Oncognse des tumeurs respiratoires et urognitales - Service d ...

GETU
f- Mise au point d’un dosage ELISA de la Protocadhérine-PC
La poursuite de l’obtention d’anticorps monoclonaux sera de mettre au point un dosage ELISA. Nous
disposons un appareil, le BIAcore, nous permettant d'analyser l'affinité des anticorps vis-à-vis de la
protocadhérine-PC et de les sélectionner ensuite en fonction de leur reconnaissance aux différents
épitopes. Cette première étape nous permettra d'isoler les anticorps intéressants qui seront ensuite
utilisés dans la mise au point du test d'ELISA. L'anticorps ayant la meilleure affinité vis-à-vis de la
protocadhérine-PC sera fixé sur plaque de 96 puits et utilisé pour la capture de la protéine
recombinante. Après lavage des protéines non fixées, la détection du complexe antigène/anticorps se
fera par l'incubation avec un mélange de plusieurs anticorps monoclonaux biotinylés, suivie d'une
étape de révélation avec de la streptavidine couplée à un traceur fluorescence.
g- Création d’une banque de Tissue MicroArrays
La technique des tissue microarrays est un outil performant, rapide et rentable pour étudier l’intérêt
clinique des nouvelles molécules Elle a pour finalité de concentrer sur 1 lame plusieurs centaines
d’échantillons pouvant provenir de plusieurs centaines de patients différents (voir principe ci après).
Nous avons entrepris, sur la cohorte de patients du service d’urologie de l’Hôpital Henri Mondor, en
collaboration avec le service d’anatomopathologie, de réaliser une puce à tissu comprenant 30
échantillons d’adénome de la prostate obtenus après résection transuréthrale de la prostate ou
adénomectomie, 250 tissus de cancer de la prostate au stade localisé (après prostatectomie radicale par
voie coelioscopique ou par voie rétropubienne) et 50 tissus de patients présentant un cancer de la
prostate en hormono-échappement ayant bénéficié d’une résection transuréthrale de la prostate pour
obstacle sous vésical. Pour chacun de ces patients, les données cliniques et anatomopathologiques sont
collectées sur fichier informatisé anonymisé qui a permis l’évaluation des différentes techniques
chirurgicales utilisées dans le service d’urologie.
h- Place de la protocadhérine-PC dans le cancer de la prostate en échappement hormonal
La comparaison de l’expression de la protocadhérine-PC aux autres molécules impliquées dans le
cancer de la prostate en échappement hormonal sera étudiée par RT-PCR quantitative et/ou
immunohistochimie. Les transcrits concernés sont ceux : du récepteur des androgènes ; des familles de
facteurs de croissance et de leurs récepteurs comme EGF, FGF, IGF et HARP ; certains marqueurs
neuroendocriniens comme l’adrénomédulline, des marqueurs des gènes de résistance à l’apoptose
comme bcl2 et la clustérine.
IV.1. 2. Oncogénèse urothéliale. D., Chopin, J.L Lagrange, D. Vordos
Deux types de recherches sont développées :
• l’utilisation de modèles in vitro pour évaluer de nouvelles thérapeutiques
• l’étude des altérations moléculaires et génétiques des tumeurs urothéliales dans un but
étiopathogénique et pronostique
IV.1. 2.1 - Modèles in vitro de culture de l'urothélium
Nous avons étudié la croissance, la différentiation et la sénescence de l'urothélium humain normal
dans un modèle de culture pseudo organo typique. Des explants d'urothélium humain normal ont été
micro disséqués et placés sur des membranes semi poreuses prétraitées par différents composants de la
matrice extra cellulaire avec un milieu défini. Ces cultures ont été maintenues pour une durée de 30
jours pendant laquelle nous avons étudié la prolifération cellulaires par l'incorporation de Brdu, la
différentiation par l'expression des cytokératines et de l'uroplakine. Nous avons également étudié
l'expression des facteurs de croissance de la famille de l'EGF par RT-PCR quantitative, ainsi que la
sénescence en mesurant l'expression des transcrits de p16 et l'activité β-galactosidase endogène,
Utilisant le collagène 4 qui est le composant de la matrice le plus efficace. Nous pouvons utiliser ce
modèle à l'état d'équilibre du 15 ème au 30 ème jour. Dans les 15 premiers jours, on un pic de
prolifération(15%) qui s'associe à la production d'HB-EGF d'amphiréguline et de TGF-α. A partir du
15 ème jour la prolifération retombe à 3 à 5 %. L'expression des cytokératines et de l'uroplakine est
stable a confluence. Une activité significative de sénescence apparaît à J.25. Ces résultats montrent
que ce modèle maintient les caractéristiques de l'urothélium humain in vivo et peut être utilisé entre le
15 ème et le 25 ème jour. Nous avons ensuite utilisé ce modèle pour étudier l'implication des facteurs de
croissance de la famille de l'EGF et celle du récepteur à l'EGF au cours de la cicatrisation urothéliale.
Les mécanismes de cicatrisation étant en partie impliqués et déviés au cours de la cancérogenèse
7