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9.3 SPEZIFITÄT, SENSITIVITÄT UND ÜBEREINSTIMMUNG Die relative Spezifität, Sensitivität und Übereinstimmung wurde im Vergleich zu einem alternativen Anti-ß 2 GP1 IgA-Kit anhand von 114 klinischen und normalen Proben bestimmt. Diese Proben stammten von 46 SLE-Patienten, die zuvor auf Antiphospholipid-Antikörper positiv getestet worden waren, 8 Patienten mit primärem Antiphospholipid-Syndrom (APS), 20 RA-Patienten, 20 SLE- Patienten mit unbekanntem APS-Status und 20 gesunden Blutspendern. Die Bewertung der Proben erfolgte beim BINDAZYME IgA S Assay bei einem grenzwertigen „Grauzonenbereich“ von 15-20 U/mL und eines positiven Cut-off- Wertes von 20,0 U/mL bzw. dem im Alternativtest angegebenen Cut-off. EIA BINDAZYME Anti-β 2 GP1 IgA S EIA Alternativer EIA + *Grenzwertig - + 18 2 1 Grenzwertig 3 3 3 - 1^ 5 78 Relative Sensitivität 94,7% Relative Spezifität 98,7% Relative Übereinstimmung 98,0% *Die im grenzwertigen Konzentrationsbereich liegenden Proben wurden bei der Auswertung nicht berücksichtigt ^Die eine unterschiedlich befundete Probe war bei Testung mit einem weiteren Kit negativ. 9.4 ANALYTISCHE SENSITIVITÄT Der Beweis, dass der Anti-ß 2 GP1 IgA S auch noch zwischen zwei Proben mit Werten im unteren Messbereich (173 und 199% des niedrigsten Kalibrators) unterscheiden kann, wurde durch statistische Analyse (t-Test, Vergleich von Mittelwerten aus unabhängigen Stichproben) der Ergebnisse mehrfacher Messungen jeder einzelnen Probe erbracht. 9.5 MESSBEREICH Der Messbereich des Kits liegt zwischen 3,7 und 300 U/mL. 9.6 INTERFERIERENDE SUBSTANZEN Anti-ß 2 GP1 IgA negative und positive Seren wurden mit verschiedenen interferierenden Substanzen versetzt und anschließend mit diesem Kit gemessen. Hierzu wurde ein Interference Check A Plus TM (Kokusai Shiyaku, Japan) verwendet. Substanz Bilirubin F (frei) Bilirubin C (konjugiert) Hämolysiertes Hämoglobin Chylus (Milchsaft) Rheumafaktor Konzentration 18,0 mg/dL 19,3 mg/dL 482 mg/dL 1430 FT Units 50,0 IU/mL 12 PLATTENSCHEMA Siehe Ende der Arbeitsanleitung. KURZARBEITSANLEITUNG 1. 100µL von jeder Kontrolle und 1:100 verdünnten Probe in das entsprechende Well pipettieren. 30 Minuten inkubieren. Waschen. 2. 100µL Konjugat in jedes Well geben. 30 Minuten inkubieren. Waschen. 3. 100µL Substrat in jedes Well geben. 30 Minuten im Dunkeln inkubieren. 4. 100µL Stopp-Lösung in jedes Well pipettieren. Absorption bei 450nm messen. BINDAZYME ist ein Warenzeichen von The Binding Site Ltd., UK. P.O. Box 11712, Birmingham B14 4ZB. England Bei keiner der eingesetzten Substanzen wurde ein interferierender Einfluss in den getesteten Proben beobachtet. 10 ERWARTETE WERTE Der positive Cut-off-Wert für den Anti-ß 2 GP1 IgA S Assay wurde basierend auf den Messergebnissen der Serumproben von 100 männlichen und 100 weiblichen Blutspendern bei einem grenzwertigen „Grauzonenbereich“ von 15,0 - 20,0 U/mL mit 20,0 U/mL festgelegt. Diese Bereiche dienen nur zur Orientierung. ELISAs sind sehr sensitive Tests, die kleinste Unterschiede in Probenpopulationen erkennen können. 11 REFERENZEN IgA Anti-ß 2 GP1 < 15,0 U/mL Negativ 15,0 - 20,0 U/mL Grenzwertig > 20,0 U/mL Positiv 1. Miyakis S, Lockshin MD, Atsumi T, Branch DW, Brey RL, et al. (2006). International concensus statement on an update of the classification criteria for definite antiphospholipid syndrome. J Thromb Haemost; 4: 295-306. 2. Galli M, Comfurius P, Maassen C, Hemker HC, de Baets MH, et al. (1990). Anticardiolipin antibodies (ACA) directed not to cardiolipin but to a plasma protein cofactor. Lancet; 335: 1544-7. 3. McNeil HP, Simpson RJ, Chesterman CN & Krilis SA. (1990). Anti-phospholipid antibodies are directed against a complex antigen that includes a lipid-binding inhibitor of coagulation: beta 2-glycoprotein I (apolipoprotein H). Proc Natl Acad Sci USA; 87:4120-4124. 