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GETU Etapes du projet et Bases Méthodologiques L’objectif général de ce projet est de caractériser sur le plan moléculaire et génétique, les tumeurs urothéliales de la vessie au diagnostic initial en fonction de l’intoxication tabagique et de l’exposition professionnelle. Les objectifs spécifiques sont : 1. d’identifier des mécanismes exogènes et endogènes de carcinogenèse vésicale en fonction des mutations de p53 et de FGFR3 2. de caractériser d’autres altérations génétiques ou moléculaires connues ou non, en fonction des expositions et du génotype p53/ FGFR3 par l’utilisation des techniques d’analyse à haut débit : puce a tissus, puce à ADN (transcrits et CGH) 3. d’identifier des signatures d’exposition professionnelles et ou de l’intoxication tabagique, et de disposer de marqueurs étiologiques 4. d’améliorer la prise en charge de ces tumeurs par une classification moléculaire tenant également compte des facteurs étiologiques. La Méthodologie Collection biologique, caractéristiques anatomocliniques, épidemiologiques et analyses : Les données clinico-pathologiques (endoscopiques et histologiques) ont fait l’objet d’un consensus urologique et anatomopathologique dans le cadre du Comité de Cancérologie de l’Association Française d’Urologie, résumé dans le rapport de l’AFU sur les tumeurs superficielles rédigé en 2001 par D Chopin et B Gattegno. L’ensemble de ces variables codées de façon exclusive est relevé sur une base de données relationnelle anonymisée. Les données épidémiologiques font l’objet d’un questionnaire standardisé recueilli auprès des patients par des enquêteurs et sont analysées en aveugle par une équipe de Médecine du Travail, de l'Institut Inter Universitaire de Médecine du Travail de Paris, Ile de France. Tumorothèque : Ce projet s’appuie donc sur la constitution d’une banque de tissus et de sang total. Les prélèvements proviennent de trois hopitaux : Bichat, Tenon et Henri Mondor. Ils sont centralisés dans le cadre de la tumorothéque des services de pathologie respective. Actuellement nous utilisons une technique de triple extraction qui permet d’isoler, à partir d’un même prélèvement broyé dans le thiocyanate de guanidine, à l'aide d'un gradient de chlorure de césium, l’ADN, l’ARN et les protéines. L’isolement de l’ADN contrôle est réalisé à partir du sang total. Cette méthodologie nous permet d’avoir accès non seulement aux anomalies de l’ADN, mais également à l’ARN et pour une partie aux protéines. L’inconvénient de cette technique est son coût en consommables et temps technique. Cependant la qualité d’obtention du matériel permet la conservation et le transport des échantillons dans les différents laboratoires impliqués dans l’étude. Mutations : Les tumeurs utilisées dans ce projet seront génotypées pour P53 et FGFR3 qui caractérisent deux voies spécifiques de carcinogenèse utilisant la technique de DHPLC. Après amplification de l’ADN par réaction de polymérisation en chaîne (PCR), nous avons réalisé une PCR de l’ADN tumoral et génomique pour chaque prélèvement et pour chaque exon étudié. Dans le cas de P53, nous avons étudié les exons 2 à 11 et en ce qui concerne le FGFR3, les exons 7, 10 et 15. En ce qui concerne les mutations de P53, on utilise une matrice de 100 nanogrammes de l’ADN génomique. Les amorces utilisées dans l’étude des mutations du gène P53 et FGFR3 ont fait l’objet de publications. Utilisation des Puces à ADN : L'analyse des nouveaux gènes potentiellement impliqués dans les groupes de tumeurs que nous avons définis sera effectuée dans le cadre de la plateforme de l’IFR10 de Créteil. Pour l’analyse du transcriptome, les puces Affymetrix U133 Plus seront utilisées avec 5 µg d’ARN par échantillon. Pour l’analyse du génome, nous utiliserons les puces CGH produites par le laboratoire de Dan Pinkel UCSF, les expériences que nous avons déjà effectuées sur quarante échantillons montrent que 300ng d’ADN par hybridation sont suffisants. Tissu Micro-Arrays/Immunohistochimie : La constitution de tissu micro-array apparaît comme indispensable pour évaluer rapidement les gènes candidats identifiés par les puces à ADN. On considère que 3 prélèvements par tumeurs sont souhaitables pour avoir un échantillon représentatif. Les analyses immunohistochimiques seront dans certains cas particuliers effectuées sur coupes congelées. Nous étudierons en particulier les voies de signalisation des EGFs (ligands, récepteurs). 12
