Zeit keine absolut sicheren Testmethoden zum Ausschluss von Infektionsträgern. Deshalb sollten die Reagenzien als potenziell infektiös behandelt werden. Umgangs- und Entsorgungsmethoden sollten denen für potenziell infektiösem Material entsprechen und der Test nur von entsprechend geschultem Personal durchgeführt werden. • Natriumazid kann mit Blei- oder Kupferrohren explosive Metallazide bilden. Nach der Entsorgung mit ausreichender Menge Wasser nachspülen, um Azidablagerungen zu vermeiden. • Alle Puffer und Seren im Kit enthalten die unten aufgelisteten Enzym-Inhibitoren als Konservierungsmittel. Diese sollten mit der entsprechenden Vorsicht behandelt werden. INHIBITOR KONZENTRATION Kathon Natriumazid ProClin 300 Bromonitrodioxan Methylisothiazon 0,02% 0,099% 0,045% 0,002% 0,002% ProClin ist ein eingetragenes Warenzeichen der Rohm and Haas Corp. Philadelphia, PA • Kathon wirkt reizend und kann bei Hautkontakt zu einer Sensibilisierung führen. • Die Stopp-Lösung enthält 3M Phosphorsäure. Sie ist reizend, deshalb Kontakt mit Haut und Augen vermeiden. • Verschüttete Reagenzien entsprechend beseitigen, dabei sind ökologische und gesetzliche Bestimmung zu beachten. 4.2 VORSICHTSMAßNAHMEN • Dieser Test sollte nur von entsprechend geschultem Laborpersonal durchgeführt werden. • Testdurchführung strikt nach Arbeitsanleitung. Jegliche Abweichung kann die Testqualität und Ergebnisse beeinflussen. Beachten Sie die spezifischen ‚Hinweise‘ und Warnungen in dieser Arbeitsanleitung. • Die Chargen von Kalibratoren, Kontrollen, Konjugat und Mikrotiterstreifen sind nicht austauschbar. Wird eine dieser Komponenten durch eine andere Charge, die nicht in dem gelieferten Kit enthalten ist, ersetzt, kann es zu inkonsistenten und inakkuraten Ergebnissen kommen. Alle Mikrotiterstreifen müssen aus demselben Folienbeutel entnommen werden. • Zur Vermeidung von Kontaminationen der Reagenzien immer saubere Plastikoder Glasgefäße verwenden. Niemals unbenutztes Reagenz in die Flaschen zurückgeben. • Reagenzienflaschen nicht für längere Zeit offen stehen lassen. Die daraus resultierende Verdunstung oder Verunreinigung führt zu widersprüchlichen Ergebnissen. • TMB darf weder mit Licht noch mit Wasser in Berührung kommen! • Die Verwendung von mikrobiell oder mit Partikeln verunreinigter, hämolytischer oder lipämischer Seren vermeiden. • Falsche Probenverdünnungen können nicht erkannt werden, da die Kit- Kontrollen gebrauchsfertig sind. Es wird empfohlen, kalibrierte Pipetten und geeignete interne Kontrollen zu verwenden. • Die Verwendung von ELISA-Automaten, Pipettierautomaten oder anderen automatisierten Geräten kann im Vergleich zur manuellen Testdurchführung zu abweichenden Ergebnissen führen. Jedes Labor muss das System vollständig validieren und sicherstellen, dass die Ergebnisse innerhalb der im QC-Zertifikat angegebenen Spezifikationen liegen. Das QC-Zertifikat ist dieser Arbeitsanleitung beigefügt. • Die verwendeten Geräte und Pipetten müssen gemäß der Herstellerangaben kalibriert und gewartet werden. 4.3 LAGERUNG UND STABILITÄT • Den Kit bei 2-8°C lagern, nicht einfrieren. Lagerung bei falscher Temperatur beeinflusst die Ergebnisse. • Der verdünnte Waschpuffer ist in einem sauberen Gefäß bei Raumtemperatur (20-24°C) bis maximal 4 Wochen haltbar. • Die Haltbarkeit des Kits wird auf dem Außenetikett angegeben. 5 PROBENENTNAHME UND -VORBEREITUNG • Blutproben über Venenpunktur sammeln und auf natürliche Weise gerinnen lassen. Serum vom Gerinnsel trennen. • Die Seren können bei 2-8°C bis zu 7 Tage vor dem Test gelagert werden 9 . Für eine längere Lagerung empfiehlt es sich, die Seren unverdünnt und aliquotiert bei mindestens -20°C einzufrieren. • Wiederholtes Einfrieren und Auftauen der Proben vermeiden. • Serumproben nicht hitzeinaktivieren, dies kann zu falsch-positiven Ergebnissen führen. 