4. Schousboe I. (1985). β 2 -Glycoprotein I: A plasma inhibitor of the contact activation of the intrinsic blood coagulation pathway. Blood; 66: 1086-1091. 5. Nimpf J, Bevers EM, Bomans PH, Till U, Wurm H, et al. (1986). Prothrombinase activity of human platelets is inhibited by β 2 -glycoprotein-I. Biochim. Biophys. Acta; 884: 142-149. 6. Nimpf J, Wurm H & Kostner GM. (1987). β 2 -Glycoprotein-I (apo-H) inhibits the release reaction of human platelets during ADP-induced aggregation. Atherosclerosis; 63: 109-114. 7. Matsuura E, Igarashi Y Yasuda T, et al. (1994). Anticardiolipin antibodies recognize beta 2-glycoprotein I structure altered by binding with an oxygenated modified solid phase surface. J Exp Med; 179:457-462. 8. Matsuura E, & Koike T. (1996) in: Autoantibodies, pp 109-114, Peter JB & Shoenfeld Y (eds), Elsevier Science, Amsterdam. 9. Protein Reference Unit Handbook of Autoimmunity (3rd Edition) 2004 Ed A Milford Ward. J. Sheldon, GD Wild. Publ. PRU Publications, Sheffield. 14. Insert Code: E141, Version: 17 January 2008, Page 6 of 13
INSTRUCTIONS D’UTILISATION Coffret BINDAZYME S de dosage des anticorps humains Anti β 2 GP1 IgA S MK141 Pour un usage en diagnostic in-vitro Produits fabriqués par: The Binding Site Ltd, PO Box 11712, Birmingham B14 4ZB, UK www.bindingsite.co.uk Distribués en France par la société : The Binding Site, 14 rue des Glairaux, BP226, 38522 Saint-Egrève Cedex. Téléphone : 04.38.02.19.19 Fax : 04.38.02.19.20 e-mail: info@bindingsite.fr 1 INDICATIONS Ce coffret permet de mesurer in vitro les autoanticorps IgA spécifiques dirigés contre la ß 2 -glycoproteine 1 (ß 2 GP1) du sérum humain. Ce coffret doit être utilisé en conjonction avec d’autres tests sérologiques et informations cliniques pour aider au diagnostic chez les patients présentant par exemple un risque thrombotique; syndrome primaires des antiphospholipides (SAPL) ou consécutif à un lupus érythémateux disséminé (LED). Ce coffret permet de tester au maximum 41 échantillons en double ou 89 en simple, avec une courbe de calibration, un contrôle positif, un contrôle négatif. 2 PRESENTATION GENERALE Le SAPL est caractérisé par des symptômes tels que des thromboses artérielles et veineuses et/ou des morts fœtales récurrentes en association avec la présence d’anticorps antiphospholipides (aPL) 1 . Les aPL comprennent toute une gamme d’autoanticorps qui se fixent aux cardiolipides seuls, aux cardiolipides complexés à un cofacteur et au cofacteur seul. Ce cofacteur a été identifié comme étant une protéine plasmatique de 50kD, la β 2 GP1 (apolipoprotéine H) 2,3 . La β 2 GP1 inhibe la voie intrinsèque de la coagulation 4 , se fixe aux plaquettes 5 et inhibe l’agrégation des plaquettes médiées par les ADP 6 . Les autoanticorps anticardiolipides des patients atteints de LED et de SAPL primaire se fixent à une forme altérée de la β 2 GP1 produite par l’interaction avec des phospholipides 7 chargés négativement. Cette β 2 GP1 modifiée peut être reproduite en fixant de la β 2 GP1 directement dans les plaques de polystyrène 7 , lorsque le regroupement ou la forte densité de l’antigène permet un accrochage des autoanticorps bi ou polyvalent et la détection par des méthodes ELISA. Eliminer les phospholipides et utiliser uniquement la β 2 GP1 sous ce format permet d’avoir un test avec une spécificité accrue pour le SAPL du fait de leur prédominance chez les patients atteints de le SAPL 8 . Récemment, les IgG et les IgM anti-β 2 GP1 ont été inclus dans les critères d’identification de le SAPL, quand ceux-ci sont présents à un taux suffisamment élevé 1 . Il a aussi été admis que les IgA anti-β 2 GP1 sont les anticorps spécifiques les plus fréquemment detéctés chez les patients de certains groupes ethniques 1 . 