(19) 대한민국특허청(KR) (12) 공개특허공보(A) - Questel

(51) Int. Cl. 

(19) 대한민국특허청(KR) 

(12) 공개특허공보(A) 

C07K 19/00 (2006.01) C07K 14/28 (2006.01) 

C07K 14/245 (2006.01) A61K 39/116 (2006.01) 

(21) 출원번호 10-2010-7026745 

(22) 출원일자(국제출원일자) 2009년04월28일 

심사청구일자 없음 

(85) 번역문제출일자 2010년11월29일 

(86) 국제출원번호 PCT/JP2009/058345 

(87) 국제공개번호 WO 2009/133882 

국제공개일자 2009년11월05일 

(30) 우선권주장 

JP-P-2008-120573 2008년05월02일 일본(JP) 

전체 청구항 수 : 총 24 항 

(54) 세균 독소 백신 

(57) 요 약 

(11) 공개번호 10-2011-0009197 

(43) 공개일자 2011년01월27일 

(71) 출원인 

이데미쓰 고산 가부시키가이샤 

일본 도쿄도 지요다쿠 마루노우치 3쵸메 1반 1고 

고쿠리츠다이가쿠호징 나라 센탄카가쿠기쥬츠 다 

이가쿠인 다이가쿠 

일본국 나라켄 이코마시 다카야마쵸 8916-5 

(72) 발명자 

사와다 가즈토시 

일본 지바켕 소데가우라시 가미이즈미 1280반치 

요시다 가즈야 

사 망 

마츠이 다케시 

일본 나라켕 이코마시 다카야마쵸 8916-5 

(74) 대리인 

특허법인코리아나 

시가 독소 단백질 등의 세균 독소 단백질을 식물 세포를 이용하여 효율적으로 생산한다. 시가 독소 단백질 

등의 세균 독소 단백질이 하기 특징 (A) 및 (B) 를 갖는 펩티드를 통해 탠덤으로 연결된 하이브리드 단백질을 코 

드하는 DNA 를 포함하는 DNA 구축물을 사용하여 식물 세포를 형질 전환하고, 식물 세포에 상기 세균 독소 단백질 

을 생산시킨다. (A) 아미노산의 개수가 12 ∼ 30 개;(B) 프롤린의 함유율이 20 ∼ 35 %. 

대 표 도 - 도2 

- 1 - 

공개특허 10-2011-0009197

특허청구의 범위 

청구항 1 

2 개 또는 3 개의, 시가 독소 단백질, 콜레라 독소 단백질 또는 대장균 이열성 독소 단백질이 각각 하기 특징 

(A) 및 (B) 를 갖는 펩티드를 통해 탠덤으로 연결된 하이브리드 단백질, 

(A) 아미노산의 개수가 12 ∼ 30 개 ; 

(B) 프롤린의 함유율이 20 ∼ 35 %. 

청구항 2 

제 1 항에 있어서, 

상기 펩티드가 추가로 하기 특징 (C) 를 갖는 하이브리드 단백질, 

(C) 프롤린이 2 아미노산마다, 또는 3 아미노산마다 배치된다. 

청구항 3 


상기 펩티드가 배열 번호 2, 82 또는 84 로 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 하이브리드 단백질. 

청구항 4 


2 개의, 시가 독소 단백질, 콜레라 독소 단백질 또는 대장균 이열성 독소 단백질이 배열 번호 2 로 나타내는 아 

미노산 배열로 이루어지는 펩티드를 통해 탠덤으로 연결된 하이브리드 단백질. 

청구항 5 

제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 

시가 독소 단백질이 시가 독소 단백질의 B 서브유닛인 하이브리드 단백질. 

청구항 6 


시가 독소 단백질이 Stx2e 단백질인 하이브리드 단백질. 

청구항 7 


콜레라 독소 단백질이 콜레라 독소 단백질의 B 서브유닛인 하이브리드 단백질. 

청구항 8 


배열 번호 10, 12, 14 또는 16 으로 나타내는 아미노산 배열을 갖는 하이브리드 단백질. 

청구항 9 


배열 번호 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98 또는 100 으로 나타내는 아미노산 배열을 갖는 하이브리드 단백질. 

청구항 10 

- 2 - 



아미노 말단에 식물 유래의 분비 시그널 펩티드가 부가된 하이브리드 단백질. 

청구항 11 


카르복실 말단에 소포체 잔류 시그널 펩티드가 부가된 하이브리드 단백질. 

청구항 12 


아미노 말단에 엽록체 이행 시그널 펩티드가 부가된 하이브리드 단백질. 

청구항 13 

제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 기재된 하이브리드 단백질을 코드하는 DNA 를 포함하는 DNA 구축물. 

청구항 14 


배열 번호 9, 11, 13 또는 15 로 나타내는 염기 배열을 갖는 DNA 를 포함하는 DNA 구축물. 

청구항 15 


배열 번호 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97 또는 99 로 나타내는 염기 배열을 갖는 DNA 를 포함하는 DNA 구축물. 

청구항 16 


하이브리드 단백질을 코드하는 DNA 가 식물 유래의 알코올디하이드로게나아제 유전자의 5'-비번역 영역에 발현 

가능하게 연결되어 있는 DNA 구축물. 

청구항 17 


상기 식물 유래의 알코올디하이드로게나아제 유전자의 5'-비번역 영역이 담배 유래인 DNA 구축물. 

청구항 18 


배열 번호 24 ∼ 29 중 어느 것으로 나타내는 염기 배열을 갖는 DNA 구축물. 

청구항 19 


배열 번호 101 ∼ 111 중 어느 것으로 나타내는 염기 배열을 갖는 DNA 구축물. 

청구항 20 

제 13 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 기재된 DNA 구축물을 포함하는 재조합 벡터. 

청구항 21 

제 20 항에 기재된 재조합 벡터로 형질 전환된 형질 전환체. 

- 3 - 


[0001] 

[0002] 

[0003] 

[0004] 

[0005] 

[0006] 

[0007] 

[0008] 

[0009] 

청구항 22 


형질 전환체가 형질 전환 식물 세포 또는 형질 전환 식물인 형질 전환체. 

청구항 23 

제 21 항 또는 제 22 항에 기재된 형질 전환체로부터 얻어지는 종자. 

청구항 24 

배열 번호 2, 82 또는 84 로 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 펩티드. 

명 세 서 

기 술 분 야 

본 발명은 시가 독소, 콜레라 독소, 대장균 이열성 독소 등의 세균 독소에 의해 생기는 질환에 대한 백신에 사 

용하는 하이브리드 단백질, 및 그 하이브리드 단백질을 생산하기 위한 DNA 구축물에 관한 것이다. 

배 경 기 술 

시가 독소 (Stx, 베로 독소) 는 병원성 대장균 중 장관 출혈성 대장균 (enterohemorrhagic Escherichia coli) 

이 산생하는 단백질성 외독소이다. 시가 독소는 출혈성 장염, 용혈성 요독증 증후군, 뇌증 등을 일으킨다. 

시가 독소는 크게 Stx1 과 Stx2 로 나누어지고, 또한 각각이 서브 클래스로 나누어진다. Stx2 로는, 예를 

들어 돼지 부종병을 일으키는 Stx2e 를 들 수 있다. 돼지 부종병은 이유 후 1 ∼ 2 주의 새끼 돼지에게 많 

이 발생하는 것이 알려져 있다. 부종병균의 감염에 의한 치사율은 50 ∼ 90 % 로 매우 높다. 

또한 콜레라 독소 (CT) 는 Vibrio cholerae 가 산생하는 단백질성 외독소이다. CT 는 격렬한 설사나 구토를 

일으키는 것이 알려져 있다. 

또한 대장균 이열성 독소 (LT) 는 독소원성 대장균 (enterotoxigenic Escherichia coli) 이 산생하는 단백질성 

내독소이다. LT 는 설사나 구토를 일으키는 것이 알려져 있다. 

Stx, LT, CT 의 어느 세균 독소도 세포에 대한 부착에 관여하는 B 서브유닛 5 량체와 독성을 갖는 A 서브유닛 1 

량체로 이루어지는 것이 알려져 있다. 또한, LT 와 CT 는 구조적으로도 기능적으로도 유사하다는 것이 알려 

져 있다. 

이들 세균 독소에 의한 질환을 예방하는 방법으로는, 백신을 주사 혹은 경비 스프레이에 의해 투여하거나, 경구 

적으로 투여하거나 하는 방법이 알려져 있다. 

예를 들어, 무독화한 Stx2e 단백질을 재조합 대장균을 사용하여 생산시켜, 주사에 의해 돼지에게 투여하는 기술 

이 알려져 있다 (비특허문헌 1). 그러나, 재조합 대장균에 의한 무독화한 Stx2e 단백질의 생산량은 충분하 

지 않다는 문제나 주사에 의한 백신의 투여는 인간의 노력이 드는 등의 문제가 있었다. 

공개특허 10-2011-0009197 

또한, 백신을 경구적으로 투여하는 방법에 대해서는, 노력 경감의 관점에서 축산 분야에서 관심이 높아지고 있 

다. 이와 같은 배경에 있어서, 세균 독소 단백질을 트랜스제닉 기술을 사용하여 식물에게 생산시키는 기술 

의 개발이 이루어지고 있다. 예를 들어, LT 단백질의 B 서브유닛 (LTB) 을 코드하는 DNA 를 포함하고, 그 

DNA 를 발현하는 트랜스제닉 식물에 대하여 기재되어 있다 (특허문헌 1, 특허문헌 2). 또한, LT 단백질 또 

는 CT 단백질을 코드하는 DNA 를 발현하는 트랜스제닉 식물에 대하여 기재되어 있다 (특허문헌 3). 그러나, 

이들 기술에서는, 단백질의 생산량이 충분하지 않다는 문제가 있었다. 또한, LTB 를 양상추에 생산시킨 예 

가 보고되어 있다 (비특허문헌 2). 이 연구에서는, 코돈을 개변한 LT 단백질의 B 서브유닛의 유전자를, 식 

물 고발현 프로모터인 콜리플라워 모자이크 바이러스 35S RNA 프로모터 (CaMV35S) 와, 인핸서인 Kozak 배열을 

사용하여, 양상추 내에서 발현시켰다. 그 결과, LT 단백질의 B 서브유닛이 양상추의 총 가용성 단백질의 약 

2.0 질량% 축적된 것이 보고되어 있다. 그러나, 이 정도의 단백질의 축적량으로는, 트랜스제닉 식물을 이 

용하여 세균병의 방제를 효율적으로 실시하기에는 불충분하고 생각된다. 즉, 목적으로 하는 세균 독소 단백 

- 4 -

[0010] 

[0011] 

[0012] 

[0013] 

[0014] 

[0015] 

[0016] 

[0017] 

[0018] 


[0020] 

[0021] 

[0022] 

[0023] 

질을 식물 세포 내에서 효율적으로 생산, 축적시킬 필요가 있다. 

본 발명자들은 식물 유래의 분비 시그널 펩티드가 아미노 말단에 부가된 Stx2e 단백질을, 식물 유래의 알코올디 

하이드로게나아제 유전자의 5'-비번역 영역 (ADH5'UTR) 을 사용하여 발현시킴으로써, Stx2e 단백질을 양상추 등 

의 식물에 효율적으로 생산시켜, 식물체에 고농도로 축적시킬 수 있는 것을 알아내어, 특허 출원을 하였다 (특 

허문헌 4). 

선행기술문헌 

특허문헌 

(특허문헌 0001) 일본 공표특허공보 평10-507916호 

(특허문헌 0002) 일본 공개특허공보 2000-166411호 

(특허문헌 0003) 일본 공표특허공보 2002-533068호 

(특허문헌 0004) 국제 공개 제2009/004842호 팜플렛 

비특허문헌 

(비특허문헌 0001) Makino et al., Microbial Pathogenesis, Volume 31, Number 1, July 2001, pp.1-8(08) 

(비특허문헌 0002) Kim et al., Protein Expression and Purification, Volume 51, Number 1, Jan 2006, 

pp.22-27(06) 

발명의 내용 

해결하려는 과제 

본 발명은 Stx 단백질, 및 이것과 유사한 고차 구조를 갖는 다른 세균 독소 단백질을 식물 세포를 사용하여 보 

다 효율적으로 생산하는 것을 과제로 한다. 

과제의 해결 수단 

본 발명자들은 Stx2e, CT 등의 세균 독소의 단백질을 특정 배열의 펩티드를 통해 2 개 또는 3 개 탠덤으로 연결 

한 하이브리드 단백질을 식물 세포에 생산시킨 결과, 세균 독소의 단백질을 식물 세포 내에 고농도로 축적시키 

는 것에 성공하여 본 발명을 완성시켰다. 

즉, 본 발명은 이하와 같다. 

(1) 2 개 또는 3 개의, 시가 독소 단백질, 콜레라 독소 단백질 또는 대장균 이열성 독소 단백질이 각각 하기 특 

징 (A) 및 (B) 를 갖는 펩티드를 통해 탠덤으로 연결된 하이브리드 단백질, 


(B) 프롤린의 함유율이 20 ∼ 35 %. 

(2) 상기 펩티드가 추가로 하기 특징 (C) 를 갖는 (1) 에 기재된 하이브리드 단백질, 

(C) 프롤린이 2 아미노산마다, 또는 3 아미노산마다 배치된다. 

(3) 상기 펩티드가 배열 번호 2, 82 또는 84 로 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 (2) 에 기재된 하이브리 

드 단백질. 


(4) 2 개의, 시가 독소 단백질, 콜레라 독소 단백질 또는 대장균 이열성 독소 단백질이 배열 번호 2 로 나타내 

는 아미노산 배열로 이루어지는 펩티드를 통해 탠덤으로 연결된 (3) 에 기재된 하이브리드 단백질. 

(5) 시가 독소 단백질이 시가 독소 단백질의 B 서브유닛인 (1) ∼ (4) 중 어느 하나에 기재된 하이브리드 단백 

- 5 -

[0024] 

[0025] 

[0026] 

[0027] 

[0028] 

[0029] 

[0030] 

[0031] 

[0032] 

[0033] 

[0034] 

[0035] 

[0036] 

[0037] 

[0038] 

[0039] 

[0040] 

[0041] 

[0042] 

[0043] 

질. 

(6) 시가 독소 단백질이 Stx2e 단백질인 (1) ∼ (5) 중 어느 하나에 기재된 하이브리드 단백질. 

(7) 콜레라 독소 단백질이 콜레라 독소 단백질의 B 서브유닛인 (1) ∼ (4) 중 어느 하나에 기재된 하이브리드 

단백질. 

(8) 배열 번호 10, 12, 14 또는 16 으로 나타내는 아미노산 배열을 갖는 (4) 에 기재된 하이브리드 단백질. 

