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GETU urothéliale. Utilisant à partir du 15 ème jour nous avons réalisé des cultures à confluence nous avons réalisé des blessures circulaires de 4 mm de diamètre la régénération a été étudiée dans un milieu défini grâce à un analyseur d'images à 4, 24 et 28 heures. La prolifération a été étudiée par incorporation de Brdu et l'expression des facteurs de croissance par RT-PCR. Le rôle du récepteur à l'EGF a été étudié utilisant des anticorps bloquants ainsi que des inhibiteurs de l'activité tyrosine kinase de ce récepteur (AG1478). Nous avons étudié le rôle de l'amphiréguline de l'EGF du TGF-α et de l'HBEGF à des doses réceptives de 20 ng/ml, 100 ng/ml ml, 20 ng/ ml et 20 ng/ml. Dans ce modèle la cicatrisation spontanée est obtenue en 48 heures. Elle est inhibée par l'AG418 et les anticorps de 50 et 30 % respectivement. Cette inhibition s'accompagne d'une inhibition de la prolifération et de la migration cellulaire. La régénération est marquée par une augmentation de production de gène HBEGF au niveau des ARN sans changement au niveau de la quantité du récepteur. Cette cicatrisation est accélérée par l'addition exogène de TFG-α HB-EGF et TGF-α. Il n'y a pas d'effet de l'EGF par luimême. Ces résultats montrent qu'il existe une boucle autocrine impliquant le récepteur à l'EGF et l'HBEGF dans la cicatrisation urothéliale et que le récepteur à l'EGF est donc une cible potentielle pour contrôler la prolifération des cellules urothéliales Figure 1 : Effet d’un inhibiteur de l’EGFR (AG1478) sur la cicatrisation urotheliale A 4h B 24h C 48h Serum free D E F AG1478 IV 1. 2.2 - Modèle in vitro de la thérapie ciblée des tumeurs urothéliales sur le récepteur à l'EGF La surexpression du récepteur à l'EGF au cours de la cancérogénèse et de la progression des tumeurs urothéliales est bien établie. Nous avons mis en évidence une relation entre la surexpression du récepteur à l'EGF et la prolifération cellulaire ainsi que le pronostic. Nous avons également établi une lignée cellulaire qui présente une amplification du gène de récepteur et qui répond aux facteurs de croissance de la famille de l'EGF (lignée 1207). Ces éléments associés au rôle du récepteur à l'EGF dans la cicatrisation urothéliale nous a amené à étudié le rôle des inhibiteurs spécifiques du récepteur à l'EGF comme thérapeutiques potentielles dans le cancer urothéliale. En collaboration avec les laboratoires Astra Zeneca, nous avons étudié les faits du Gefitinib (Iressa). Nous avons étudié l'expression des récepteurs Erb-B (1, 2 et 3) sur 6 lignées cellulaires (D24, J82, RT112, SD 24 SD148 10-07). Il existe une corrélation entre le niveau d'expression des transcrits et le niveau des protéines. Parmi les ligands exprimés de façon endogène par ces lignées cellulaires, le TGF-α, l' HEBGF et l'amphériguline sont les plus importants. L'EGF est peu ou pas exprimé. L'Epiréguline est exprimé dans SD24 et SD148. Nous avons observé en utilisant deux inhibiteurs l'AG14 78 et le ZT 18 39, un effet significatif sur la prolifération est observé avec les lignées 64 7V et 1207. Ces résultats montrent alors qu'il existe un effet dose du ZT 18 89 sur la lignée 1207 avec une IC50 à 0,25 µM. Cette diminution de la prolifération s'associe à une augmentation de la proportion des cellules en phase GA. 8
GETU Les résultats de l'étude de la signalisation du récepteur à l'EGF montrent que la sensibilité aux inhibiteurs de ce récepteur n'est pas liée à son expression mais à son activation. En effet, seules les lignées 64 7V et 1207 possèdent une autophosphorylation du REGF avec une activation de la voie des MAK et également de la voie Akt qui est impliquée dans la résistance à l'apoptose. Nous avons étudié la phosphorisation spontanée du récepteur de la Tyrosine 1068 sur 29 tumeurs urothéliales de la vessie et cette phosphorisation est retrouvée dans 46 % des tumeurs superficielles et 81 % des tumeurs invasives. Ces résultats suggèrent que l'effet du Gefitinib (Iressa, ZD 1839) ne dépend pas de l'expression du récepteur mais de l'incubateur spécifique de sa voie de signalisation. Cette observation peut avoir des implications cliniques importantes pour l'utilisation de ces nouvelles moléculaires en cancérologie. a) Figure 2 a et b : Inhibition dose dépendante de la viabilité et de la phosphorylation Du REGF par ZD1839. Inhibitory effect of IRESSA 100 inhibition (%) 80 60 40 20 1207 0 0 0,5 1 1,5 2 Concentration (µM) b) Dans le cadre de ce projet, nous voulons préciser les indications de la thérapie ciblée sur l'EGFR dans les tumeurs urothéliales de la vessie. 9
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