3 PRINCIPE DU TEST Les micropuits sont recouverts de l’antigène ß 2 GP1. Les contrôles et les échantillons dilués sont déposés dans les puits permettant ainsi la liaison spécifique de l’anticorps à l’antigène fixé ß 2 GP1 pendant la première incubation. Après avoir rincé les puits pour éliminer toutes traces de protéines non accrochées, un anticorps de lapin anti IgG (spécifique de la chaîne γ) humain purifié par affinité et conjugué à la péroxydase est déposé. Le conjugué se fixe aux autoanticorps humains capturés puis l’excès de conjugué non fixé est éliminé par une étape de lavage supplémentaire. Le conjugué fixé sera visualisé lors de l’ajout du substrat 3,3’,5,5’ tetramethylbenzidine (TMB) qui donne une coloration bleue après réaction, l’intensité de celle-ci est proportionnelle à la concentration en autoanticorps de l’échantillon. De l’acide phosphorique est ajouté dans chaque puits pour stopper la réaction. Cela produit une couleur finale jaune, qui sera lue à 450nm. 4 PRECAUTIONS 4.1 AVERTISSEMENTS • Tous les sérums des donneurs humains ont subi un dépistage négatif pour les anticorps anti-VIH 1 et 2, les anticorps anti-VHC et l’Ag HBs. Toutefois, ces tests ne peuvent garantir une absence totale d’agents infectieux. De bonnes méthodes de manipulation et d’élimination doivent être établies et seul un personnel qualifié dans la manipulation d’échantillons potentiellement infectieux devrait être autorisé à utiliser ce coffret. • L’azide de sodium peut réagir avec les tuyauteries en plomb ou cuivre et former des azides de métaux explosifs. Il est nécessaire d’ajouter de grands volumes d’eau pour éviter la formation d’azides. • Les tampons et sérums fournis dans ce coffret contiennent plusieurs inhibiteurs d’enzymes listés ci-dessous. Les manipuler avec précautions. INHIBITEURS CONCENTRATION Kathon Sodium Azide ProClin 300 Bromonitrodioxane Methylisothiazone 0.02% 0.099% 0.045% 0.002% 0.002% ProClin est une marque déposée de Rohm and Haas Corp. Philadelphia, PA • Le kathon est un irritant et peut induire une sensibilisation en cas de contact avec la peau. • La solution d’arrêt contient de l’acide phosphorique 3M qui est un irritant. Eviter le contact avec la peau et les yeux. • Les éclaboussures de réactifs doivent être nettoyées en respectant la réglementation légale et environnementale. 4.2 PRECAUTIONS • Ce coffret doit être utilisé par un personnel formé. • Il est recommandé de suivre scrupuleusement le protocole. Toute déviation par rapport à celui-ci peut affecter les performances et les résultats obtenus. Lire attentivement les ‘Notes’ et les avertissements dans cette fiche technique. • Les réactifs et les plaques des coffrets ayant des numéros différents ne sont pas interchangeables. La substitution d’un des réactifs peut induire des résultats incorrects. Toutes les barrettes doivent être issues du même sachet. • Afin d’éviter la contamination des réactifs, utiliser uniquement de nouveaux récipients ou des récipients propres en verre ou en plastique. Ne jamais remettre les réactifs non utilisés dans leur flacon d’origine. • Eviter de laisser les flacons ouverts; l’évaporation ou la contamination des réactifs peut induire des résultats incorrects. • Le substrat TMB ne doit pas être exposé à la lumière ou mis en contact avec de l’eau. • Les échantillons hémolysés, lipidiques, contaminés par des bactéries ou contenant des particules de matières ne doivent pas être utilisés. • Les dilutions des échantillons ne peuvent pas être vérifiées car les contrôles du coffret sont prêts à l’emploi. L’utilisation de pipettes calibrées et de contrôles qualité internes est recommandée. • L’utilisation d’automates, de diluteurs et d’autres équipements automatiques peut induire des différences de résultats par rapport à la technique manuelle. Il est de la responsabilité de chaque laboratoire de valider complètement le système et de s’assurer que les résultats sont conformes à la fiche technique et au certificat de contrôle qualité. • Tous les équipements doivent être calibrés et suivis selon les recommandations du fournisseur. 