6 MATERIALIEN 6.1 GELIEFERTE MATERIALIEN • Arbeitsanleitung: mit genauen Angaben zur Testdurchführung. • QC-Zertifikat: mit Angabe der Leistungsdaten der Charge. • ß 2 GP1 S Coated Wells (mit ß 2 GP1 S beschichtete Wells): 12 Mikrotiterstreifen mit 8 vereinzelbaren Vertiefungen, die mit humanem ß 2 GP1 beschichtet sind. Die Streifen sind in einem wiederverschließbaren Folienbeutel, der ein Trockenmittel enthält, verpackt. • APS Sample Diluent (APS-Probendiluens): 2 Flaschen mit je 50mL gebrauchsfertigem Puffer zur Probenverdünnung. Farbcodierung: gelb. • APS Wash Buffer (20x Concentrate) (APS-Waschpuffer, 20fach-Konzentrat): 1 Flasche mit 50mL eines 20-fach konzentrierten Puffers zum Waschen der Vertiefungen der Mikrotiterstreifen. • ß 2 GP1 IgA S Calibrators (ß 2 GP1 IgA S Kalibratoren): 5 Flaschen mit jeweils 1,2mL vorverdünntem Humanserum, das folgende Konzentrationen an Antiß 2 GP1-Autoantikörpern enthält: 300; 100; 33,3; 11,1 und 3,7 U/mL. Gebrauchsfertig. • ß 2 GP1 IgA S Positive Control (ß 2 GP1 IgA S Positivkontrolle): 1 Flasche mit 1,2mL vorverdünntem Humanserum. Der Sollwert ist auf dem QC-Zertifikat angegegen. Gebrauchsfertig. • ß 2 GP1 S Negative Control (ß 2 GP1 S Negativkontrolle): 1 Flasche mit 1,2mL vorverdünntem Humanserum. Der Sollwert ist auf dem QC-Zertifikat angegegen. Gebrauchsfertig. • ß 2 GP1 IgA S Conjugate (ß 2 GP1 IgA S-Konjugat): 1 Flasche mit 12mL gereinigtem, Peroxidase-markiertem Antikörper. Farbcodierung: grün. Gebrauchsfertig. • TMB Substrate (TMB-Substrat): 1 Flasche mit 14mL TMB-Lösung. Gebrauchsfertig. • Stop Solution (Stopp-Lösung): 1 Flasche mit 14mL 3M Phosphorsäure. Gebrauchsfertig. 6.2 BENÖTIGTE, NICHT IM KIT ENTHALTENE MATERIALIEN • Automatisches Mikrotiterplatten-Waschgerät: ist empfehlenswert, aber die Platten können auch manuell gewaschen werden. • Mikrotiterplatten-Reader: Messung der optischen Dichte (OD) in den Vertiefungen bei 450nm gegen Luft • Destilliertes Wasser: Es sollte von höchster Qualität und frei von Metallionen sein. Insert Code: E141, Version: 17 January 2008, Page 4 of 13
• Kalibrierte Mikropipetten: zum Pipettieren von 1000, 100 & 10µL. • Mehrkanal-Pipette: zum Pipettieren eines Volumens von 100µL von Konjugat, Substrat und Stopp-Lösung. • Glas- oder Plastikgefäße: zur Probenverdünnung. 7 TESTDURCHFÜHRUNG 7.1 TESTVORBEREITUNG 1. Kit auf Raumtemperatur erwärmen: • Die optimale Temperatur für die Testdurchführung liegt bei 20-24°C. • Den Kit nach Entnahme aus dem Kühlschrank ca. 60 Minuten bei Raumtemperatur stehen lassen. Die Wells dürfen erst nach Erreichen der Raumtemperatur aus dem Folienbeutel entnommen werden. Hinweis: Der Kit kann bis zu 1 Woche bei Raumtemperatur gelagert werden. 2. Kit-Komponenten Jede Kit-Komponente vor Gebrauch kurz schütteln. 3. Verdünnung des Waschpuffers (20fach-Konzentrat): 50mL Waschpuffer-Konzentrat und 950mL destilliertes Wasser (1/20- Verdünnung) in ein sauberes Gefäß geben und mischen. Es können auch entsprechend kleinere Volumina verdünnt werden. Hinweis: Der verdünnte Puffer ist bei Raumtemperatur bis zu 4 Wochen haltbar; deshalb nur die benötigte Menge verdünnen. 4. Verdünnung der Proben 10µL jeder Probe mit 1000µL Probendiluens verdünnen (1:100) und gut mischen. Hinweis: Die verdünnten Proben müssen innerhalb von 8 h gemessen werden. 5. Umgang mit Streifen und Rahmen Die benötigte Anzahl Wells aus dem Folienbeutel entnehmen und in den Rahmen setzen. Dabei von Position A1 ausgehend die Spalten von links nach rechts auffüllen. Achten Sie darauf, die langen Seiten des Rahmens zusammenzudrücken, damit die Wells nicht herausfallen können. Hinweis: Um die Kontaktzeit mit der Luftfeuchtigkeit zu minimieren, die nicht verwendeten Wells sofort in den wiederverschließbaren Folienbeutel mit dem Trockenmittel geben und gut verschließen. Darauf achten, dass der Folienbeutel nicht beschädigt wird. ACHTUNG: Kontakt mit Feuchtigkeit oder Verunreinigung durch Staub oder anderen Partikeln kann einen Antigen-Abbau verursachen. Daraus resultieren eine schlechte Präzision und potenziell falsche Ergebnisse. 