(9) 배열 번호 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98 또는 100 으로 나타내는 아미노산 배열을 갖는 (3) 에 기재된 하이 

브리드 단백질. 

(10) 아미노 말단에 식물 유래의 분비 시그널 펩티드가 부가된 (1) ∼ (9) 중 어느 하나에 기재된 하이브리드 

단백질. 

(11) 카르복실 말단에 소포체 잔류 시그널 펩티드가 부가된 (10) 에 기재된 하이브리드 단백질. 

(12) 아미노 말단에 엽록체 이행 시그널 펩티드가 부가된 (1) ∼ (9) 중 어느 하나에 기재된 하이브리드 

단백질. 

(13) (1) ∼ (12) 중 어느 하나에 기재된 하이브리드 단백질을 코드하는 DNA 를 포함하는 DNA 구축물. 

(14) 배열 번호 9, 11, 13 또는 15 로 나타내는 염기 배열을 갖는 DNA 를 포함하는 (13) 에 기재된 DNA 구축물. 

(15) 배열 번호 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97 또는 99 로 나타내는 염기 배열을 갖는 DNA 를 포함하는 (13) 에 

기재된 DNA 구축물. 

(16) 하이브리드 단백질을 코드하는 DNA 가 식물 유래의 알코올디하이드로게나아제 유전자의 5'-비번역 영역에 

발현 가능하게 연결되어 있는 (13) ∼ (15) 중 어느 하나에 기재된 DNA 구축물. 

(17) 상기 식물 유래의 알코올디하이드로게나아제 유전자의 5'-비번역 영역이 담배 유래인 (16) 에 기재된 DNA 

구축물. 

(18) 배열 번호 24 ∼ 29 중 어느 것으로 나타내는 염기 배열을 갖는 (17) 에 기재된 DNA 구축물. 

(19) 배열 번호 101 ∼ 111 중 어느 것으로 나타내는 염기 배열을 갖는 (17) 에 기재된 DNA 구축물. 

(20) (13) ∼ (19) 중 어느 하나에 기재된 DNA 구축물을 포함하는 재조합 벡터. 

(21) (20) 에 기재된 재조합 벡터로 형질 전환된 형질 전환체. 

(22) 형질 전환체가 형질 전환 식물 세포 또는 형질 전환 식물인 (21) 에 기재된 형질 전환체. 

(23) (21) 또는 (22) 에 기재된 형질 전환체로부터 얻어지는 종자. 

(24) 배열 번호 2, 82 또는 84 로 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 펩티드. 

도면의 간단한 설명 

도 1 은 Stx2eB 발현 벡터의 디자인을 나타내는 도면이다. 도면에 있어서 → 는 번역 개시점을 나타내고, 

▽ 는 번역 후에 절단되는 부위를 나타낸다. 

도 2 는 양상추 프로토플라스트를 사용한 일과성 발현 실험으로 얻어진 Stx2eB 의 축적 레벨을 나타내는 사진이 

다. 

도 3 은 양상추 프로토플라스트를 사용한 일과성 발현 실험으로 얻어진 CTB 의 축적 레벨을 나타내는 사진이다. 

도 4 는 Stx2eB-YFP 의 융합 단백질을 코드하는 DNA 구축물의 디자인을 나타내는 도면이다. 도면에 있어서 

→ 는 번역 개시점을 나타내고, ▽ 는 번역 후에 절단되는 부위를 나타낸다. 

도 5 는 담배 배양 세포 프로토플라스트를 사용한 일과성 발현 실험으로 얻어진 Stx2eB-YFP 의 융합 단백질의 

국재를 나타내는 사진이다. 

도 6 은 담배 배양 세포 프로토플라스트를 사용한 일과성 발현 실험으로 얻어진 Stx2eB-YFP 의 융합 단백질의 

국재를 나타내는 사진이다. 

- 6 - 


[0044] 

[0045] 

[0046] 

[0047] 

[0048] 

[0049] 

도 7 은 담배 배양 세포 프로토플라스트를 사용한 일과성 발현 실험으로 얻어진 ARF1pWT 와 ARF1pDN 의 공(共) 

발현에 있어서의, 액포형 GFP, 및 Stx2eB-YFP 의 융합 단백질의 국재를 나타내는 사진이다. 

도 8 은 담배 배양 세포 (BY2) 를 사용한 형질 전환 실험으로 얻어진 Stx2eB 의 축적 레벨을 나타내는 

사진이다. 각 레인의 숫자는 클론 번호를 나타낸다. 

도 9 는 담배 배양 세포 (BY2) 를 사용한 형질 전환 실험으로 얻어진 Stx2eB 의 축적 레벨을 나타내는 

사진이다. 각 레인의 숫자는 클론 번호를 나타낸다. 

도 10 은 담배 배양 세포 (BY2) 를 사용한 형질 전환 실험으로 얻어진 Stx2eB 의 축적 레벨을 나타내는 사진이 

다. 각 레인의 숫자는 클론 번호를 나타낸다. 

도 11 은 담배 배양 세포 (BY2) 를 사용한 형질 전환 실험으로 얻어진 Stx2eB 의 축적 레벨을 나타내는 그래프 

이다. 각 숫자는 클론 번호를 나타낸다. 

도 12 는 Stx2eB 의 mRNA 레벨과 Stx2eB 의 축적 레벨의 관계를 나타내는 그래프이다. 

도 13 은 Stx2eB 를 코드하는 DNA 구축물의 디자인을 나타내는 도면이다. A 는 소포체형, B 는 세포질형, C 

는 엽록체형 DNA 구축물의 디자인을 나타낸다. 

도 14 는 CTB 를 코드하는 DNA 구축물의 디자인을 나타내는 도면이다. A 는 소포체형, B 는 세포질형, C 는 

엽록체형 DNA 구축물의 디자인을 나타낸다. 

도 15 는 양상추 프로토플라스트를 사용한 일과성 발현 실험으로 얻어진 Stx2eB 의 축적 레벨을 나타내는 사진 

이다. 

도 16 은 양상추 프로토플라스트를 사용한 일과성 발현 실험으로 얻어진 CTB 의 축적 레벨을 나타내는 

사진이다. 

도 17 은 담배 배양 세포 (BY2) 를 사용한 형질 전환 실험으로 얻어진 Stx2eB 의 축적 레벨을 나타내는 사진이 

다. 각 레인의 숫자는 클론 번호를 나타낸다. 

도 18 은 담배 식물체를 사용한 형질 전환 실험으로 얻어진 Stx2eB 의 축적 레벨을 나타내는 사진이다. 각 

레인의 숫자는 클론 번호를 나타낸다. 

도 19 는 담배 식물체를 사용한 형질 전환 실험으로 얻어진 Stx2eB 의 축적 레벨을 나타내는 사진이다. 각 

레인의 숫자는 클론 번호를 나타낸다. 

도 20 은 Stx2eB 를 코드하는 DNA 구축물의 디자인을 나타내는 도면이다. 

도 21 은 CTB 를 코드하는 DNA 구축물의 디자인을 나타내는 도면이다. 

도 22 는 담배 배양 세포 (BY2) 를 사용한 형질 전환 실험으로 얻어진 Stx2eB 의 축적 레벨을 나타내는 사진이 

다. 

도 23 은 담배 배양 세포 (BY2) 를 사용한 형질 전환 실험으로 얻어진 CTB 의 축적 레벨을 나타내는 사진이다. 

발명을 실시하기 위한 구체적인 내용 

본 발명의 하이브리드 단백질은 2 개 또는 3 개의, 시가 독소 (Stx) 단백질, 콜레라 독소 (CT) 단백질 또는 대 

장균 이열성 독소 (LT) 단백질이 각각 하기 특징 (A) 및 (B) 를 갖는 펩티드를 통해 탠덤으로 연결되어 있다. 


(B) 프롤린의 함유율이 20 ∼ 35 %. 

시가 독소 (Stx) 는 1 형 (Stx1) 및 2 형 (Stx2) 으로 나누어진다. Stx1 은 a ∼ d 의 서브 클래스로, 

Stx2 는 a ∼ g 의 서브 클래스로 각각 분류된다. 시가 독소 단백질은 독성 본체인 1 개의 A 서브유닛과 장관 

점막에 대한 침입에 관여하는 5 개의 B 서브유닛으로 이루어진다. 

이 중, 예를 들어 Stx2e 는 돼지 부종병 독소로서 알려져 있고, 그 A 서브유닛 (Stx2eA) 은 배열 번호 4 의 아 

미노산 배열로 나타내며, B 서브유닛 (Stx2eB) 은 배열 번호 6 의 아미노산 배열로 나타낸다. 


Stx2eA 및 Stx2eB 는 돼지에게 투여하여 면역 응답을 일으킬 수 있는 한, 각각 배열 번호 4 또는 배열 번호 6 

- 7 -

[0050] 

[0051] 

[0052] 

[0053] 

[0054] 

[0055] 

[0056] 

[0057] 

[0058] 

[0059] 

[0060] 

[0061] 

으로 나타내는 아미노산 배열에 있어서의 1 개 또는 수 개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 또는 부가되어 있어 

도 된다. 상기 「수 개」로는, 예를 들어 Stx2eA 에 있어서 바람직하게는 2 ∼ 30 개, 더욱 바람직하게는 2 

∼ 20 개, 보다 바람직하게는 2 ∼ 10 개이고, Stx2eB 에 있어서 바람직하게는 2 ∼ 10 개, 더욱 바람직하게는 

2 ∼ 5 개, 보다 바람직하게는 2 ∼ 3 개이다. 

또한, Stx2eA 및 Stx2eB 는 각각 배열 번호 4 또는 배열 번호 6 으로 나타내는 아미노산 배열과, 바람직하게는 

85 % 이상, 더욱 바람직하게는 90 % 이상, 보다 바람직하게는 95 % 이상의 동일성을 가지며, 또한 돼지에게 

투여하여 면역 응답을 일으킬 수 있는 것이어도 된다. 

콜레라 독소 (CT) 단백질은 독성 본체인 1 개의 A 서브유닛 (CTA) 과, 배열 번호 8 의 아미노산 배열로 나타내 

는 장관 점막에 대한 침입에 관여하는 5 개의 B 서브유닛 (CTB) 으로 이루어진다. 

CTB 는 동물에게 투여하여 면역 응답을 일으킬 수 있는 한, 배열 번호 8 로 나타내는 아미노산 배열에 있어서의 

1 개 또는 수 개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 또는 부가되어 있어도 된다. 상기 「수 개」로는, 바람직 

하게는 2 ∼ 10 개, 더욱 바람직하게는 2 ∼ 5 개, 보다 바람직하게는 2 ∼ 3 개이다. 

또한 CTB 는 배열 번호 8 로 나타내는 아미노산 배열과, 바람직하게는 85 % 이상, 더욱 바람직하게는 90 % 이 

상, 보다 바람직하게는 95 % 이상의 동일성을 가지며, 또한 동물에게 투여하여 면역 응답을 일으킬 수 있는 것 

이어도 된다. 

대장균 이열성 독소 (LT) 단백질은 독성 본체인 1 개의 A 서브유닛과 장관 점막에 대한 침입에 관여하는 5 개의 

서브유닛으로 이루어진다. 

본 명세서에서는, 시가 독소, 콜레라 독소, 대장균 이열성 독소를 통칭하여 「세균 독소」라고도 한다. 

상기 펩티드의 아미노산의 개수는 바람직하게는 12 ∼ 25 개, 더욱 바람직하게는 12 ∼ 22 개이다. 또한, 

상기 펩티드의 프롤린의 함유율은 바람직하게는 20 ∼ 27 %, 더욱 바람직하게는 20 ∼ 25 % 이다. 

또한, 상기 펩티드에 있어서, 프롤린은 바람직하게는 2 개마다, 또는 3 개마다 배치된다. 단, 이 경우에도, 

펩티드의 말단에 있어서는 프롤린 이외의 아미노산이 5 개 이내, 바람직하게는 4 개 이내의 범위에서 연속되어 

있어도 된다. 

또한 상기 펩티드에 있어서는, 프롤린 이외의 아미노산 중, 세린, 글리신, 아르기닌, 리신, 트레오닌, 

글루타민, 아스파라긴, 히스티딘 및 아스파르트산의 합계 함유율은 바람직하게는 70 % 이상, 더욱 바람직하게 

는 80 % 이상, 보다 바람직하게는 90 % 이상이다. 또한 상기 펩티드에 있어서는, 프롤린 이외의 아미노산 

중, 세린, 글리신 및 아스파라긴의 합계 함유율은 바람직하게는 70 % 이상, 더욱 바람직하게는 80 % 이상, 보 

다 바람직하게는 90 % 이상이다. 또한 상기 펩티드에 있어서는, 프롤린 이외의 아미노산 중, 세린 및 글리 

신의 합계 함유율은 바람직하게는 70 % 이상, 더욱 바람직하게는 80 % 이상, 보다 바람직하게는 90 % 이상이 

다. 이것은 이들 아미노산을 많이 함유하는 펩티드는 2 차 구조 (베타 시트 구조나 헬릭스 구조) 를 취하 

기 어렵기 때문이다. 

한편, 상기 펩티드에 있어서는, 프롤린 이외의 아미노산 중, 알라닌, 메티오닌 및 글루탐산의 합계 함유율은 바 

람직하게는 30 % 이하, 더욱 바람직하게는 20 % 이하, 보다 바람직하게는 10 % 이하이다. 이것은 이들 

아미노산을 많이 함유하는 펩티드는 헬릭스 구조를 취하기 쉽기 때문이다. 또한 상기 펩티드에 있어서는, 

프롤린 이외의 아미노산 중, 트립토판, 류신, 이소류신, 티로신, 페닐알라닌 및 발린의 합계 함유율은 바람직하 

게는 20 % 이하, 더욱 바람직하게는 10 % 이하, 보다 바람직하게는 5 % 이하이다. 이것은 이들 아미노산 

을 많이 함유하는 펩티드는 베타 시트 구조 및 헬릭스 구조를 취하기 쉽기 때문이다. 

상기 펩티드는 바람직하게는 배열 번호 2 로 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 펩티드 (PG12), 배열 번호 

82 로 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 펩티드 (PG17), 또는 배열 번호 84 로 나타내는 아미노산 배열로 

이루어지는 펩티드 (PG22) 에서 선택된다. 


