(19) 대한민국특허청(KR) (12) 공개특허공보(A) - Questel

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R 프라이머 (배열 번호 72) 를 사용하여 BY2 유비퀴틴 유전자의 발현량을 정량하고, stx2eB 유전자의 mRNA 레벨
을 보정하였다. 또한 1×Stx2eB(PG12) mRNA 레벨은 정량치를 1/2 로 하여 산출하였다.
결과를 도 12 에 나타낸다.
mRNA 당의 Stx2e 단백질의 축적 레벨은 2×Stx2eB(PG12) 를 발현시킨 세포 쪽이 2×Stx2eB(RS) 또는 1×
Stx2eB(PG12) 를 발현시킨 세포보다 큰 경향이 있었다. 이것으로부터, 스페이서의 상위는 전사 레벨에 영향
을 주는 것이 아니라, 번역 레벨 혹은 번역 후의 단백질의 안정성에 영향을 준다는 것을 알 수 있었다. 또한, 2
×Stx2eB 단백질이 과립상으로 국재되어 있었다는 결과를 아울러 고찰하면, 스페이서는 번역 후의 단백질의 안
정성에 영향을 주고 있는 것으로 생각된다.
일과성 발현 실험
(1) Stx2eB 일과성 발현 벡터의 구축
상기 (1) 의 방법으로 1×Stx2eB(PG12), 2×Stx2eB(PG12), 3×Stx2eB(PG12), 4×Stx2eB(PG12) 의 일과성
발현 벡터를 구축하였다 (도 13-A). 이하, 이들 벡터를 각각 ER-1×Stx2eB(PG12), ER-2×Stx2eB(PG12), ER-3
×Stx2eB(PG12), ER-4×Stx2eB(PG12) 라고 한다. 또한, 「ER」은 소포체형을 의미한다.
또한, 이하의 방법으로 세포질형 (Cyt) DNA 구축물을 포함하는 일과성 발현 벡터 (도 13-B), 및 엽록체형 (Chl)
DNA 구축물을 포함하는 발현 벡터 (도 13-C) 를 구축하였다. 또한, 이들 DNA 구축물은 소포체형 하이브리드
단백질과 가능한 한 가까운 구조의 하이브리드 단백질을 발현시킬 목적으로, 소포체 잔류 시그널 펩티드를 코드
하는 DNA 를 포함하도록 디자인되었다. 단, 당해 DNA 구축물은 분비 시그널 펩티드를 코드하는 DNA 를 포함
하지 않기 때문에, 생산된 하이브리드 단백질에 있어서, 소포체 잔류 시그널 펩티드는 그 기능 (단백질의 소포
체에 대한 잔류) 을 발휘하지 않는다.
NtADH 5'UTR 단편을 ADH XbaI-F 프라이머 (배열 번호 34) 와 ADH BamHI-R 프라이머 (배열 번호 112) 를 사용한
PCR 에 의해 증폭시키고, 얻어진 DNA 단편을 XbaI 과 BamHI 로 처리하였다. NtADH 5'-UTR 의 XbaI-BamHI
단편을, ER-1×Stx2eB(PG12), ER-2×Stx2eB(PG12), ER-3×Stx2eB(PG12) 및 ER-4×Stx2eB(PG12) 의 각각의
XbaI-BamHI 갭에 삽입하고, 세포질형 Stx2eB 벡터인 Cyt-1×Stx2eB(PG12), Cyt-2×Stx2eB(PG12), Cyt-3×
Stx2eB(PG12) 및 Cyt-4×Stx2eB(PG12) 를 제작하였다.
NtADH 5'-UTR 단편을 ADH XbaI-F 프라이머 (배열 번호 34) 및 ADH NsiI-R 프라이머 (배열 번호 35) 를 사용한
PCR 에 의해 증폭시켰다. 양상추 Rbcs (루비스코 스몰 서브유닛) (GenBank ACCESSION D14001) 유래 엽록체
이행 시그널 펩티드 (트랜지트 펩티드, T.P.) 를 코드하는 DNA 단편 (배열 번호 80) 을, 양상추잎 cDNA 를 주형
으로 하여 TP NsiI-F 프라이머 (배열 번호 113) 및 TP BamHI-R 프라이머 (배열 번호 114) 를 사용하여 PCR 에
의해 증폭시켰다. 얻어진 NtADH 5'-UTR 및 분비 시그널 펩티드의 각 DNA 단편을 NsiI (TOYOBO 사 제조) 로
처리하고, Ligation High (TOYOBO 사) 를 사용하여 라이게이션한 후, 말단을 평활화하고 pBluescript II SK
(Stratagene 사 제조) 의 EcoRV 갭에 클로닝하였다 (plasmid 12). Plasmid 12 를 NsiI 로 처리하고, T4
DNA polymerase (TOYOBO 사 제조) 로 말단을 평활화한 후 셀프 라이게이션하고, NtADH 의 개시 코돈과 Rbcs 의
개시 코돈이 일치하도록 융합하였다 (plasmid 13). Plasmid 13 으로부터 XbaI 과 BamHI 을 사용하여 NtADH
5'-UTR-T.P. 융합 단편을 잘라내고, ER-1×Stx2eB(PG12), ER-2×Stx2eB(PG12), ER-3×Stx2eB(PG12) 및 ER-4×
Stx2eB(PG12) 의 각각의 XbaI-BamHI 갭에 삽입하고, 엽록체형 Stx2eB 벡터인 Chl-1×Stx2eB(PG12), Chl-2×
Stx2eB(PG12), Chl-3×Stx2eB(PG12) 및 Chl-4×Stx2eB(PG12) 를 제작하였다.
(2) CTB 일과성 발현 벡터의 제작
상기 (2) 의 방법으로 1×CTB(PG12), 2×CTB(PG12) 의 일과성 발현 벡터를 구축하였다 (도 14-A). 이
하, 이들 벡터를 각각 ER-1×CTB(PG12), ER-2×CTB(PG12) 라고 한다.
또한, 이하의 방법으로 세포질형 (Cyt) DNA 구축물을 포함하는 일과성 발현 벡터 (도 14-B), 및 엽록체형 (Chl)
DNA 구축물을 포함하는 발현 벡터 (도 14-C) 를 구축하였다.
ER-1×CTB(PG12) 로부터 BamHI 및 BglII 를 사용하여 CTB-PG12 단편을 잘라내고, 상기 (1) 에서 제작한
Cyt-1×Stx2eB(PG12) 의 BamHI-BglII 갭 및 Chl-1×Stx2eB(PG12) 의 BamHI-BglII 갭에 삽입하여 세포질형 및
엽록체형 1×CTB(PG12) 를 제작하였다 (Cyt-1×CTB(PG12), Chl-1×CTB(PG12)).
공개특허 10-2011-0009197
계속해서, ER-2×CTB(PG12) 로부터 BamHI 및 BglII 를 사용하여 2×(CTB-PG12) 단편을 잘라내고, Cyt-1×
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