7.2 TESTDURCHFÜHRUNG Alle Reagenzien in der gleichen Reihenfolge pipettieren. 1. Pipettieren der Kontrollen und Proben 100µL von jeder Kontrolle und verdünnten (1:100) Proben in das dafür laut Plattenschema vorgesehene Well pipettieren. Hinweis: Die Proben müssen so schnell wie möglich pipettiert werden, um eine ‚Assay-Drift’ zu vermeiden; die Inkubationszeit läuft ab Zugabe der letzten Probe. 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. 2. Waschen der Platte Sorgfältiges Waschen der Wells ist wichtig für eine hohe Präzision und genaue Testergebnisse. Bei nicht korrekt gewaschenen Wells können ungenaue Ergebnisse mit schlechter Präzision und hohem Hintergrund auftreten. Nach der Inkubation die Wells dreimal mit 250-350µL Waschpuffer waschen. Das Waschen kann mit einem automatischen Platten-Waschgerät oder manuell, wie nachfolgend beschrieben, erfolgen. Nach dem letzten Waschschritt die Wells durch leichtes Klopfen auf eine absorbierende Unterlage (z.B. Papiertücher) trocknen. Manuelles Waschen: a. Den Inhalt der Wells in den Ausguss schütten, dabei die langen Seiten des Rahmens zusammendrücken. b. Die Wells auf einer absorbierenden Unterlage (z.B. Papiertücher) leicht ausklopfen. c. 250-350µL Waschpuffer in der Arbeitskonzentration mit einer Mehrkanalpipette in die Wells pipettieren. d. Die Mikrotiterplatte auf einer flachen Unterlage stehend leicht schütteln. e. Zweimaliges Wiederholen der Schritte a bis d. f. Die Wells wie unter a und b entleeren. 3. Pipettieren des Konjugats 100µL Konjugat in jedes Well pipettieren. Die Ränder der Wells mit Filterpapier abtrocknen, um Spritzer zu entfernen. Hinweis: Um Verunreinigungen zu vermeiden, niemals überschüssiges Konjugat in die Konjugat-Flasche zurückgeben. 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. 4. Waschen der Platte Siehe Abschnitt 2. 5. Pipettieren von Substrat (TMB) Nach dem Waschen 100µL TMB in jedes Well pipettieren. Die Ränder der Wells mit Filterpapier abtrocknen, um Spritzer zu entfernen. Hinweis: Um Verunreinigungen zu vermeiden, niemals überschüssiges TMB in die TMB-Flasche zurückgeben. 30 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren. 6. Reaktionsende 100µL Stopp-Lösung in jedes Well pipettieren. Die Farbe schlägt von blau nach gelb um. 7. Farbmessung Die optische Dichte (OD) bei 450nm in jedem Well mit einem Mikrotiterplatten- Reader innerhalb von 30 Minuten nach Zugabe der Stopp-Lösung bestimmen. 8 ERGEBNISSE UND QUALITÄTSKONTROLLE 1. Qualitätskontrolle Nur, wenn alle nachfolgend aufgeführten Kriterien erfüllt sind, ist der Test gültig. • Alle angegebenen Kalibratoren sowie die positiven und negativen Kontrollen müssen bei jedem Testansatz mitgeführt werden. • Alle für die Kontrollen erzielten Ergebnisse müssen in dem angegebenen Wertebereich (siehe QC-Zertifikat) liegen. • Der Kurvenverlauf der erzielten Kalibrationskurve sollte in etwa dem auf dem QC-Zertifikat gezeigen entsprechen. Sind die oben aufgeführten Kriterien nicht erfüllt, ist der Test ungültig und muss wiederholt werden. 2. Berechnung der OD-Mittelwerte (Nur bei Doppelbestimmungen) Berechnen Sie für jeden Kalibrator, jede Kontrolle und jede Probe den Mittelwert aus den beiden OD-Messergebnissen. Der prozentuale Variationskoeffizient (VK%) der beiden OD-Messwerte sollte dabei jeweils unter 15% liegen. 