본 발명의 하이브리드 단백질은 2 개 또는 3 개의 A 서브유닛과 B 서브유닛의 하이브리드 단백질이 상기 펩티드 

를 통해 탠덤으로 연결되어 있어도 되고, 2 개 또는 3 개의 A 서브유닛이 상기 펩티드를 통해 탠덤으로 연결되 

어 있어도 되며, 2 개 또는 3 개의 B 서브유닛이 상기 펩티드를 통해 탠덤으로 연결되어 있어도 된다. 단, 본 

발명의 하이브리드 단백질이 A 서브유닛을 포함하는 경우에는, A 서브유닛은 무독화되어 있는 것이 바람직하다. 

본 발명의 하이브리드 단백질은 2 개 또는 3 개의 B 서브유닛이 상기 펩티드를 통해 탠덤으로 연결되어 있는 

것이 바람직하다. 또한 본 발명의 하이브리드 단백질은 2 개의 B 서브유닛이 PG12 를 통해 탠덤으로 연결되 

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[0066] 

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[0068] 

[0069] 

[0070] 

어 있는 것이 바람직하다. 

또한 본 발명의 하이브리드 단백질은 추가로 그 C 말단에 상기 펩티드가 부가되어 있는 것이 바람직하다. 

특히, 본 발명의 하이브리드 단백질은 그 C 말단에 PG12 가 부가되어 있는 것이 바람직하다. 

본 발명의 하이브리드 단백질은 예를 들어 배열 번호 10, 12, 14, 16, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98 또는 100 

으로 나타내는 아미노산 배열을 갖는다. 배열 번호 10 으로 나타내는 아미노산 배열을 갖는 하이브리드 단 

백질은 2 개의 Stx2eB 가 PG12 를 통해 탠덤으로 연결되어 있다. 배열 번호 12 로 나타내는 아미노산 배열 

을 갖는 하이브리드 단백질은 2 개의 CTB 가 PG12 를 통해 탠덤으로 연결되어 있다. 배열 번호 14 로 나타 

내는 아미노산 배열을 갖는 하이브리드 단백질은 2 개의 Stx2eB 가 PG12 를 통해 탠덤으로 연결되고, 추가로 그 

C 말단에 PG12 가 연결되어 있다. 배열 번호 16 으로 나타내는 아미노산 배열을 갖는 하이브리드 단백질은 

2 개의 CTB 가 PG12 를 통해 탠덤으로 연결되고, 추가로 그 C 말단에 PG12 가 연결되어 있다. 배열 번호 86 

으로 나타내는 아미노산 배열을 갖는 하이브리드 단백질은 3 개의 Stx2eB 가 각각 PG12 를 통해 탠덤으로 연결 

되어 있다. 배열 번호 88 로 나타내는 아미노산 배열을 갖는 하이브리드 단백질은 3 개의 Stx2eB 가 각각 

PG12 를 통해 탠덤으로 연결되고, 추가로 그 C 말단에 PG12 가 연결되어 있다. 배열 번호 90 으로 나타내는 

아미노산 배열을 갖는 하이브리드 단백질은 2 개의 Stx2eB 가 PG17 을 통해 탠덤으로 연결되고, 추가로 그 C 말 

단에 PG12 가 연결되어 있다. 배열 번호 92 로 나타내는 아미노산 배열을 갖는 하이브리드 단백질은 2 개의 

Stx2eB 가 PG22 를 통해 탠덤으로 연결되고, 추가로 그 C 말단에 PG12 가 연결되어 있다. 배열 번호 94 로 

나타내는 아미노산 배열을 갖는 하이브리드 단백질은 3 개의 CTB 가 각각 PG12 를 통해 탠덤으로 연결되어 

있다. 배열 번호 96 으로 나타내는 아미노산 배열을 갖는 하이브리드 단백질은 3 개의 CTB 가 각각 PG12 를 

통해 탠덤으로 연결되고, 추가로 그 C 말단에 PG12 가 연결되어 있다. 배열 번호 98 로 나타내는 아미노산 

배열을 갖는 하이브리드 단백질은 2 개의 CTB 가 PG17 을 통해 탠덤으로 연결되고, 추가로 그 C 말단에 PG12 가 

연결되어 있다. 배열 번호 100 으로 나타내는 아미노산 배열을 갖는 하이브리드 단백질은 2 개의 CTB 가 

PG22 를 통해 탠덤으로 연결되고, 추가로 그 C 말단에 PG12 가 연결되어 있다. 

상기 PG12, PG17 또는 PG22 등의 펩티드를 상기 세균 독소 단백질을 연결하기 위한 링커로서 사용함으로써, 그 

세균 독소 단백질의 식물 세포에 대한 축적 레벨이 증대된다. 

본 발명의 하이브리드 단백질은 바람직하게는 그 아미노 말단에 식물 유래의 분비 시그널 펩티드, 또는 엽록체 

이행 시그널 펩티드가 부가되어 있다. 여기서 「부가」란, 상기 분비 시그널 펩티드가 상기 펩티드를 통해 

연결된 2 개 또는 3 개의 상기 세균 독소 단백질의 아미노 말단에 직접 결합되어 있는 경우도, 다른 펩티드를 

통해 결합되어 있는 경우도 포함하는 개념이다. 

분비 시그널 펩티드는 바람직하게는 가지과 (Solanaceae), 십자화과 (Brassicaceae), 국화과 (Asteraceae) 에 

속하는 식물, 더욱 바람직하게는 담배속 (Nicotiana), 애기장대속 (Arabidopsis), 상추속 (Lactuca) 등에 속하 

는 식물, 보다 바람직하게는 담배 (Nicotiana tabacum), 애기장대 (Arabidopsis thaliana), 양상추 (Lactuca 

sativa) 등에서 유래된다. 

또한, 바람직하게는 담배의 β-D 글루칸엑소하이드로라아제 (β-D-glucan exohydrolase), 담배의 38 kDa 퍼옥시 

다아제 (GenBank Accession D42064) 에서 유래된다. 

상기 분비 시그널 펩티드로는 예를 들어 담배의 β-D 글루칸엑소하이드로라아제에서 유래되는, 배열 번호 18 로 

나타내는 아미노산 배열을 갖고 있는 펩티드를 들 수 있다. 

엽록체 이행 시그널 펩티드로는, 예를 들어 양상추 Rbcs (루비스코 스몰 서브유닛) (GenBank ACCESSION D14001) 

유래 엽록체 이행 시그널 펩티드 (트랜지트 펩티드, T.P., 배열 번호 79) 를 들 수 있다. 또한, 양상추 

Rbcs 유래 엽록체 이행 시그널 펩티드를 코드하는 DNA 의 염기 배열은 예를 들어 배열 번호 80 으로 나타낸다. 

본 명세서에 있어서, 아미노 말단에 엽록체 이행 시그널 펩티드가 부가된 하이브리드 단백질을 엽록체형 

(Chl) 하이브리드 단백질이라고도 하고, 그 엽록체형 하이브리드 단백질을 코드하는 DNA 구축물을 엽록체형 DNA 

구축물이라고도 한다. 엽록체형 하이브리드 단백질은 특히 담배 등의 엽록체가 발달되어 있는 식물에 효율 

적으로 축적된다. 

또한, 아미노 말단에 분비 시그널 펩티드도 엽록체 이행 시그널 펩티드도 부가되어 있지 않은 하이브리드 단백 

질을 세포질형 (Cyt) 하이브리드 단백질이라고도 하고, 그 세포질형 하이브리드 단백질을 코드하는 DNA 구축물 

을 세포질형 DNA 구축물이라고도 한다. 세포질형 하이브리드 단백질에 있어서는, 특히 3 개의 세균 독소의 

B 서브유닛이 상기 펩티드를 통해 탠덤으로 연결되어 있는 것이 바람직하다. 

- 9 - 


[0071] 

[0072] 

[0073] 

[0074] 

[0075] 

[0076] 

[0077] 

[0078] 

[0079] 

[0080] 

[0081] 

[0082] 

또한, 본 발명의 하이브리드 단백질은 그 카르복실 말단에 소포체 잔류 시그널 펩티드, 액포 이행 시그널 펩티 

드 등의 시그널 펩티드가 부가되어 있어도 된다. 여기서 「부가」란, 시그널 펩티드가 상기 하이브리드 단백질 

의 카르복실 말단에 직접 결합되어 있는 경우도, 다른 펩티드를 통해 결합되어 있는 경우도 포함하는 개념이다. 

본 명세서에 있어서, 아미노 말단에 분비 시그널 펩티드가 부가되고, 또한 카르복실 말단에 소포체 잔류 시 

그널 펩티드가 부가된 하이브리드 단백질을 소포체형 (ER) 하이브리드 단백질이라고도 하고, 그 소포체형 하이 

브리드 단백질을 코드하는 DNA 구축물을 소포체형 DNA 구축물이라고도 한다. 소포체형 하이브리드 단백질은 

특히 양상추 등에 효율적으로 축적된다. 

본 발명의 하이브리드 단백질은 그 카르복실 말단에, 바람직하게는 소포체 잔류 시그널 펩티드가 부가되어 

있다. 소포체 잔류 시그널 펩티드로는 KDEL 배열 (배열 번호 19), HDEL 배열 (배열 번호 20), KDEF 배열 

(배열 번호 21) 또는 HDEF 배열 (배열 번호 22) 을 포함하는 소포체 잔류 시그널 펩티드를 들 수 있다. 

액포 이행 시그널 펩티드로는, 바람직하게는 가지과 (Solanaceae), 십자화과 (Brassicaceae), 국화과 

(Asteraceae) 에 속하는 식물, 더욱 바람직하게는 담배속 (Nicotiana), 애기장대속 (Arabidopsis), 서양 고추 

냉이속 (Armoracia) 등에 속하는 식물, 보다 바람직하게는 담배 (Nicotiana tabacum), 애기장대 (Arabidopsis 

thaliana), 서양 고추냉이 (Armoracia rusticana) 등에서 유래된다. 또한, 바람직하게는 키티나아제에서 

유래된다. 담배 키티나아제 유래의 액포 이행 시그널 펩티드의 아미노산 배열은 배열 번호 76 으로 나타낸 

다. 또한, 담배 키티나아제 유래의 액포 이행 시그널 펩티드를 코드하는 DNA 의 염기 배열은 예를 들어 배 

열 번호 75 로 나타낸다. 

또한, 바람직하게는 서양 고추냉이 퍼옥시다아제 C1a 아이소자임에서 유래된다. 서양 고추냉이 퍼옥시다아 

제 C1a 아이소자임 유래의 액포 이행 시그널 펩티드의 아미노산 배열은 배열 번호 78 로 나타낸다. 또한, 

서양 고추냉이 퍼옥시다아제 C1a 아이소자임 유래의 액포 이행 시그널 펩티드를 코드하는 DNA 의 염기 배열은 

예를 들어 배열 번호 77 로 나타낸다. 본 명세서에 있어서, 아미노 말단에 분비 시그널 펩티드가 부가되고, 

또한 카르복실 말단에 액포 이행 시그널 펩티드가 부가된 하이브리드 단백질을 액포형 (Vac) 하이브리드 단백질 

이라고도 하고, 그 액포형 하이브리드 단백질을 코드하는 DNA 구축물을 액포형 DNA 구축물이라고도 한다. 

본 발명의 하이브리드 단백질은 화학적으로 합성할 수도 있고, 유전자 공학적으로 생산할 수도 있다. 유전 

자 공학적으로 생산하는 방법에 대해서는 후술한다. 

본 발명의 DNA 구축물은 본 발명의 하이브리드 단백질을 코드하는 DNA 를 포함하는 것을 특징으로 한다. 

즉, 본 발명의 DNA 구축물은 2 개 또는 3 개의 세균 독소 단백질을 코드하는 DNA 가 상기 펩티드를 코드하는 

DNA 를 통해 탠덤으로 연결되어 있는 DNA 를 포함한다. 상기 펩티드를 코드하는 DNA 는 예를 들어 배열 번 

호 1 (PG12), 배열 번호 81 (PG17), 배열 번호 83 (PG22) 으로 나타낸다. 세균 독소 단백질을 코드하는 

DNA 로서 예를 들어 Stx2eA 를 코드하는 DNA (배열 번호 3), Stx2eB 를 코드하는 DNA (배열 번호 5) 나 CTB 를 

코드하는 DNA (배열 번호 7) 를 들 수 있다. 상기 펩티드를 코드하는 DNA 와 세균 독소 단백질을 코드하는 DNA 

는 종지 코돈을 제외하고 리딩 프레임을 맞추어 연결된다. 

세균 독소 단백질을 코드하는 DNA 는 예를 들어 배열 번호 3, 5, 7 의 염기 배열에 기초하여, 일반적인 유전자 

공학적인 수법에 의해 얻을 수 있다. 구체적으로는, 각 세균 독소를 생산하는 세균으로부터 통상적인 방법 

에 따라 cDNA 라이브러리를 조제하고, 그 라이브러리로부터 상기 염기 배열에 기초하여 제작한 프로브를 사용하 

여 원하는 클론을 선택한다. 또한, 상기 염기 배열을 기본으로 한 화학 합성, 상기 염기 배열의 5' 및 3' 

말단의 염기 배열을 프라이머로 하고, 게놈 DNA 를 주형 (鑄型) 으로 한 PCR 등에 의해 합성할 수도 있다. 

본 발명의 하이브리드 단백질을 코드하는 DNA 는 예를 들어 배열 번호 9, 11, 13, 15, 85, 87, 89, 91, 93, 

95, 97 또는 99 로 나타낸다. 

하이브리드 단백질을 코드하는 DNA 는 그 단백질을 생산시키는 숙주 세포에 따라 하이브리드 단백질의 번역량이 

증대되도록, 하이브리드 단백질을 구성하는 아미노산을 나타내는 코돈이 적절히 개변되어 있는 것도 

바람직하다. 

코돈 개변의 방법으로는, 예를 들어 Kang et al. (2004) 의 방법을 참고로 할 수 있다. 또한, 숙주 세포에 

있어서 사용 빈도가 높은 코돈을 선택하거나, GC 함량이 많은 코돈을 선택하거나, 숙주 세포의 하우스키핑 유전 

자에 있어서 사용 빈도가 높은 코돈을 선택하거나 하는 방법을 들 수 있다. 


또한, 하이브리드 단백질을 코드하는 DNA 는 배열 번호 9, 11, 13, 15, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97 또는 99 

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[0084] 

[0085] 

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[0087] 

[0088] 

[0089] 

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[0091] 

[0092] 

의 염기 배열을 갖는 DNA 와 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈하는 DNA 이어도 된다. 「스트린젠트 

한 조건」이란, 이른바 특이적인 하이브리드가 형성되고, 비특이적인 하이브리드가 형성되지 않는 조건을 말한 

다. 예를 들어, 동일성이 높은 2 개의 DNA 끼리, 바람직하게는 80 % 이상, 보다 바람직하게는 90 % 이상, 

특히 바람직하게는 95 % 이상의 동일성을 갖는 2 개의 DNA 가 하이브리다이즈하지만, 그것보다 동일성이 낮은 

2 개의 DNA 가 하이브리다이즈하지 않는 조건을 들 수 있다. 예를 들어 2×SSC (330 mM NaCl, 30 mM 시트 

르산), 42 ℃ 를 들 수 있고, 바람직하게는 0.1×SSC (330 mM NaCl, 30 mM 시트르산), 60 ℃ 를 들 수 있다. 

