(19) 대한민국특허청(KR) (12) 공개특허공보(A) - Questel

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또한, 본 발명의 하이브리드 단백질은 그 카르복실 말단에 소포체 잔류 시그널 펩티드, 액포 이행 시그널 펩티
드 등의 시그널 펩티드가 부가되어 있어도 된다. 여기서 「부가」란, 시그널 펩티드가 상기 하이브리드 단백질
의 카르복실 말단에 직접 결합되어 있는 경우도, 다른 펩티드를 통해 결합되어 있는 경우도 포함하는 개념이다.
본 명세서에 있어서, 아미노 말단에 분비 시그널 펩티드가 부가되고, 또한 카르복실 말단에 소포체 잔류 시
그널 펩티드가 부가된 하이브리드 단백질을 소포체형 (ER) 하이브리드 단백질이라고도 하고, 그 소포체형 하이
브리드 단백질을 코드하는 DNA 구축물을 소포체형 DNA 구축물이라고도 한다. 소포체형 하이브리드 단백질은
특히 양상추 등에 효율적으로 축적된다.
본 발명의 하이브리드 단백질은 그 카르복실 말단에, 바람직하게는 소포체 잔류 시그널 펩티드가 부가되어
있다. 소포체 잔류 시그널 펩티드로는 KDEL 배열 (배열 번호 19), HDEL 배열 (배열 번호 20), KDEF 배열
(배열 번호 21) 또는 HDEF 배열 (배열 번호 22) 을 포함하는 소포체 잔류 시그널 펩티드를 들 수 있다.
액포 이행 시그널 펩티드로는, 바람직하게는 가지과 (Solanaceae), 십자화과 (Brassicaceae), 국화과
(Asteraceae) 에 속하는 식물, 더욱 바람직하게는 담배속 (Nicotiana), 애기장대속 (Arabidopsis), 서양 고추
냉이속 (Armoracia) 등에 속하는 식물, 보다 바람직하게는 담배 (Nicotiana tabacum), 애기장대 (Arabidopsis
thaliana), 서양 고추냉이 (Armoracia rusticana) 등에서 유래된다. 또한, 바람직하게는 키티나아제에서
유래된다. 담배 키티나아제 유래의 액포 이행 시그널 펩티드의 아미노산 배열은 배열 번호 76 으로 나타낸
다. 또한, 담배 키티나아제 유래의 액포 이행 시그널 펩티드를 코드하는 DNA 의 염기 배열은 예를 들어 배
열 번호 75 로 나타낸다.
또한, 바람직하게는 서양 고추냉이 퍼옥시다아제 C1a 아이소자임에서 유래된다. 서양 고추냉이 퍼옥시다아
제 C1a 아이소자임 유래의 액포 이행 시그널 펩티드의 아미노산 배열은 배열 번호 78 로 나타낸다. 또한,
서양 고추냉이 퍼옥시다아제 C1a 아이소자임 유래의 액포 이행 시그널 펩티드를 코드하는 DNA 의 염기 배열은
예를 들어 배열 번호 77 로 나타낸다. 본 명세서에 있어서, 아미노 말단에 분비 시그널 펩티드가 부가되고,
또한 카르복실 말단에 액포 이행 시그널 펩티드가 부가된 하이브리드 단백질을 액포형 (Vac) 하이브리드 단백질
이라고도 하고, 그 액포형 하이브리드 단백질을 코드하는 DNA 구축물을 액포형 DNA 구축물이라고도 한다.
본 발명의 하이브리드 단백질은 화학적으로 합성할 수도 있고, 유전자 공학적으로 생산할 수도 있다. 유전
자 공학적으로 생산하는 방법에 대해서는 후술한다.
본 발명의 DNA 구축물은 본 발명의 하이브리드 단백질을 코드하는 DNA 를 포함하는 것을 특징으로 한다.
즉, 본 발명의 DNA 구축물은 2 개 또는 3 개의 세균 독소 단백질을 코드하는 DNA 가 상기 펩티드를 코드하는
DNA 를 통해 탠덤으로 연결되어 있는 DNA 를 포함한다. 상기 펩티드를 코드하는 DNA 는 예를 들어 배열 번
호 1 (PG12), 배열 번호 81 (PG17), 배열 번호 83 (PG22) 으로 나타낸다. 세균 독소 단백질을 코드하는
DNA 로서 예를 들어 Stx2eA 를 코드하는 DNA (배열 번호 3), Stx2eB 를 코드하는 DNA (배열 번호 5) 나 CTB 를
코드하는 DNA (배열 번호 7) 를 들 수 있다. 상기 펩티드를 코드하는 DNA 와 세균 독소 단백질을 코드하는 DNA
는 종지 코돈을 제외하고 리딩 프레임을 맞추어 연결된다.
세균 독소 단백질을 코드하는 DNA 는 예를 들어 배열 번호 3, 5, 7 의 염기 배열에 기초하여, 일반적인 유전자
공학적인 수법에 의해 얻을 수 있다. 구체적으로는, 각 세균 독소를 생산하는 세균으로부터 통상적인 방법
에 따라 cDNA 라이브러리를 조제하고, 그 라이브러리로부터 상기 염기 배열에 기초하여 제작한 프로브를 사용하
여 원하는 클론을 선택한다. 또한, 상기 염기 배열을 기본으로 한 화학 합성, 상기 염기 배열의 5' 및 3'
말단의 염기 배열을 프라이머로 하고, 게놈 DNA 를 주형 (鑄型) 으로 한 PCR 등에 의해 합성할 수도 있다.
본 발명의 하이브리드 단백질을 코드하는 DNA 는 예를 들어 배열 번호 9, 11, 13, 15, 85, 87, 89, 91, 93,
95, 97 또는 99 로 나타낸다.
하이브리드 단백질을 코드하는 DNA 는 그 단백질을 생산시키는 숙주 세포에 따라 하이브리드 단백질의 번역량이
증대되도록, 하이브리드 단백질을 구성하는 아미노산을 나타내는 코돈이 적절히 개변되어 있는 것도
바람직하다.
코돈 개변의 방법으로는, 예를 들어 Kang et al. (2004) 의 방법을 참고로 할 수 있다. 또한, 숙주 세포에
있어서 사용 빈도가 높은 코돈을 선택하거나, GC 함량이 많은 코돈을 선택하거나, 숙주 세포의 하우스키핑 유전
자에 있어서 사용 빈도가 높은 코돈을 선택하거나 하는 방법을 들 수 있다.
공개특허 10-2011-0009197
또한, 하이브리드 단백질을 코드하는 DNA 는 배열 번호 9, 11, 13, 15, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97 또는 99
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