3. Erstellung der Kalbrationskurve Die Kalibrationskurve kann automatisch oder manuell erstellt werden, indem man die Anti-Cardiolipin-Autoantikörper-Konzentrationen (logarithmische Skala) halblogarithmisch gegen die zugehörigen OD-Werte der Kalibratoren (lineare Skala) aufträgt. • Automatisch – verwenden Sie eine geeignete und validierte Software und die die Daten am besten widerspiegelnde Kurvenanpassung. • Manuell – verwenden Sie halblogarithmisches Millimeterpapier und zeichen Sie eine glatte Kurve durch die Punkte (keine Gerade oder Punkt-zu-Punkt- Verbindung). 4. Handhabung abweichender Kalibrationspunkte Sollte irgendein Messpunkt nicht auf der Kurve liegen, kann er gestrichen werden. Hat diese Streichung allerdings zur Folge, dass der Kurvenverlauf von dem im QC-Zertifikat vorgegebenen abweicht, oder müssten mehrere Punkte der Kalibration gestrichen werden, sollte die gesamte Kalibration wiederholt werden. 5. Berechnung der Autoantikörper-Konzentrationen in den Kontrollen und Proben Lesen Sie die Anti-ß2GP1-Autoantikörper-Konzentrationen in den Kontrollen und verdünnten Patientenproben direkt aus der Kalibrationskurve ab. Die Kontrollwerte sollten in den im QC-Zertifikat vorgegebenen Konzentrationsbereich fallen. Hinweis: Die Standardprobenverdünnung von 1:100 ist in der Kalibrationskurve bereits berücksichtigt. Es sind keine weiteren Korrekturen nötig. 6. Kalibration des Tests Der Test ist gegen einen intenternen Standard kalibriert (in U/mL), da kein anerkannter internationaler Standard verfügbar ist. 7. Grenzen des Tests • Die Testergebnisse können nicht als diagnostischer Beweis für das Vorhandensein bzw. Nichtvorhandensein einer Krankheit verwendet werden. • Falls der Nachweis von ß 2 GP1-Autoantikörpern im Serum trotz klinischer Indikationen negativ ausfällt, ist eine Testung auf Anti-Cardiolipin-Antikörper, Lupus Antikoagulans oder einen weiteren Test erforderlich. • Die Behandlung eines Patienten darf nicht allein aufgrund eines positiven ß 2 GP1-Ergebnisses begonnen werden; sie muss auch klinisch indiziert sein. 9 LEISTUNGSDATEN 9.1 PRÄZISION Die Intra-Assay-Präzision wurde durch eine 20-fache Messung von 6 innerhalb der Kalibrationskurve liegenden Proben in einem Assay ermittelt. Die Konzentrationen und Variationskoeffizienten (VK%) jeder einzelnen Probe sind nachfolgend aufgelistet: INTRA-ASSAY PRÄZISION n=20 Konzentration (U/mL) VK % Probe 1 6,4 5,8 Probe 2 16,0 2,9 Probe 3 20,5 2,9 Probe 4 37,4 4,6 Probe 5 48,7 3,6 Probe 6 66,4 4,1 Für die Bestimmung der Inter-Assay-Präzision wurden sechs Proben in Doppelbestimmung in 6 verschiedenen Testansätzen in einem Zeitraum von 3 Tagen gemessen. Die Konzentrationen und Variationskoeffizienten (VK%) jeder einzelnen Probe sind nachfolgend aufgelistet. INTER-ASSAY PRÄZISION n=6 Konzentration (U/mL VK % Probe 1 6,1 10,7 Probe 2 15,8 3,6 Probe 3 19,5 5,1 Probe 4 37,9 4,4 Probe 5 49,3 3,7 Probe 6 65,4 2,6 9.2 NORMALBEREICH Die Serumwerte an ß 2 GP1 IgA-Autoantikörpern wurden bei je 100 männlichen und 100 weiblichen normalen Blutspendern bestimmt; die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Graphik dargestellt. Basierend auf einem positiven Cut-off-Wert von 20,0 U/mL waren zwei Proben positiv; dieses positive Ergebnis wurde mit einem alternativen anti-ß 2 GP1-IgA-Kit jeweils bestätigt. Anzahl an Proben 120 100 80 60 40 20 0 20,0 IgA Anti-ß 2 GP1 U/mL Dieser Normalbereich dient nur zur Orientierung. Jedes Labor sollte seine eigenen Normalbereiche festlegen. Insert Code: E141, Version: 17 January 2008, Page 5 of 13
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Page 3: 9.6 INTERFERING SUBSTANCES A range
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Page 11 and 12: 2. Componentes del kit Mezcle cuida
Page 13: Plate Template Plattenschema Plan d

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