본 발명의 DNA 구축물에 있어서, 바람직하게는 상기 하이브리드 단백질을 코드하는 DNA 가 인핸서에 발현 가능 

하게 연결되어 있다. 여기서 「발현 가능」이란, 본 발명의 DNA 구축물이 적절한 프로모터를 포함하는 벡터 

에 삽입되고, 그 벡터가 적절한 숙주 세포에 도입된 경우에, 숙주 세포 내에서 상기 하이브리드 단백질이 생산 

되는 것을 말한다. 또한 「연결」이란, 2 개의 DNA 가 직접 결합되어 있는 경우도, 다른 염기 배열을 통해 

결합되어 있는 경우도 포함하는 개념이다. 

인핸서로는, Kozak 배열이나 식물 유래의 알코올디하이드로게나아제 유전자의 5'-비번역 영역을 들 수 있다. 

특히 바람직하게는, 상기 하이브리드 단백질을 코드하는 DNA 가 식물 유래의 알코올디하이드로게나아제 유전 

자의 5'-비번역 영역에 발현 가능하게 연결되어 있다. 

알코올디하이드로게나아제 유전자의 5'-비번역 영역이란, 알코올디하이드로게나아제를 코드하는 유전자의 전사 

개시점으로부터, 번역 개시점 (ATG, 메티오닌) 전까지의 염기 배열을 포함하는 영역을 말한다. 그 영역은 

번역량 증대 기능을 가지고 있다. 「번역량 증대 기능」이란, 구조 유전자에 코드된 정보가, 전사 후 번역 

되어 단백질이 산생될 때에, 번역에 의해 산생되는 단백질량을 증대시키는 기능을 말한다. 상기 영역은 식 

물에서 유래되면 되는데, 바람직하게는 가지과 (Solanaceae), 십자화과 (Brassicaceae), 국화과 (Asteraceae) 

에 속하는 식물, 더욱 바람직하게는 담배속 (Nicotiana), 애기장대속 (Arabidopsis), 상추속 (Lactuca) 등에 

속하는 식물, 보다 바람직하게는 담배 (Nicotiana tabacum), 애기장대 (Arabidopsis thaliana), 양상추 

(Lactuca sativa) 등에서 유래된다. 

상기 알코올디하이드로게나아제 유전자의 5'-비번역 영역으로는, 예를 들어 담배 (Nicotiana tabacum) 유래의 

알코올디하이드로게나아제 유전자의 5'-비번역 영역 (NtADH5'UTR) 인, 배열 번호 23 으로 나타내는 염기 배열로 

이루어지는 영역이 특히 바람직하다. 

식물 유래의 알코올디하이드로게나아제 유전자의 5'-비번역 영역은 예를 들어 알코올디하이드로게나아제를 고발 

현하고 있는 식물 배양 세포의 알코올디하이드로게나아제 유전자로부터 단리할 수 있다 (일본 공개특허공보 

2003-79372호 참조). 또한, 담배의 알코올디하이드로게나아제 유전자의 5'-비번역 영역 등, 그 염기 배열이 확 

정되어 있는 것에 대해서는, 화학 합성, 또는 그 영역의 5' 및 3' 말단의 염기 배열을 프라이머로 하고, 게놈 

DNA 를 주형으로 한 PCR 등에 의해 합성할 수도 있다. 또한, 염기 배열이 확정되어 있는 상기 영역의 일부 

를 프로브로서 사용함으로써, 다른 식물의 알코올디하이드로게나아제 유전자의 5'-비번역 영역을 탐색하고, 이 

것을 단리할 수도 있다. 

또한, 배열 번호 23 의 염기 배열로 나타내는 상기 알코올디하이드로게나아제 유전자의 5'-비번역 영역은, 번역 

량 증대 기능을 유지하고 있는 한, 1 또는 수 개의 염기의 치환, 결실, 삽입 또는 부가를 가지고 있어도 된다. 

이다. 

상기 「수 개」로는, 바람직하게는 2 ∼ 10 개, 더욱 바람직하게는 2 ∼ 5 개, 특히 바람직하게는 2 ∼ 3 개 

또한, 상기 알코올디하이드로게나아제 유전자의 5'-비번역 영역과 바람직하게는 85 % 이상, 특히 바람직하게는 

90 % 이상의 동일성을 가지며, 또한 번역량 증대 기능을 유지하고 있는 DNA 를 사용해도 된다. 

상기 영역이 목적으로 하는 번역량 증대 기능을 갖는지의 여부에 대해서는, 예를 들어 담배 배양 세포에 있어서 

GUS (β-글루쿠로니다아제) 유전자 또는 루시페라아제 유전자를 리포터 유전자로 한 트랜전트 에세이, 염색체에 

도입한 형질 전환 세포에서의 에세이 등에 의해 확인할 수 있다. 

본 발명의 DNA 구축물은 예를 들어 배열 번호 24 ∼ 29, 배열 번호 101 ∼ 111 중 어느 것으로 나타내는 염기 

배열을 갖는다. 


배열 번호 24 로 나타내는 염기 배열을 갖는 DNA 구축물은 담배 유래의 알코올디하이드로게나아제 유전자의 5'- 

비번역 영역 (NtADH5'UTR, 배열 번호 23) 에, 2 개의 Stx2eB 단백질을, PG12 를 통해 탠덤으로 연결한 하이브리 

드 단백질을 코드하는 DNA (배열 번호 9) 를 연결한 DNA 구축물이다. 또한, 배열 번호 25 로 나타내는 염기 

배열을 갖는 DNA 구축물은 NtADH5'UTR 에 2 개의 CTB 단백질을, PG12 를 통해 탠덤으로 연결한 하이브리드 단백 

- 11 -

[0093] 

[0094] 

[0095] 

[0096] 

[0097] 

[0098] 

[0099] 

[0100] 

[0101] 

[0102] 

질을 코드하는 DNA (배열 번호 11) 를 연결한 DNA 구축물이다. 

배열 번호 26 으로 나타내는 염기 배열을 갖는 DNA 구축물은 NtADH5'UTR 에 2 개의 Stx2eB 단백질을, PG12 를 

통해 탠덤으로 연결하고, 아미노 말단에 분비 시그널 펩티드를, 카르복실 말단에 소포체 잔류 시그널 펩티드를 

부가한 하이브리드 단백질을 코드하는 DNA 를 연결한 DNA 구축물이다. 또한, 배열 번호 27 로 나타내는 염 

기 배열을 갖는 DNA 구축물은 NtADH5'UTR 에 2 개의 CTB 단백질을, PG12 를 통해 탠덤으로 연결하고, 아미노 말 

단에 분비 시그널 펩티드를, 카르복실 말단에 소포체 잔류 시그널 펩티드를 부가한 하이브리드 단백질을 코드하 

는 DNA 를 연결한 DNA 구축물이다. 

배열 번호 28 로 나타내는 염기 배열을 갖는 DNA 구축물은 NtADH5'UTR 에 2 개의 Stx2eB 단백질을, PG12 를 통 

해 탠덤으로 연결하고, 아미노 말단에 분비 시그널 펩티드를 부가하고, 카르복실 말단에 PG12 를 연결하고, 또 

한 그 카르복실 말단에 소포체 잔류 시그널 펩티드를 부가한 하이브리드 단백질을 코드하는 DNA 를 연결한 DNA 

구축물이다. 또한, 배열 번호 29 로 나타내는 염기 배열을 갖는 DNA 구축물은 NtADH5'UTR 에 2 개의 CTB 단 

백질을, PG12 를 통해 탠덤으로 연결하고, 아미노 말단에 분비 시그널 펩티드를 부가하고, 카르복실 말단에 

PG12 를 연결하고, 또한 그 카르복실 말단에 소포체 잔류 시그널 펩티드를 부가한 하이브리드 단백질을 코드하 

는 DNA 를 연결한 DNA 구축물이다. 

배열 번호 101 로 나타내는 염기 배열을 갖는 DNA 구축물은 NtADH5'UTR 에 2 개의 Stx2eB 단백질을, PG12 를 

통해 탠덤으로 연결하고, 카르복실 말단에 PG12 를 연결한 하이브리드 단백질을 코드하는 DNA 를 연결한 DNA 구 

축물이다. 

배열 번호 102 로 나타내는 염기 배열을 갖는 DNA 구축물은 NtADH5'UTR 에 2 개의 Stx2eB 단백질을, PG17 을 

통해 탠덤으로 연결하고, 아미노 말단에 분비 시그널 펩티드를 부가하고, 카르복실 말단에 PG12 를 연결하고, 

또한 그 카르복실 말단에 소포체 잔류 시그널 펩티드를 부가한 하이브리드 단백질을 코드하는 DNA 를 연결한 

DNA 구축물이다. 또한, 배열 번호 103 으로 나타내는 염기 배열을 갖는 DNA 구축물은 NtADH5'UTR 에 2 개의 

Stx2eB 단백질을, PG22 를 통해 탠덤으로 연결하고, 아미노 말단에 분비 시그널 펩티드를 부가하고, 카르복실 

말단에 PG12 를 연결하고, 또한 그 카르복실 말단에 소포체 잔류 시그널 펩티드를 부가한 하이브리드 단백질을 

코드하는 DNA 를 연결한 DNA 구축물이다. 

배열 번호 104 로 나타내는 염기 배열을 갖는 DNA 구축물은 NtADH5'UTR 에 2 개의 Stx2eB 단백질을, PG12 를 

통해 탠덤으로 연결하고, 아미노 말단에 엽록체 이행 시그널 펩티드를 부가하고, 카르복실 말단에 PG12 를 연결 

한 하이브리드 단백질을 코드하는 DNA 를 연결한 DNA 구축물이다. 

배열 번호 105 로 나타내는 염기 배열을 갖는 DNA 구축물은 NtADH5'UTR 에 3 개의 Stx2eB 단백질을, 각각 PG12 

를 통해 탠덤으로 연결하고, 카르복실 말단에 PG12 를 연결한 하이브리드 단백질을 코드하는 DNA 를 연결한 DNA 

구축물이다. 

배열 번호 106 으로 나타내는 염기 배열을 갖는 DNA 구축물은 NtADH5'UTR 에 3 개의 Stx2eB 단백질을, 각각 

PG12 를 통해 탠덤으로 연결하고, 아미노 말단에 분비 시그널 펩티드를 부가하고, 카르복실 말단에 PG12 를 연 

결하고, 또한 그 카르복실 말단에 소포체 잔류 시그널 펩티드를 부가한 하이브리드 단백질을 코드하는 DNA 를 

연결한 DNA 구축물이다. 

배열 번호 107 로 나타내는 염기 배열을 갖는 DNA 구축물은 NtADH5'UTR 에 3 개의 Stx2eB 단백질을, 각각 PG12 

를 통해 탠덤으로 연결하고, 아미노 말단에 엽록체 이행 시그널 펩티드를 부가하고, 카르복실 말단에 PG12 를 

연결한 하이브리드 단백질을 코드하는 DNA 를 연결한 DNA 구축물이다. 

배열 번호 108 로 나타내는 염기 배열을 갖는 DNA 구축물은 NtADH5'UTR 에 2 개의 CTB 단백질을, PG12 를 통해 

탠덤으로 연결하고, 카르복실 말단에 PG12 를 연결한 하이브리드 단백질을 코드하는 DNA 를 연결한 DNA 구축물 

이다. 


배열 번호 109 로 나타내는 염기 배열을 갖는 DNA 구축물은 NtADH5'UTR 에 2 개의 CTB 단백질을, PG17 을 통해 

탠덤으로 연결하고, 아미노 말단에 시그널 펩티드를 부가하고, 카르복실 말단에 PG12 를 연결하고, 또한 그 카 

르복실 말단에 소포체 잔류 시그널 펩티드를 부가한 하이브리드 단백질을 코드하는 DNA 를 연결한 DNA 구축물이 

다. 또한, 배열 번호 110 으로 나타내는 염기 배열을 갖는 DNA 구축물은 NtADH5'UTR 에 2 개의 CTB 단백질 

을, PG22 를 통해 탠덤으로 연결하고, 아미노 말단에 시그널 펩티드를 부가하고, 카르복실 말단에 PG12 를 연결 

하고, 또한 그 카르복실 말단에 소포체 잔류 시그널 펩티드를 부가한 하이브리드 단백질을 코드하는 DNA 를 연 

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[0108] 

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[0114] 

결한 DNA 구축물이다. 

배열 번호 111 로 나타내는 염기 배열을 갖는 DNA 구축물은 NtADH5'UTR 에 2 개의 CTB 단백질을, PG12 를 통해 

탠덤으로 연결하고, 아미노 말단에 엽록체 이행 시그널 펩티드를 부가하고, 카르복실 말단에 PG12 를 연결한 하 

이브리드 단백질을 코드하는 DNA 를 연결한 DNA 구축물이다. 

본 발명의 DNA 구축물은 일반적인 유전자 공학적 수법에 의해 제작할 수 있고, 식물 유래의 알코올디하이드로게 

나아제 유전자의 5'-비번역 영역, 식물 유래의 분비 시그널 펩티드를 코드하는 DNA, 엽록체 이행 시그널 펩티드 

를 코드하는 DNA, 및 세균 독소 단백질을 코드하는 DNA, 소포체 잔류 시그널 펩티드를 코드하는 DNA 등의 각 

DNA 를, 각각 적당한 제한 효소에 의해 절단하고, 적당한 리가아제로 연결함으로써 구축할 수 있다. 

본 발명의 재조합 벡터는 본 발명의 DNA 구축물을 포함하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 재조합 벡터는 

본 발명의 하이브리드 단백질을 코드하는 DNA 가 벡터가 도입되는 숙주 세포에 있어서 발현 가능하도록 벡터 내 

에 삽입되어 있으면 된다. 벡터는 숙주 세포에 있어서 복제 가능한 것이면 특별히 제한되지 않고, 예를 들 

어 플라스미드 DNA, 바이러스 DNA 등을 들 수 있다. 또한, 벡터는 약제 내성 유전자 등의 선택 마커를 포함 

하는 것이 바람직하다. 플라스미드 DNA 는 대장균이나 아그로박테리움으로부터 알칼리 추출법 (Birnboim, 

H. C. & Doly, J.(1979) Nucleic acid Res 7 : 1513) 또는 그 변법 등에 의해 조제할 수 있다. 또한, 시판 

되는 플라스미드로서 예를 들어 pBI221, pBI121, pBI101, pIG121Hm 등을 사용할 수도 있다. 바이러스 DNA 

로는, 예를 들어 pTB2 (Donson et al., 1991) 등을 사용할 수 있다 (Donson J., Kerney CM., Hilf ME., Dawson 

WO. Systemic expression of a bacterial gene by a tobacco mosaic virus-based vector. Proc. Natl. Acad. 