4.3 STOCKAGE ET STABILITE • Ce coffret doit être conservé à 2-8°C et ne doit pas être congelé. Des températures de conservation inappropriées peuvent affecter les résultats. • Le tampon de lavage dilué dans un récipient propre peut être conservé à température ambiante (20-24°C) pendant 4 semaines. • La date de péremption du coffret se trouve sur l’étiquette extérieure 5 ECHANTILLONS • Les échantillons doivent être prélevés par ponction veineuse et le sérum doit être séparé après coagulation. • Les sérums peuvent être conservés à 2-8°C jusqu’à 7 jours avant les tests 9 , ou aliquotés et congelés à -20°C pour une conservation prolongée. • Des congélations et décongélations répétées doivent être évitées. • Les sérums ne doivent pas être inactivés par la chaleur, ceci peut induire de faux positifs. 6 MATERIEL 6.3 MATERIEL FOURNI Chaque coffret contient les produits spécifiques ci-dessous: • Une fiche technique : donnant tous les détails de la technique. • Un certificat de contrôle qualité : indiquant les performances attendues du lot. • ß 2 GP1 S Coated Wells (puits) : 12 barrettes de 8 puits sécables coatés avec de l’antigène β 2 GP1. Chaque plaque est emballée dans un étui contenant deux dessiccateurs. • APS Sample Diluent (diluant échantillon pour SAPL) : 2 flacons contenant 50mL de tampon pour diluer les échantillons. Coloré en jaune et prêt à l’emploi. • APS Wash Buffer (Tampon de lavage pour SAPL) : 1 flacon contenant 50mL de tampon concentré 20 fois pour le lavage des puits. • β 2 GP1 IgA S Calibrators (Calibrateurs β 2 GP1 IgG S) : 5 flacons, chacun contenant 1.2mL de sérum humain dilué avec les concentrations en autoanticorps anti-β 2 GP1 suivantes: 300; 100; 33,3; 11,1; 3,7 U/mL. Prêts à l’emploi. • β 2 GP1 IgA S Positive Control (Contrôle Positif β 2 GP1 IgA S) : 1 flacon contenant 1.2mL de sérum humain dilué. La valeur attendue est inscrite sur le certificat de contrôle qualité. Prêt à l’emploi. • β 2 GP1 S Negative Control (Contrôle Négatif): 1 flacon de contenant 1.2ml de sérum humain dilué. La valeur attendue est inscrite sur le certificat de contrôle qualité. Prêt à l’emploi. • β 2 GP1 IgA S Conjugate (Conjugué β 2 GP1 IgA S) : 1 flacon contenant 12mL d’anticorps marqué à la péroxidase purifié. Coloré en vert. Prêt à l’emploi. • TMB Substrate (Substrat TMB) : 1 flacon contenant 14mL de substrat TMB. Prêt à l’emploi. • Stop Solution (Solution d’arrêt) : 1 flacon contenant 14mL d’acide phosphorique 3M. Prêt à l’emploi. 6.2 MATERIEL NECESSAIRE - non fourni • Laveur automatique de plaque : recommandé, cependant les lavages manuels sont également possibles. • Lecteur de microplaques : capable de mesurer la densité optique à 450nm. • Eau distillée ou eau désionisée : elle doit être de très bonne qualité. • Micropipettes calibrées : pour la distribution de volumes de 1000, 100 et 10µL. • Pipette multicanaux : recommandée pour la distribution de volumes de 100µL de conjugué, de substrat et de solution d’arrêt. • Tubes en verre ou plastique : pour la dilution des échantillons. 7 PROCEDURE 7.1 ETAPES PREALABLES 1. Ramener le coffret à température ambiante • Le coffret est opérationnel à température ambiante (20-24°C). • Sortir le coffret et le ramener à température ambiante pendant approximativement 60 minutes. Ne pas retirer les puits de leur sachet aluminium durant cette période. Attendre que les barrettes soient à température ambiante. Note : Le coffret peut être maintenu à température ambiante au plus 1 semaine. 2. Composants du coffret Mélanger doucement chaque composant du coffret avant utilisation. 3. Tampon de lavage Ajouter 50mL de tampon de lavage concentré à 950mL d’eau distillée (dilution Insert Code: E141, Version: 17 January 2008, Page 7 of 13
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