(19) 대한민국특허청(KR) (12) 공개특허공보(A) - Questel

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(1) 형질 전환용 벡터의 구축
상기에서 제작한 ER-2×Stx2eB(PG12), Cyt-1×Stx2eB(PG12), Cyt-2×Stx2eB(PG12), Cyt-3×Stx2eB(PG12) 를 사
용하여 형질 전환 실험을 실시하였다.
형질 전환용 벡터의 제작은 상기 (1) 의 방법과 동일하게 실시하였다.
(2) 담배 배양 세포의 형질 전환 및 웨스턴 해석
형질 전환 실험 및 웨스턴 해석은 상기 (2), (3) 의 방법과 동일하게 실시하였다.
결과를 도 17 에 나타낸다.
ER-2×Stx2eB(PG12) 를 발현시킨 경우에는, 약 19 kDa, 21 kDa 및 23 kDa 의 위치에 시그널이 검출되었다.
Cyt-1×Stx2eB(PG12) 를 발현시킨 경우에는, 특이적 시그널은 검출 한계 이하였다. Cyt-2×Stx2eB(PG12)
를 발현시킨 경우에는, 약 19 kDa 의 위치에 시그널이 검출되었다. Cyt-3×Stx2eB(PG12) 를 발현시킨 경우
에는, 약 27 kDa 의 위치에, Cyt-2×Stx2eB(PG12) 를 발현시킨 경우보다 큰 시그널이 검출되었다.
이상으로부터, 담배 배양 세포의 형질 전환체에 있어서도, 1 개의 Stx2eB 단백질을 발현시킨 경우보다, 2 개 또
는 3 개의 Stx2eB 를 스페이서를 통해 탠덤으로 연결한 단백질을 발현시킨 경우가, Stx2eB 를 효율적으로 축적
시킬 수 있음을 알 수 있었다. 또한, 담배 배양 세포의 형질 전환체에 있어서, 세포질형 DNA 구축물을 발현
시킨 경우에는, 특히 3 개의 Stx2eB 를 스페이서를 통해 탠덤으로 연결한 단백질을 발현시킨 경우에, Stx2eB 를
효율적으로 축적시킬 수 있음을 알 수 있었다.
또한, 담배 배양 세포의 형질 전환체에 있어서는, 세포질형 DNA 구축물을 발현시킨 경우보다, 소포체형 DNA 구
축물을 발현시킨 경우가, Stx2eB 를 효율적으로 축적시킬 수 있음을 알 수 있었다.
담배 식물체를 사용한 형질 전환 실험
(1) 형질 전환용 벡터의 구축
상기에서 제작한 ER-2×Stx2eB(PG12), Chl-1×Stx2eB(PG12), Chl-2×Stx2eB(PG12), Chl-3×Stx2eB(PG12) 를 사
용하여 형질 전환 실험을 실시하였다.
형질 전환용 벡터의 제작은 상기 (1) 의 방법과 동일하게 실시하였다.
(2) 담배 식물체의 형질 전환
상기에서 제작한 벡터를 사용하여, 이하의 방법에 의해 담배 식물체의 형질 전환을 실시하였다.
담배 식물체 (Nicotiana tabacum L. cv. Petit habana SR1) 의 종자를 살균하고, MS 배지에 파종하였다.
무균 담배의 잎부를, 줄기를 포함하지 않도록 1×1 ㎝ 정도의 크기로 잘라내고, 멸균수가 들어간 샬레에 잎의
이면이 위가 되도록 두고, 상기 (2) 에서 얻어진 100 ㎎/ℓ 의 카나마이신을 함유하는 LB 배지에서 이틀밤
배양한 아그로박테리움 현탁액을 샬레에 부어 3 ∼ 5 분간 담그었다. 잎조각을 꺼내, 여분의 균액을 멸균 김
타올로 닦아내고, 캘러스 형성 배지에 치상 (置床) 하고 25 ℃ 에서 배양하였다. 2 ∼ 3 일 후, 아그로박테
리움을 배지 상에서 볼 수 있게 되면, 잎조각을 50 ㎖ 튜브로 옮겨, 멸균수로 5 회 세정한 후, 캘러스 형성 배
지 (카나마이신 100 ㎎/ℓ, 카르베니실린 250 ㎎/ℓ 를 함유한다) 에 치상하고, 1 ∼ 2 주일 25 ℃ 에서 배양하
였다. 잎조각이 맨 처음에 비교하여 둥글게 되고, 표면에 요철이 생기면, 슛 형성 배지 (카나마이신 100 ㎎
/ℓ, 카르베니실린 250 ㎎/ℓ 를 함유한다) 로 옮겼다. 또한 4 ∼ 6 주일 후, 경엽부가 발달한 슛을 잘라내
루트 형성 배지 (카나마이신 100 ㎎/ℓ, 카르베니실린 250 ㎎/ℓ 를 함유한다) 로 옮겨, 발근이 보이지 않을 때
까지 25 ℃ 에서 배양하였다. 식물체가 어느 정도의 크기로 성장한 것을 화분에 심었다.
(3) 웨스턴 해석
상기에서 제작한 유전자 재조합 담배 식물체의 잎을 샘플링하고, 질량 1 ㎎ 당 1 ㎕ 의 SDS-sample buffer 를
첨가하였다. 95 ℃ 에서 2 분간 열변성시켜 전기 영동용 시료로 하였다. 15 % 아크릴아미드 겔을 사용
하여 단백질을 분리 후, 일렉트로 트랜스퍼 장치를 사용하여 PVDF 멤브레인 (Hybond-P ; Amersham) 상에 단백질
을 블롯하였다. 항 HA 항체 (No. 11 867 423 001, Roche) 를 사용하여 Stx2eB 단백질을 검출하였다.
결과를 도 18 및 19 에 나타낸다.
공개특허 10-2011-0009197
ER-2×Stx2eB(PG12), Chl-1×Stx2eB(PG12), Chl-2×Stx2eB(PG12), Chl-3×Stx2eB(PG12) 로 형질 전환한 식물체
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