Sci.(1991) 88 : 7204-7208 을 참조). 

벡터 내에서 사용되는 프로모터는 벡터가 도입되는 숙주 세포에 따라 적절히 선택할 수 있다. 예를 들어 콜 

리플라워 모자이크 바이러스 35S 프로모터 (Odell et al. 1985 Nature 313 : 810), 벼의 액틴 프로모터 (Zhang 

et al. 1991 Plant Cell 3 : 1155), 옥수수의 유비퀴틴 프로모터 (Cornejo et al. 1993 Plant Mol. Biol. 23 : 

567) 등이 바람직하게 사용된다. 또한, 벡터 내에서 사용되는 터미네이터도 마찬가지로 벡터가 도입되는 숙 

주 세포에 따라 적절히 선택할 수 있다. 예를 들어 노팔린 합성 효소 유전자 전사 터미네이터, 콜리플라워 

모자이크 바이러스 35S 터미네이터 등이 바람직하게 사용된다. 

본 발명의 재조합 벡터는 예를 들어 이하와 같이 하여 제작할 수 있다. 

먼저, 본 발명의 DNA 구축물을 적당한 제한 효소로 절단 또는 PCR 에 의해 제한 효소 부위를 부가하고, 벡터의 

제한 효소 부위 또는 멀티 클로닝 사이트에 삽입한다. 

본 발명의 형질 전환체는 본 발명의 재조합 벡터로 형질 전환되어 있는 것을 특징으로 한다. 형질 전환에 

사용되는 숙주 세포는 진핵 세포 및 원핵 세포 중 어느 것이어도 된다. 

진핵 세포로는 식물 세포가 바람직하게 사용되고, 그 중에서도 국화과 (Asteraceae), 가지과, 십자화과, 명아주 

과에 속하는 식물 세포가 바람직하게 사용된다. 또한, 상추속 (Lactuca) 에 속하는 식물 세포, 그 중에서도 

양상추 (Lactuca sativa) 세포가 바람직하게 사용된다. 숙주 세포로서 양상추 세포를 사용하는 경우에는, 

벡터는 콜리플라워 모자이크 바이러스 35S RNA 프로모터 등을 사용할 수 있다. 

원핵 세포로는 대장균 (Escherichia coli), 아그로박테리움 (Agrobacterium tumefaciens) 등이 사용된다. 

본 발명의 형질 전환체는 일반적인 유전자 공학적 수법을 사용하여 본 발명의 벡터를 숙주 세포에 도입함으로써 

제작할 수 있다. 예를 들어 아그로박테리움을 이용한 도입 방법 (Hood, et al., 1993, Transgenic, Res. 2 

: 218, Hiei, et al., 1994 Plant J. 6 : 271), 일렉트로 포레이션법 (Tada, et al., 1990, Theor. Appl. 

Genet, 80 : 475), 폴리에틸렌글리콜법 (Lazzeri, et al., 1991, Theor. Appl. Genet. 81 : 437), 파티클건법 

(Sanford, et al., 1987, J. Part. Sci. tech. 5 : 27), 폴리카티온법 (Ohtsuki) 등의 방법을 사용할 수 있다. 

본 발명의 벡터를 숙주 세포에 도입한 후, 선택 마커의 표현형에 따라 본 발명의 형질 전환체를 선발할 수 

있다. 또한, 선발한 형질 전환체를 배양함으로써 상기 세균 독소 단백질을 생산할 수 있다. 배양에 사 

용하는 배지 및 조건은 형질 전환체의 종에 따라 적절히 선택할 수 있다. 


또한, 숙주 세포가 식물 세포인 경우에는, 선발한 식물 세포를 통상적인 방법에 따라 배양함으로써 식물체를 재 

생할 수 있고, 식물 세포 내 또는 식물 세포의 세포막 외에 상기 세균 독소 단백질을 축적시킬 수 있다. 예 

를 들어, 식물 세포의 종류에 따라 상이하지만, 감자이면 Visser 들 (Theor. Appl. Genet 78 : 594 (1989)) 의 

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[0120] 










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방법을 들 수 있고, 담배이면 Nagata 와 Takebe (Planta 99 : 12 (1971)) 의 방법을 들 수 있다. 

양상추의 경우에는 0.1 ㎎/ℓ 의 NAA (나프탈렌아세트산), 0.05 ㎎/ℓ 의 BA (벤질아데닌) 및 0.5 g/ℓ 의 

polyvinylpyrrolidone 을 함유하는 MS 배지에서 슛의 재생이 가능하고, 재생한 슛을 0.5 g/ℓ 의 

polyvinylpyrrolidone 을 함유하는 1/2 MS 배지에서 배양함으로써 발근이 가능하다. 

또한, 본 발명의 종자는 상기와 같이 하여 재생한 식물체로부터 종자를 채취함으로써 얻을 수 있다. 본 발 

명의 종자는 적당한 방법으로 파종하여 재배함으로써, 상기 세균 독소 단백질을 생산하는 식물체로 할 수 있고, 

이와 같은 식물체도 본 발명의 형질 전환체에 포함된다. 

실시예 

일과성 발현 실험 

(1) Stx2eB 일과성 발현 벡터의 구축 

Stx2e 단백질의 B 서브유닛 (Stx2eB) 을 코드하는 DNA (배열 번호 5) 가 담배 알코올디하이드로게나아제 유전자 

의 5' 비번역 영역 (NtADH5'UTR) 에 연결된 DNA 구축물을 포함하는 벡터를 이하와 같이 하여 제작하였다. 

벡터의 디자인을 도 1 에 나타낸다. 

1×Stx2eB(PG12) 는 Stx2eB 를 코드하는 DNA 에 PG12 를 코드하는 DNA 를 연결한 DNA 를 포함하는 DNA 구축물 

을 나타낸다. 2×Stx2eB(PG12) 는 2 개의 Stx2eB 를 코드하는 DNA 를, PG12 를 코드하는 DNA 를 스페이서 

로 하여 연결한 DNA 를 포함하는 DNA 구축물을 나타낸다. 

또한, 3 개의 Stx2eB 를 코드하는 DNA 를, PG12 를 코드하는 DNA 를 스페이서로 하여 연결한 DNA 구축물, 3× 

Stx2eB(PG12), 및 4 개의 Stx2eB 를 코드하는 DNA 를, PG12 를 코드하는 DNA 를 스페이서로 하여 연결한 DNA 

구축물, 4×Stx2eB(PG12) 도 제작하였다. 

구체적 수법을 이하에 나타낸다. 

Kozak-stx2eb-F 프라이머 (배열 번호 30) 와 stx2eb-R 프라이머 (배열 번호 31) 를 사용하여 PCR 을 실시하고, 

Stx2eB 의 성숙 영역 (페리플라즘에 대한 분비 시그널 펩티드를 제외한, Ala19 ∼ Asn87) 을 코드하는 DNA 단편 

을 증폭시켰다. 얻어진 DNA 단편을 pBluescript II SK 의 EcoRV 갭에 클로닝하였다. 얻어진 플라스미드를 

HindIII 으로 절단하고, T4 DNA polymerase 로 처리한 후 셀프 라이게이션을 실시하고, HindIII 사이트를 NheI 

사이트로 변환하였다 (plasmid 1). 

Stx2eB 를 이하와 같이 하여 식물 세포에 있어서의 일과성 발현용 벡터, pBI221 (Clontech 사) 의 멀티 클로닝 

사이트 (MCS) 에 삽입하였다. 

MCS 에 SalI, KpnI 및 SmaI 사이트를 도입하기 위해서, SalKpnSma-F (배열 번호 32) 와 SalKpnSma-R (배열 번 

호 33) 을 어닐링 후, T4 polynucleotide kinase (T4 PNK) (TaKaRa 사) 를 사용하여 인산화하고, pBI221 의 

SacI 갭에 삽입하였다 (plasmid 2). Plasmid 1 로부터 XbaI 과 KpnI 로 Stx2eB 단편을 잘라내고, plasmid 

2 에 삽입하고, 콜리플라워 모자이크 바이러스 35S RNA 프로모터 (35S pro.) 와 노팔린 합성 효소 유전자 전사 

터미네이터 (NOS-T) 사이에 배치하였다 (plasmid 3). 

담배 알코올디하이드로게나아제 유전자의 5' 비번역 영역 (NtADH 5'UTR, 배열 번호 23) 을, ADH-221 (Sato et. 

al., 2004 (하기 참조)) 을 주형으로 하여, ADH XbaI-F 프라이머 (배열 번호 34) 및 ADH NsiI-R 프라이머 (배 

열 번호 35) 를 사용한 PCR 에 의해 증폭시켰다. β-D glucan exohydrolase (GenBank ACCESSION AB017502) 

의 분비 시그널 펩티드 (배열 번호 18) 를 코드하는 DNA 영역 (배열 번호 17) 을, 담배 게놈 DNA 를 주형으로 

하여, βD NsiI-F 프라이머 (배열 번호 36) 및 βD BamHI-R 프라이머 (배열 번호 37) 를 사용하여 증폭시켰다. 

얻어진 NtADH 5'UTR 및 분비 시그널 펩티드의 각 DNA 단편을 NsiI (TOYOBO 사 제조) 로 처리하고, Ligation 

High (TOYOBO 사) 를 사용하여 라이게이션한 후, 말단을 평활화하고 pBluescript II SK (Stratagene 사 제조) 

의 EcoRV 갭에 클로닝하였다 (plasmid 4). 

Satoh et al., The 5'-untranslated region of the tobacco alcohol dehydrogenase gene functions as an 

effective translational enhancer in plant. J. Biosci. Bioeng. (2004) 98, 1-8 


Plasmid 4 를 NsiI 로 처리하고, T4 DNA polymerase (TOYOBO 사 제조) 로 말단을 평활화한 후 셀프 라이게이션 

하고, NtADH 의 개시 코돈 (atg) 과 분비 시그널 펩티드의 개시 코돈이 일치하도록 연결하였다 (plasmid 5). 

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NtADH 5'UTR 단편 및 분비 시그널 펩티드의 연결 DNA 를, plasmid 5 를 주형으로서 사용하고, ADH XbaI-F 프라 

이머 (배열 번호 34) 와 βD BamHI-R 프라이머 (배열 번호 35) 를 사용하여 증폭시켰다. 얻어진 DNA 

단편을, XbaI 와 BamHI 로 처리하고, plasmid 3 의 XbaI-BamHI 갭에 삽입하였다 (plasmid 6). 

소포체 잔류 시그널 (배열 번호 38) 부가를 위해서, HDEL-F 프라이머 (배열 번호 39) 와 HDEL-R 프라이머 (배열 

번호 40) 를 어닐링하고 T4 PNK 로 인산화하고, 알칼리 포스파타아제 (AP) (TaKaRa 사) 로 탈인산화 처리한 

plasmid 6 의 BglII 갭에 삽입하였다 (plasmid 7). 

Stx2eB 검출용 펩티드 태그로서 HA 태그를 부가하였다. HA 태그의 부가를 위해서, HA-F 프라이머 (배열 번 

호 41) 와 HA-R 프라이머 (배열 번호 42) 를 어닐링하고 T4 PNK 로 인산화하였다. 얻어진 인산화 HA 단편을 

plasmid 7 의 BglII 갭에 삽입하였다 (plasmid 8). 

Stx2eB 와 HA 태그 사이에 PG12 스페이서 (배열 번호 2) 를 삽입하였다. PG12-F 프라이머 (배열 번호 43) 와 

PG12-R 프라이머 (배열 번호 44) 를 어닐링하고 T4 PNK 로 인산화하였다. 얻어진 인산화 DNA 단편을 

plasmid 8 의 BglII 갭에 삽입하였다 (1×Stx2eB(PG12)). 

1×Stx2eB(PG12) 로부터 BamHI 및 BglII 를 사용하여 2eB-PG12 단편을 잘라내고, 1×Stx2eB(PG12) 의 BamHI 갭 

에 삽입하였다 (2×Stx2eB(PG12)). 또한, 1×Stx2eB(PG12) 로부터 BamHI 및 BglII 를 사용하여 Stx2eB- 

PG12 단편을 잘라내고, 2×Stx2eB(PG12) 의 BamHI 갭에 삽입하였다 (3×Stx2eB(PG12)). 또한, 2× 

Stx2eB(PG12) 로부터 BamHI 및 BglII 를 사용하여 2×(Stx2eB-PG12) 단편을 잘라내고, 2×Stx2eB(PG12) 의 

BamHI 갭에 삽입하였다 (4×Stx2eB(PG12)). 

(2) CTB 일과성 발현 벡터의 구축 

CT 단백질의 B 서브유닛 (CTB) 을 코드하는 DNA 가 담배 알코올디하이드로게나아제 유전자의 5' 비번역 영역에 

연결된 DNA 구축물 (2×CTB(PG12)) 을 포함하는 벡터를 이하와 같이 하여 제작하였다. 

CTB 의 성숙 영역 (페리플라즘에 대한 분비 시그널을 제외한, Thr22 ∼ Asn124) (배열 번호 8) 을 코드하는 DNA 

(배열 번호 7) 를 제작하였다. 먼저, 이하의 10 종류의 프라이머를 제작하였다. 

CTB1 : 배열 번호 45 










상기에서 합성한 프라이머를 사용하고, Kang et al.(2004) 에 기재된 조건에서 PCR 을 실시하였다. 즉, 

CTB1 과 CTB2, CTB3 과 CTB4, CTB5 와 CTB6, CTB7 과 CTB8, CTB9 와 CTB10 의 조합으로 PCR 을 실시하고, 각각 

72bp (1+2), 74bp (3+4), 67bp (5+6), 82bp (7+8), 68bp (9+10) 의 DNA 단편을 합성하였다. 다음으로 

CTB1+2 와 CTB3+4, CTB3+4 와 CTB5+6, CTB5+6 과 CTB7+8, CTB7+8 과 CTB9+10 의 조합으로 2nd PCR 을 

실시하고, 135bp (1+2+3+4), 132bp (3+4+5+6), 138bp (5+6+7+8) 및 141bp (7+8+9+10) 의 DNA 단편을 합성하였 

다. 다음으로 CTB1+2+3+4 와 CTB3+4+5+6, 및 CTB5+6+7+8 과 CTB7+8+9+10 의 조합으로 3rd PCR 을 

실시하고, 194bp (1+2+3+4+5+6) 및 198bp (5+6+7+8+9+10) 의 DNA 단편을 합성하였다. 마지막으로 

CTB1+2+3+4+5+6 과 CTB5+6+7+8+9+10 의 조합으로 PCR 을 실시하고, 315bp 의 CTB 코드 영역에 BamHI 사이트와 

BglII 사이트가 부가된 DNA 단편을 합성하였다. 