GETU Analyse : Une des étapes limitantes dans les études faisant appel à la technologie des puces est l’analyse. Nous avons mis en place des outils d’analyse en collaboration notamment avec l’Institut Curie (UMR144) et la société ISoft dans le cadre d’un projet financé par le ministère de la Recherche (Biogen 74, Réseau GenHomme – BioIngénierie 2001). Ce projet initial a été poursuivi dans le cadre d’un projet européen (http://isoft.free.fr/hkis/) et une plate-forme d’analyse sera disponible au mois d’Octobre Nombre de sujets nécessaires /nombre de prélèvements : Dans la précédente étude épidémiologique nous avons pu collecter 150 prélèvements sang/tumeurs sur 250 patients inclus. L’objectif est de disposer de 300 prélèvements compte tenu de l’expérience acquise et de la sélection des centres structurés pour la collection de prélèvement dans le cadre de la démarche tumorothèque à l’AP-HP ,nous estimons raisonnable de collecter sur ces 3 centres 200 cas incidents sur 2 ans. Nous estimons ainsi disposer de 60 cas de tumeurs de non fumeurs et de 60 cas de patients exposés a des carcinogènes professionnels. Le génotypage des tumeurs a été effectuée sur 110 cas et le sera sur l’ensemble des prélèvements réalisés. L’analyse genomique sera réalisé sur 3 groupes de 60 tumeurs non-fumeurs/Exposés/fumeurs Résultats attendus L'analyse des altérations génétique et moléculaire des gènes critiques des tumeurs urothéliales dans le cadre de ce projet pourrait : - Apporter une aide pour relier les expositions aux carcinogènes au processus tumoral - Proposer une prise en charge médico-sociale optimale chez les patients en améliorant la reconnaissance de leur origine professionnelle - Apporter les bases moléculaires pour la compréhension de la carcinogenèse urothéliale et l’identification de cibles moléculaires V. Thérapie Cellulaire de l’Incontinence Urinaire par Insuffisance sphincterienne Activités de Recherche . Dr R Yiou Evaluation de l'autogreffe de cellules précurseurs musculaires dans un modèle d'insuffisance sphinctérienne urétrale chez la truie. L’incontinence urinaire d’effort affecte 10% des femmes actives et 40% des femmes de plus de 60 ans, soit au total près d’1,5 millions de femmes en France. Les dépenses publiques allouées à l’incontinence urinaire s’élèvent à plus de deux milliards d’euros par an en France. Il s’agit donc d’un véritable problème de santé publique. Les principaux facteurs étiologiques de l’incontinence urinaire sont les traumatismes obstétricaux, les accouchements multiples et la chirurgie pelvienne, en raison des dommages musculaires et aponévrotiques qu’ils engendrent. Une hypermobilité vésico-urétrale et/ou une insuffisance sphinctérienne urétrale sont présentes dans la majorité des cas. L’insuffisance sphinctérienne urétrale est le résultat d’une baisse du tonus sphinctérien. Parmi les principales options thérapeutiques – médicaments, rééducation et chirurgie – seule la chirurgie a démontré une réelle efficacité dans les formes sévères d’insuffisance sphinctérienne. La mise en place d’une bandelette sous urétrale synthétique ou aponévrotique ou l’injection péri urétrale de substances inertes, visant à augmenter la résistance à l’écoulement urinaire, constituent les traitements chirurgicaux de premières intentions. Cependant, le taux de récidives à long terme de ces techniques est relativement élevé. Chez l’homme, l’incontinence urinaire survient habituellement après une intervention sur la prostate lorsque le sphincter urétral a été lésé. La rééducation ou des injections péri urétrales sont rarement efficaces et la seule possibilité thérapeutique est bien souvent la mise en place d’un sphincter artificiel. V.1 Justification de la recherche Nous proposons une nouvelle stratégie thérapeutique de l’insuffisance sphinctérienne visant à augmenter le tonus sphinctérien par une autogreffe de cellules précurseurs musculaires (cpm). L’insuffisance sphinctérienne urétrale peut être considérée comme une myopathie complexe affectant un petit muscle et est donc candidate pour un traitement par injection de cpm. 13
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