상기에서 제작한 DNA 단편을 BamHI 및 BglII 로 처리하고, Plasmid 8 의 BamHI-BglII 갭에 삽입하였다 

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(plasmid 9). 

CTB 와 HA 태그 사이에 PG12 스페이서 (배열 번호 2) 를 삽입하였다. PG12-F 프라이머 (배열 번호 43) 와 

PG12-R 프라이머 (배열 번호 44) 를 어닐링하고 T4 PNK 로 인산화하였다. 얻어진 인산화 DNA 단편을 

plasmid 9 의 BglII 갭에 삽입하였다 (1×CTB(PG12)). 

1×CTB(PG12) 로부터 BamHI 및 BglII 를 사용하여 CTB-PG12 단편을 잘라내고, 1×CTB(PG12) 의 BamHI 갭에 삽 

입하였다 (2×CTB(PG12)). 

(3) 양상추 프로토플라스트를 사용한 일과성 발현 실험 

화분에 심은 양상추 (Lactuca sativa) (그린 웨이브) 의 잎, 약 1 g 을 메스로 사방 0.5 ㎝ 정도로 잘게 썰어 

리프 디스크를 제작하였다. 리프 디스크를 500 mM 만니톨에 침지시켜 1 시간 진탕하였다. 리프 디스크 

를 50 ㎖ 의 프로토플라스트화 효소 용액 (1.0 % cellulose RS (야쿠르트 본사), 0.25 % macerozyme R-10 

(야쿠르트 본사), 400 mM 만니톨, 8 mM CaCl2, and 5 mM Mes-KOH, pH 5.6) 에 침지시켜 실온에서 2 시간 진탕하 

였다. 프로토플라스트 현탁액을 100 ㎛ 및 40 ㎛ 의 메시에 통과시켜 리프 디스크를 제거하였다. 프로 

토플라스트 현탁액을 60 g 으로 5 분간 원심하고, 프로토플라스트를 침전시켰다. 프로토플라스트를 167 mM 

만니톨 및 133 mM CaCl2 를 함유하는 수용액에 재현탁하고, 40 g 으로 5 분간 원심하였다. 프로토플라스트 

를 333 mM 만니톨 및 66.7 mM CaCl2 를 함유하는 수용액에 재현탁하고, 40 g 으로 5 분간 원심하였다. 프로 

토플라스트를 W5 solution (154 mM NaCl, 125 mM CaCl2, 5 mM KCl, 2 mM Mes-KOH, pH 5.6) 에 현탁하고, 빙상 

에 1 시간 정치 (靜置) 시켰다. 프로토플라스트 현탁액을 40 g 으로 5 분간 원심하고, 프로토플라스트 농도 

가 2×10 6 

하였다. 

개/㎖ 가 되도록 MaMg solution (400 mM 만니톨, 15 mM MgCl2, and 4 mM Mes-KOH, pH 5.6) 에 현탁 

상기에서 제작한 각 Stx2eB 일과성 발현 벡터, CTB 일과성 발현 벡터를, 각각 120 ㎕ 의 프로토플라스트 현탁액 

과 혼합한 후, 140 ㎕ 의 PEG solution (400 mM 만니톨, 100 mM Ca(NO3)2, and 40 % PEG) 을 첨가하여 서서히 

혼화시키고, 7 분간 인큐베이트하였다. 약 20 분간에 걸쳐 1 ㎖ 의 W5 solution 을 프로토플라스트 현탁액 

에 첨가하였다. 원심에 의해 침전시킨 프로토플라스트에 400 mM 만니톨과 W5 solution 을 4 : 1 의 비율로 

혼합한 용액을 1 ㎖ 첨가하였다. 원심에 의해 침전시킨 프로토플라스트에 1 % 수크로오스, 400 mM 만니톨 

및 0.3 mM 카르베니실린을 함유하는 LS 배지를 1 ㎖ 첨가하고, 어두운 곳 25 ℃ 에서 24 시간 배양하였다. 

(4) 웨스턴 해석 

원심에 의해 회수한 프로토플라스트에 30 ㎕ 의 SDS-sample buffer (4 % (w/v) SDS, 20 % (w/v) glycerol, 

0.05 % (w/v) 브로모페놀 블루, 300 mM β-메르캅토에탄올, 125 mM Tris-HCl, pH 6.8) 를 첨가하고, 95 ℃ 에 

서 2 분간 열변성시켜 시료로 하였다. 15 % 아크릴아미드 겔을 사용하여 단백질을 분리 후, 일렉트로 트랜 

스퍼 장치를 사용하여 PVDF 멤브레인 (Hybond-P ; Amersham 사) 상에 단백질을 블롯하였다. 항 HA 항체 

(No. 11 867 423 001, Roche) 를 사용하여 Stx2eB 및 CTB 를 검출하였다. 

(a) Stx2eB 의 연결수의 영향 

결과를 도 2 에 나타낸다. 

1×Stx2eB(PG12) 를 발현시킨 경우에는, 약 8.5 kDa 의 위치에 시그널이 검출되었다. 2×Stx2eB(PG12) 를 

발현시킨 경우에는, 약 17 kDa 의 위치에, 1×Stx2eB(PG12) 를 발현시킨 경우와 동일한 정도의 시그널이 검출되 

었다. 3×Stx2eB(PG12) 를 발현시킨 경우에는, 약 26 kDa 의 위치에, 1×Stx2eB(PG12) 를 발현시킨 경우보 

다 작은 시그널이 검출되었다. 이들은 모두 DNA 구축물의 디자인으로부터 추정한 분자량과 일치하였다. 

또한, 4×Stx2eB(PG12) 를 발현시킨 경우에는, 특이적 시그널은 검출 한계 이하였다. 

이상의 결과로부터 2×Stx2eB(PG12) 및 3×Stx2eB(PG12) 를 발현시키면, 복수의 Stx2eB 단백질이 연결된 하이브 

리드 단백질을 생산할 수 있음이 분명해졌다. 


또한, 상기 각 DNA 구축물은 HA 태그를 1 분자씩 함유하기 때문에 (도 1 참조), 2×Stx2eB(PG12) 를 발현시킨 

경우에는, 1×Stx2eB(PG12) 를 발현시킨 경우의 약 2 배의 Stx2eB 단백질에 상당하는 단백질을 축적하고 있는 

것으로 생각된다. 즉, 2 개의 Stx2eB 단백질을 코드하는 DNA 를, PG12 를 코드하는 DNA 를 통해 연결한 경우에 

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는, 매우 효율적으로 Stx2eB 단백질을 생산할 수 있음을 알 수 있었다. 

한편, 3 개의 Stx2eB 단백질을 코드하는 DNA, 4 개의 Stx2eB 단백질을 코드하는 DNA 를, PG12 를 코드하는 DNA 

를 통해 연결한 경우에는, Stx2eB 단백질의 생산은 1 개의 Stx2eB 단백질의 동등 이하임을 알 수 있었다. 

또한, 본 실험으로 제작한, 카르복실 말단에 PG12 가 부가된 Stx2eB 단백질 (1×Stx2eB(PG12)) 은, 이것이 부가 

되지 않는 Stx2eB 단백질과 비교하여, 단백질의 축적 레벨이 높은 경향이 있음을 알 수 있었다. 이것으로부 

터, 본 발명의 하이브리드 단백질은 카르복실 말단에 PG12 가 부가되는 것이 바람직한 형태인 것으로 추찰된다. 

(b) CTB 의 연결수의 영향 


1×CTB(PG12) 를 발현시킨 경우에는, 약 20 kDa 의 위치에 시그널이 검출되었다. 2×CTB(PG12) 를 발현시킨 

경우에는, 약 33 kDa 및 약 35 kDa 의 위치에, 1×CTB(PG12) 를 발현시킨 경우보다 큰 시그널이 검출되었다. 

이상의 결과로부터, 2×CTB(PG12) 를 발현시키면, 2 개의 CTB 단백질이 연결된 하이브리드 단백질을 생산할 수 

있음이 분명해졌다. 이들은 모두 DNA 구축물의 디자인으로부터 추정한 분자량과 일치하였다. 

또한, 상기 각 DNA 구축물은 HA 태그를 1 분자씩 함유하기 때문에, 2×CTB(PG12) 를 발현시킨 경우에는, 1× 

CTB(PG12) 를 발현시킨 경우의 2 배보다 큰 CTB 단백질에 상당하는 단백질이 축적되어 있는 것으로 생각된다. 

즉, 2 개의 CTB 단백질을 코드하는 DNA 를, PG12 를 코드하는 DNA 를 통해 연결한 경우에는, 매우 효율적으 

로 CTB 단백질을 생산할 수 있음을 알 수 있었다. 

(5) Stx2eB 의 국재 해석 

세포에 있어서의 Stx2eB 의 국재를 해석하기 위해서, Stx2eB 와 황색 형광 단백질 YFP 의 하이브리드 단백질의 

일과성 발현 벡터를 제작하였다. 벡터의 디자인을 도 4 에 나타낸다. 1×Stx2eB(PG12)-YFP 는 1 개의 

Stx2eB 단백질을 코드하는 DNA 와 YFP 를 코드하는 DNA 가 연결된 DNA 구축물을 나타낸다. 2× 

Stx2eB(PG12)-YFP 는 2 개의 Stx2eB 단백질이 PG12 를 통해 연결된 하이브리드 단백질을 코드하는 DNA 와 YFP 

를 코드하는 DNA 가 연결된 DNA 구축물을 나타낸다. 또한, 스페이서로서 PG12 대신에 RS (Arg Ser) 를 사용한 2 

×Stx2eB(RS)-YFP 도 제작하였다. 

이하에 구체적인 수법을 나타낸다. 

먼저, YFP 의 DNA 단편을, pEYFP (Clontech) 를 주형으로 하고, YFP-F 프라이머 (배열 번호 55) 및 YFP-R 프라 

이머 (배열 번호 56) 를 사용하여 PCR 에 의해 증폭시켰다. 얻어진 DNA 단편을 BamHI 및 BglII 로 

처리하고, Plasmid 8 의 BamHI-BglII 갭에 삽입하였다 (ER-YFP). 

plasmid 1 로부터 BamHI 및 BglII 를 사용하여 Stx2eB 단편을 잘라내고, 상기 1×Stx2eB(PG12) 의 BamHI 갭에 

삽입하였다 (2×Stx2eB(RS)). 

1×Stx2eB(PG12), 2×Stx2eB(RS) 및 2×Stx2eB(PG12) 로부터, BamHI-BglII 를 사용하여, 각각 Stx2eB-PG12 단 

편, 2×(Stx2eB-RS) 단편 및 2×(Stx2eB-PG12) 단편을 잘라내고, ER-YFP 의 BamHI 갭에 삽입하였다 (1× 

Stx2eB(PG12)-YFP, 2×Stx2eB(RS)-YFP 및 2×Stx2eB(PG12)-YFP). 

한편, 소포체를 가시화하기 위한 벡터로서 소포체 국재형 적색 형광 단백질 (mRFP, Campbell R.E. et al. 

(2002) (하기 참조)) 의 발현 벡터를 제작하였다. mRFP-F 프라이머 (배열 번호 57) 와 mRFP-R 프라이머 (배열 

번호 58) 를 사용하여 PCR 을 실시하였다. 얻어진 DNA 단편을 BamHI 및 BglII 로 처리하고, Plasmid 8 의 

BamHI-BglII 갭에 삽입하였다 (ER-mRFP). 

Campbell R.E. et al., A monomeric red fluorescent protein (2002) Proc. Nat. Acad. Sci. 99 : 7877-7882 

상기 Stx2eB 의 발현 벡터와 mRFP 발현 벡터를 상기 방법과 동일하게 하여 담배 배양 세포 (BY2) 의 프로토플라 

스트에 도입하고, 모두 초점 현미경 관찰 (LSM510, Zeiss) 을 이용하여 관찰하였다. 

결과를 도 5 및 6 에 나타낸다. 

도 5 는 Stx2eB-YFP 하이브리드 단백질의 국재를 나타낸다. 2×Stx2eB(PG12)-YFP 를 발현시킨 경우에는, 

Stx2eB-YFP 하이브리드 단백질이 100 개/세포 정도, 과립상으로 국재되어 있는 것이 관찰되었다. 1× 

Stx2eB(PG12)-YFP 및 2×Stx2eB(RS)-YFP 를 발현시킨 경우에는, 과립은 관찰되지 않았다. 

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도 6 중, 최좌열의 화상 A 는 어느 프로토플라스트에 있어서의 mRFP 의 국재를 나타낸다. mRFP 의 국재는 

소포체의 위치를 반영한다. 중열의 화상 B 는 동일한 프로토플라스트에 있어서의 Stx2eB-YFP 하이브리드 단 

백질의 국재를 나타낸다. 최우열의 화상은 화상 A 및 B 의 합성 화상이다. 합성 화상으로부터, Stx2eB- 

YFP 하이브리드 단백질은 소포체에 과립상으로 국재되어 있음을 알 수 있다. 

(6) 소포 수송 기능의 영향 

2×Stx2eB(PG12) 의 축적 및 응집이 단백질 번역 후의 어느 과정에서 일어나는지 조사하였다. 

2×Stx2eB(PG12)-YFP 를, 애기장대의 소포 수송 조절 단백질 ARF1, 또는 그 도미넌트 네거티브 변이체 ARF1 

(Q71L) (ARF1DN) 과 공발현시켰다. 또한, ARF1DN 의 공발현에 의해 골지체에 대한 단백질의 수송이 저해되 

는 리포터로 하여 액포형 GFP (vacuole-GFP) 와 각 ARF1 의 공발현을 실시하였다. 각 ARF1 의 발현 벡터의 

구축은 이하와 같이 실시하였다. 또한, 액포형 GFP 발현 벡터의 제작은 하기 문헌을 참조하여 실시할 수 있 

다. 

Di Sansebastiano et. al., Specific accumulation of GFP in a non-acidic vacuolar compartment via a C- 

terminal propeptide-mediated sorting pathway. Plant J. (1998) 15, 449-457 

소포 수송 조절 단백질로서 애기장대 ARF1 (GenBank Accession No. M95166) 및 그 도미넌트 네거티브 변이체 

ARF1 (Q71L) (Masaki Takeuchi et al., 2002 (하기 참조)) 의 발현 벡터를 구축하였다. 애기장대 유식물체 

로부터 조제한 cDNA 를 주형으로 하여, ARF1-F 프라이머 (배열 번호 59) 및 ARF1-R 프라이머 (배열 번호 60) 를 

사용하여 PCR 을 실시하였다. 얻어진 DNA 단편을 pBluescript (Stratagene) 의 EcoRV 갭에 서브 클로닝하 

였다. 또한, ARFQL-F 프라이머 (배열 번호 61) 및 ARFQL-R 프라이머 (배열 번호 62) 를 사용하여 PCR 을 

실시하고, 71 번째의 글루타민 잔기를 류신 잔기로 치환하였다. 얻어진 각 ARF1 단편을 일과성 발현용 벡터 

pBI221 에 서브 클로닝하였다. 

제작한 각각의 벡터를 상기와 동일한 방법으로 담배 배양 세포의 프로토플라스트에 도입하고, 각 단백질을 공발 

현시켜, 2×Stx2eB(PG12) 의 국재를 조사하였다. 


2×Stx2eB(PG12)-YFP 를 ARF1 과 공발현시킨 경우도, ARF1(Q71L) 과 공발현시킨 경우도, 2×Stx2eB(PG12)-YFP 

를 단독으로 발현시킨 경우와 마찬가지로 과립이 관찰되었다. 한편, ARF(Q711) 와의 공발현은 소포체로부터 

의 액포형 GFP 의 이출 (移出) 을 저해하였다. 이것으로부터, 과립의 형성은 소포체로부터 골지체에 대한 

소포 수송 과정에 의존하지 않는 것으로 추측되었다. 

담배 배양 세포를 사용한 형질 전환 실험 

(1) 형질 전환용 벡터의 구축 

상기와 동일하게 하여, 1×Stx2eB(PG12), 2×Stx2eB(PG12), 3×Stx2eB(PG12), 4×Stx2eB(PG12) 를 제작하였다. 

또한 PG12 대신에, RS (Arg Ser), PG7 (배열 번호 63) 또는 SG12 (배열 번호 64) 를 스페이서에 사용한 DNA 구 

축물, 2×Stx2eB(RS), 2×Stx2eB(PG7), 2×Stx2eB(SG12) 를 이하의 방법으로 제작하였다. 

상기 plasmid 8 의 Stx2eB 와 HA 태그 사이에 PG7 스페이서 (배열 번호 63) 를 삽입하였다. PG7-F 프라이 

머 (배열 번호 65) 와 PG7-R 프라이머 (배열 번호 66) 를 어닐링하고 T4 PNK 로 인산화하였다. 얻어진 인산 

화 DNA 단편을 plasmid 8 의 BglII 갭에 삽입하였다 (plasmid 10). 

또한, Stx2eB 와 HA 태그 사이에 SG12 스페이서 (배열 번호 64) 를 삽입하였다. SG12-F 프라이머 (배열 번 

호 67) 와 SG12-R 프라이머 (배열 번호 68) 를 어닐링하고 T4 PNK 로 인산화하였다. 얻어진 인산화 DNA 단 

편을 plasmid 8 의 BglII 갭에 삽입하였다 (plasmid 11). 


Plasmid 1 로부터 BamHI 및 BglII 를 사용하여 Stx2eB 단편을 잘라내고, 1×Stx2eB(PG12) 의 BamHI 갭에 삽입 

하였다 (2×Stx2eB(RS)). Plasmid 10 으로부터 BamHI 및 BglII 를 사용하여 Stx2eB-PG7 단편을 잘라내고, 

1×Stx2eB(PG12) 의 BamHI 갭에 삽입하였다 (2×Stx2eB(PG7)). Plasmid 11 로부터 BamHI 및 BglII 를 사용 

하여 Stx2eB-SG12 단편을 잘라내고, 1×Stx2eB(PG12) 의 BamHI 갭에 삽입하였다 (2×Stx2eB(SG12)). 

식물의 안정 형질 전환체를 사용하여 Stx2eB 의 생산을 실시하기 위해서, 상기 각 Stx2eB 의 DNA 구축물을 형질 

전환용 벡터에 서브 클로닝하였다 (벡터의 디자인은 도 1 을 참조). 1×Stx2eB(PG12), 2×Stx2eB(PG12), 3 

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×Stx2eB(PG12), 4×Stx2eB(PG12), 2×Stx2eB(RS), 2×Stx2eB(PG7) 및 2×Stx2eB(SG12) 를 XbaI 및 SacI 을 

사용하여 pBI121 (Clontech 사) 에 삽입하고, 콜리플라워 모자이크 바이러스 35S RNA 프로모터 (35S pro.) 와 

노팔린 합성 효소 유전자 전사 터미네이터 (NOS-T) 사이에 배치하였다. 

(2) 담배 배양 세포의 형질 전환 

제작한 형질 전환용 벡터를 일렉트로 포레이션법을 사용하여 아그로박테리움 (Agrobacterium tumefacience 

EHA105) 에 도입하였다. 카나마이신 100 ㎎/ℓ 를 함유하는 5 ㎖ 의 LB 배지에서 28 ℃, 이틀밤 배양한 아 

그로박테리움 배양액 100 ㎕ 와, 배양 4 일째의 담배 배양 세포 (Nicotiana tabacum, cv BY2) 의 현탁액 5 ∼ 

10 ㎖ 를 샬레에 넣어 혼합하고, 25 ℃ 에서 이틀밤, 어두운 곳하에서 정치시켜 공존 배양하였다. 아그로박 

테리움을 제거하기 위해서, 샬레 안의 배양액을 15 ㎖ 의 원심관으로 옮겨 원심 (1000 rpm, 5 분간, 4 ℃) 

하고, 상청을 제거하였다. 개변 LS 배지를 넣어 원심 분리 (1000 rpm, 5 분간, 4 ℃) 하고, 세포를 세정하 

였다. 이 세정 조작을 4 회 반복하여 아그로박테리움을 제거하였다. 남은 BY2 세포를 카나마이신 (100 ㎎ 

/ℓ) 이 들어간 개변 LS 한천 배지에 두고, 25 ℃ 에서 암흑하에 정치시켜 배양하였다. 약 2 - 3 주일 후에 

캘러스화한 세포를 새로운 플레이트에 이식하고, 증식하는 클론을 선택하였다. 

(3) 웨스턴 해석을 이용한 Stx2eB 단백질의 반정량 

평판 배지에서 배양한 담배 배양 세포를 원심 튜브에 회수하고, 세포의 중량 1 ㎎ 당 1 ㎕ 의 SDS-sample 

buffer 를 첨가하였다. 95 ℃ 에서 2 분간 열변성시켜 전기 영동용 시료로 하였다. 15 % 아크릴아미드 

겔을 사용하여 단백질을 분리 후, 일렉트로 트랜스퍼 장치를 사용하여 PVDF 멤브레인 (Hybond-P ; Amersham) 상 

에 단백질을 블롯하였다. 항 HA 항체 (No. 11 867 423 001, Roche) 를 사용하여 Stx2eB 단백질을 검출하였 

다. 농도가 이미 알려진 HA 태그 부착 Stx2eB 의 희석 계열을 제작하여 겔에 로드하고, 시그널 강도를 바탕 

으로 검량선을 작성하여, 각 샘플 중의 Stx2eB 단백질량을 산출하였다. 

이하에 결과를 나타낸다. 


결과를 도 8 및 9 에 나타낸다. 

1×Stx2eB(PG12) 를 발현시킨 경우에는, 약 10 kDa 및 약 17 kDa 의 위치에 시그널이 검출되었다. 각각 시 

그널 펩티드가 절단된 Stx2eB, 및 시그널 펩티드가 절단되어 있지 않은 Stx2eB 인 것으로 추정된다. 2× 

Stx2eB(PG12) 를 발현시킨 경우에는, 약 19 kDa 의 위치에, 1×Stx2eB(PG12) 를 발현시킨 경우와 동일한 정도 

의 시그널이 검출되었다. 3×Stx2eB(PG12) 를 발현시킨 경우에는, 약 26 kDa 의 위치에, 1×Stx2eB(PG12) 

를 발현시킨 경우보다 작은 시그널이 검출되었다. 모두 DNA 구축물의 디자인으로부터 추정한 분자량과 일치하였 

다. 또한, 4×Stx2eB(PG12) 를 발현시킨 경우에는, 특이적 시그널은 검출 한계 이하였다 (데이터 비게재). 

이것으로부터, 1×Stx2eB(PG12) 나 3×Stx2eB(PG12) 보다 2×Stx2eB(PG12) 쪽이 Stx2eB 가 고축적되는 것을 알 

수 있었다. 

(b) 스페이서의 영향 

결과를 도 10 및 도 11 에 나타낸다. 

Stx2eB 에 상당하는 시그널의 강도로부터, Stx2eB 의 축적 레벨은 스페이서로서 PG12 를 사용한 경우가 가장 많 

았다. 이어서 PG7 과 SG12 를 사용한 경우가 동일한 정도로 많았다. 또한, RS 를 사용한 경우가 가장 

적었다. 이러한 점에서, 2 개의 Stx2eB 간의 스페이서의 길이 및 아미노산 배열이 2×Stx2eB 단백질의 축적 

레벨에 영향을 주는 것을 알 수 있었다. 

(4) 리얼타임 PCR 에 의한 mRNA 의 정량 

단백질의 축적 레벨이 전사 레벨에 영향을 받는 것인지를 조사하였다. 


상기에서 얻어진 각 형질 전환 BY2 세포로부터, RNeasy Mini Kit (Qiagen) 를 사용하여 RNA 를 조제하였다. 

DNase 처리를 실시한 후, Transcriptor Reverse Transcriptase (Roche) 를 사용하여 역전사를 실시하였다. 

SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems) 를 사용하여 리얼타임 PCR 을 실시하였다. Stx2eB mRNA 의 

정량에는, 각 컨스트럭트 사이에서 공통의 배열인, NtADH 5'UTR 과 시그널 펩티드를 포함하는 영역을 증폭시키 

는 프라이머 세트 (배열 번호 69 및 배열 번호 70) 를 사용하였다. UBQ-F 프라이머 (배열 번호 71) 및 UBQ- 

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R 프라이머 (배열 번호 72) 를 사용하여 BY2 유비퀴틴 유전자의 발현량을 정량하고, stx2eB 유전자의 mRNA 레벨 

을 보정하였다. 또한 1×Stx2eB(PG12) mRNA 레벨은 정량치를 1/2 로 하여 산출하였다. 

결과를 도 12 에 나타낸다. 

mRNA 당의 Stx2e 단백질의 축적 레벨은 2×Stx2eB(PG12) 를 발현시킨 세포 쪽이 2×Stx2eB(RS) 또는 1× 

Stx2eB(PG12) 를 발현시킨 세포보다 큰 경향이 있었다. 이것으로부터, 스페이서의 상위는 전사 레벨에 영향 

을 주는 것이 아니라, 번역 레벨 혹은 번역 후의 단백질의 안정성에 영향을 준다는 것을 알 수 있었다. 또한, 2 

×Stx2eB 단백질이 과립상으로 국재되어 있었다는 결과를 아울러 고찰하면, 스페이서는 번역 후의 단백질의 안 

정성에 영향을 주고 있는 것으로 생각된다. 

일과성 발현 실험 

(1) Stx2eB 일과성 발현 벡터의 구축 

상기 (1) 의 방법으로 1×Stx2eB(PG12), 2×Stx2eB(PG12), 3×Stx2eB(PG12), 4×Stx2eB(PG12) 의 일과성 

발현 벡터를 구축하였다 (도 13-A). 이하, 이들 벡터를 각각 ER-1×Stx2eB(PG12), ER-2×Stx2eB(PG12), ER-3 

×Stx2eB(PG12), ER-4×Stx2eB(PG12) 라고 한다. 또한, 「ER」은 소포체형을 의미한다. 

또한, 이하의 방법으로 세포질형 (Cyt) DNA 구축물을 포함하는 일과성 발현 벡터 (도 13-B), 및 엽록체형 (Chl) 

DNA 구축물을 포함하는 발현 벡터 (도 13-C) 를 구축하였다. 또한, 이들 DNA 구축물은 소포체형 하이브리드 

단백질과 가능한 한 가까운 구조의 하이브리드 단백질을 발현시킬 목적으로, 소포체 잔류 시그널 펩티드를 코드 

하는 DNA 를 포함하도록 디자인되었다. 단, 당해 DNA 구축물은 분비 시그널 펩티드를 코드하는 DNA 를 포함 

하지 않기 때문에, 생산된 하이브리드 단백질에 있어서, 소포체 잔류 시그널 펩티드는 그 기능 (단백질의 소포 

체에 대한 잔류) 을 발휘하지 않는다. 

NtADH 5'UTR 단편을 ADH XbaI-F 프라이머 (배열 번호 34) 와 ADH BamHI-R 프라이머 (배열 번호 112) 를 사용한 

PCR 에 의해 증폭시키고, 얻어진 DNA 단편을 XbaI 과 BamHI 로 처리하였다. NtADH 5'-UTR 의 XbaI-BamHI 

단편을, ER-1×Stx2eB(PG12), ER-2×Stx2eB(PG12), ER-3×Stx2eB(PG12) 및 ER-4×Stx2eB(PG12) 의 각각의 

XbaI-BamHI 갭에 삽입하고, 세포질형 Stx2eB 벡터인 Cyt-1×Stx2eB(PG12), Cyt-2×Stx2eB(PG12), Cyt-3× 

Stx2eB(PG12) 및 Cyt-4×Stx2eB(PG12) 를 제작하였다. 

NtADH 5'-UTR 단편을 ADH XbaI-F 프라이머 (배열 번호 34) 및 ADH NsiI-R 프라이머 (배열 번호 35) 를 사용한 

PCR 에 의해 증폭시켰다. 양상추 Rbcs (루비스코 스몰 서브유닛) (GenBank ACCESSION D14001) 유래 엽록체 

이행 시그널 펩티드 (트랜지트 펩티드, T.P.) 를 코드하는 DNA 단편 (배열 번호 80) 을, 양상추잎 cDNA 를 주형 

으로 하여 TP NsiI-F 프라이머 (배열 번호 113) 및 TP BamHI-R 프라이머 (배열 번호 114) 를 사용하여 PCR 에 

의해 증폭시켰다. 얻어진 NtADH 5'-UTR 및 분비 시그널 펩티드의 각 DNA 단편을 NsiI (TOYOBO 사 제조) 로 

처리하고, Ligation High (TOYOBO 사) 를 사용하여 라이게이션한 후, 말단을 평활화하고 pBluescript II SK 

(Stratagene 사 제조) 의 EcoRV 갭에 클로닝하였다 (plasmid 12). Plasmid 12 를 NsiI 로 처리하고, T4 

DNA polymerase (TOYOBO 사 제조) 로 말단을 평활화한 후 셀프 라이게이션하고, NtADH 의 개시 코돈과 Rbcs 의 

개시 코돈이 일치하도록 융합하였다 (plasmid 13). Plasmid 13 으로부터 XbaI 과 BamHI 을 사용하여 NtADH 

5'-UTR-T.P. 융합 단편을 잘라내고, ER-1×Stx2eB(PG12), ER-2×Stx2eB(PG12), ER-3×Stx2eB(PG12) 및 ER-4× 

Stx2eB(PG12) 의 각각의 XbaI-BamHI 갭에 삽입하고, 엽록체형 Stx2eB 벡터인 Chl-1×Stx2eB(PG12), Chl-2× 

Stx2eB(PG12), Chl-3×Stx2eB(PG12) 및 Chl-4×Stx2eB(PG12) 를 제작하였다. 

(2) CTB 일과성 발현 벡터의 제작 

상기 (2) 의 방법으로 1×CTB(PG12), 2×CTB(PG12) 의 일과성 발현 벡터를 구축하였다 (도 14-A). 이 

하, 이들 벡터를 각각 ER-1×CTB(PG12), ER-2×CTB(PG12) 라고 한다. 

또한, 이하의 방법으로 세포질형 (Cyt) DNA 구축물을 포함하는 일과성 발현 벡터 (도 14-B), 및 엽록체형 (Chl) 

DNA 구축물을 포함하는 발현 벡터 (도 14-C) 를 구축하였다. 

ER-1×CTB(PG12) 로부터 BamHI 및 BglII 를 사용하여 CTB-PG12 단편을 잘라내고, 상기 (1) 에서 제작한 

Cyt-1×Stx2eB(PG12) 의 BamHI-BglII 갭 및 Chl-1×Stx2eB(PG12) 의 BamHI-BglII 갭에 삽입하여 세포질형 및 

엽록체형 1×CTB(PG12) 를 제작하였다 (Cyt-1×CTB(PG12), Chl-1×CTB(PG12)). 


계속해서, ER-2×CTB(PG12) 로부터 BamHI 및 BglII 를 사용하여 2×(CTB-PG12) 단편을 잘라내고, Cyt-1× 

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Stx2eB(PG12) 의 BamHI-BglII 갭 및 Chl-1×Stx2eB(PG12) 의 BamHI-BglII 갭에 삽입하여 세포질형 및 엽록체형 

2×CTB(PG12) 를 제작하였다 (Cyt-2×CTB(PG12), Chl-2×CTB(PG12)). 

(3) 일과성 발현 실험 및 웨스턴 해석 

상기 (3) 과 동일하게 하여 양상추의 프로토플라스트를 사용하여 일과성 발현 실험을 실시하였다. 계속 

해서, (4) 와 동일하게 하여 Stx2eB, CTB 를 검출하였다. 



ER-1×Stx2eB(PG12) 를 발현시킨 경우에는, 약 10 kDa 의 위치에 시그널이 검출되었다. ER-2× 

Stx2eB(PG12) 를 발현시킨 경우에는, 약 19 kDa 의 위치에, ER-1×Stx2eB(PG12) 를 발현시킨 경우보다 큰 시그 

널이 검출되었다. ER-3×Stx2eB(PG12) 를 발현시킨 경우에는, 약 27 kDa 의 위치에, ER-1×Stx2eB(PG12) 

를 발현시킨 경우보다 큰 시그널이 검출되었다. 이들은 모두 DNA 구축물의 디자인으로부터 추정한 분자량과 

일치하였다. 또한, ER-4×Stx2eB(PG12) 를 발현시킨 경우에는, 특이적 시그널은 검출 한계 이하였다. 

Cyt-1×Stx2eB(PG12) 를 발현시킨 경우에는, 특이적 시그널은 검출 한계 이하였다. Cyt-2×Stx2eB(PG12) 

를 발현시킨 경우에는, 약 20 kDa 의 위치에 시그널이 검출되었다. Cyt-3×Stx2eB(PG12) 를 발현시킨 경우 

에는, 약 30 kDa 의 위치에 시그널이 검출되었다. 이들은 모두 DNA 구축물의 디자인으로부터 추정한 분자량 

과 일치하였다. 또한, Cyt-4×Stx2eB(PG12) 를 발현시킨 경우에는, 특이적 시그널은 검출 한계 이하였다. 

Chl-1×Stx2eB(PG12) 를 발현시킨 경우에는, 약 14 kDa 의 위치에 약간 시그널이 검출되었다. Chl-2× 

Stx2eB(PG12) 를 발현시킨 경우에는, 약 22 kDa 의 위치에, ER-3×Stx2eB(PG12) 를 발현시킨 경우와 동일한 정 

도의 시그널이 검출되었다. Chl-3×Stx2eB(PG12) 를 발현시킨 경우에는, 약 30 kDa 의 위치에, Chl-2× 

Stx2eB(PG12) 를 발현시킨 경우와 동일한 정도의 시그널이 검출되었다. 이들은 모두 DNA 구축물의 디자인으 

로부터 추정한 분자량과 일치하였다. 또한, Chl-4×Stx2eB(PG12) 를 발현시킨 경우에는, 약 34 kDa 의 위치 

에 약간 시그널이 검출되었다. 

상기 각 DNA 구축물은 HA 태그를 1 분자씩 함유하기 때문에 (도 13 참조), 2 개의 Stx2eB 를 코드하는 DNA 를 

발현시킨 경우, 3 개의 Stx2eB 를 코드하는 DNA 를 발현시킨 경우에는, 1 개의 Stx2eB 를 코드하는 DNA 를 발현 

시킨 경우의 각각 약 2 배, 약 3 배의 Stx2eB 단백질에 상당하는 단백질을 축적하고 있는 것으로 생각된다. 

따라서, 소포체형 (ER), 세포질형 (Cyt), 엽록체형 (Chl) 의 어느 DNA 구축물을 발현시킨 경우에 있어서도, 1 

개의 Stx2eB 단백질을 발현시킨 경우보다, 2 개 또는 3 개의 Stx2eB 를 스페이서를 통해 탠덤으로 연결한 단백 

질을 발현시킨 경우가, Stx2eB 를 효율적으로 축적시킬 수 있음을 알 수 있었다. 

(b) CTB 의 연결수의 영향 


ER-1×CTB(PG12) 를 발현시킨 경우에는, 약 17 kDa 의 위치에 시그널이 검출되었다. ER-2×CTB(PG12) 를 

발현시킨 경우에는, 약 28 kDa 및 30 kDa 의 위치에, ER-1×Stx2eB(PG12) 를 발현시킨 경우보다 큰 시그널이 검 

출되었다. 이들은 모두 DNA 구축물의 디자인으로부터 추정한 분자량과 일치하였다. 

Cyt-1×CTB(PG12) 를 발현시킨 경우에는, 약 14 kDa 의 위치에 약간 시그널이 검출되었다. Cyt-2× 

CTB(PG12) 를 발현시킨 경우에는, 약 26 kDa 의 위치에, ER-2×CTB(PG12) 를 발현시킨 경우와 동일한 정도의 시 

그널이 검출되었다. 이들은 모두 DNA 구축물의 디자인으로부터 추정한 분자량과 일치하였다. 

Chl-1×CTB(PG12) 를 발현시킨 경우에는, 약 14 kDa 의 위치에 시그널이 검출되었다. Chl-2×CTB(PG12) 를 

발현시킨 경우에는, 약 26 kDa 의 위치에, ER-2×CTB(PG12) 를 발현시킨 경우와 동일한 정도의 시그널이 검출되 

었다. 이들은 모두 DNA 구축물의 디자인으로부터 추정한 분자량과 일치하였다. 

이상으로부터, 소포체형 (ER), 세포질형 (Cyt), 엽록체형 (Chl) 의 어느 DNA 구축물을 발현시킨 경우에 있어서 

도, 1 개의 CTB 단백질을 발현시킨 경우보다, 2 개의 CTB 를 스페이서를 통해 탠덤으로 연결한 단백질을 발현시 

킨 경우가 CTB 를 효율적으로 축적시킬 수 있음을 알 수 있었다. 


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[0252] 

[0253] 

[0254] 

[0255] 

[0256] 

[0257] 

[0258] 

[0259] 

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[0261] 


상기에서 제작한 ER-2×Stx2eB(PG12), Cyt-1×Stx2eB(PG12), Cyt-2×Stx2eB(PG12), Cyt-3×Stx2eB(PG12) 를 사 

용하여 형질 전환 실험을 실시하였다. 

형질 전환용 벡터의 제작은 상기 (1) 의 방법과 동일하게 실시하였다. 

(2) 담배 배양 세포의 형질 전환 및 웨스턴 해석 

형질 전환 실험 및 웨스턴 해석은 상기 (2), (3) 의 방법과 동일하게 실시하였다. 


ER-2×Stx2eB(PG12) 를 발현시킨 경우에는, 약 19 kDa, 21 kDa 및 23 kDa 의 위치에 시그널이 검출되었다. 

Cyt-1×Stx2eB(PG12) 를 발현시킨 경우에는, 특이적 시그널은 검출 한계 이하였다. Cyt-2×Stx2eB(PG12) 

를 발현시킨 경우에는, 약 19 kDa 의 위치에 시그널이 검출되었다. Cyt-3×Stx2eB(PG12) 를 발현시킨 경우 

에는, 약 27 kDa 의 위치에, Cyt-2×Stx2eB(PG12) 를 발현시킨 경우보다 큰 시그널이 검출되었다. 

이상으로부터, 담배 배양 세포의 형질 전환체에 있어서도, 1 개의 Stx2eB 단백질을 발현시킨 경우보다, 2 개 또 

는 3 개의 Stx2eB 를 스페이서를 통해 탠덤으로 연결한 단백질을 발현시킨 경우가, Stx2eB 를 효율적으로 축적 

시킬 수 있음을 알 수 있었다. 또한, 담배 배양 세포의 형질 전환체에 있어서, 세포질형 DNA 구축물을 발현 

시킨 경우에는, 특히 3 개의 Stx2eB 를 스페이서를 통해 탠덤으로 연결한 단백질을 발현시킨 경우에, Stx2eB 를 

효율적으로 축적시킬 수 있음을 알 수 있었다. 

또한, 담배 배양 세포의 형질 전환체에 있어서는, 세포질형 DNA 구축물을 발현시킨 경우보다, 소포체형 DNA 구 

축물을 발현시킨 경우가, Stx2eB 를 효율적으로 축적시킬 수 있음을 알 수 있었다. 

담배 식물체를 사용한 형질 전환 실험 


상기에서 제작한 ER-2×Stx2eB(PG12), Chl-1×Stx2eB(PG12), Chl-2×Stx2eB(PG12), Chl-3×Stx2eB(PG12) 를 사 

용하여 형질 전환 실험을 실시하였다. 

형질 전환용 벡터의 제작은 상기 (1) 의 방법과 동일하게 실시하였다. 

(2) 담배 식물체의 형질 전환 

상기에서 제작한 벡터를 사용하여, 이하의 방법에 의해 담배 식물체의 형질 전환을 실시하였다. 

담배 식물체 (Nicotiana tabacum L. cv. Petit habana SR1) 의 종자를 살균하고, MS 배지에 파종하였다. 

무균 담배의 잎부를, 줄기를 포함하지 않도록 1×1 ㎝ 정도의 크기로 잘라내고, 멸균수가 들어간 샬레에 잎의 

이면이 위가 되도록 두고, 상기 (2) 에서 얻어진 100 ㎎/ℓ 의 카나마이신을 함유하는 LB 배지에서 이틀밤 

배양한 아그로박테리움 현탁액을 샬레에 부어 3 ∼ 5 분간 담그었다. 잎조각을 꺼내, 여분의 균액을 멸균 김 

타올로 닦아내고, 캘러스 형성 배지에 치상 (置床) 하고 25 ℃ 에서 배양하였다. 2 ∼ 3 일 후, 아그로박테 

리움을 배지 상에서 볼 수 있게 되면, 잎조각을 50 ㎖ 튜브로 옮겨, 멸균수로 5 회 세정한 후, 캘러스 형성 배 

지 (카나마이신 100 ㎎/ℓ, 카르베니실린 250 ㎎/ℓ 를 함유한다) 에 치상하고, 1 ∼ 2 주일 25 ℃ 에서 배양하 

였다. 잎조각이 맨 처음에 비교하여 둥글게 되고, 표면에 요철이 생기면, 슛 형성 배지 (카나마이신 100 ㎎ 

/ℓ, 카르베니실린 250 ㎎/ℓ 를 함유한다) 로 옮겼다. 또한 4 ∼ 6 주일 후, 경엽부가 발달한 슛을 잘라내 

루트 형성 배지 (카나마이신 100 ㎎/ℓ, 카르베니실린 250 ㎎/ℓ 를 함유한다) 로 옮겨, 발근이 보이지 않을 때 

까지 25 ℃ 에서 배양하였다. 식물체가 어느 정도의 크기로 성장한 것을 화분에 심었다. 

(3) 웨스턴 해석 

상기에서 제작한 유전자 재조합 담배 식물체의 잎을 샘플링하고, 질량 1 ㎎ 당 1 ㎕ 의 SDS-sample buffer 를 

첨가하였다. 95 ℃ 에서 2 분간 열변성시켜 전기 영동용 시료로 하였다. 15 % 아크릴아미드 겔을 사용 

하여 단백질을 분리 후, 일렉트로 트랜스퍼 장치를 사용하여 PVDF 멤브레인 (Hybond-P ; Amersham) 상에 단백질 

을 블롯하였다. 항 HA 항체 (No. 11 867 423 001, Roche) 를 사용하여 Stx2eB 단백질을 검출하였다. 

결과를 도 18 및 19 에 나타낸다. 


ER-2×Stx2eB(PG12), Chl-1×Stx2eB(PG12), Chl-2×Stx2eB(PG12), Chl-3×Stx2eB(PG12) 로 형질 전환한 식물체 

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[0263] 

[0264] 

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[0266] 

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[0268] 

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[0273] 

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[0275] 

[0276] 

[0277] 

[0278] 

[0279] 

에 있어서, Stx2eB 를 고효율로 축적하는 클론이 얻어졌다. 또한, 엽록체형 DNA 구축물에 대해서도, 1 개의 

Stx2eB 단백질을 발현시킨 경우보다, 2 개 또는 3 개의 Stx2eB 를 스페이서를 통해 탠덤으로 연결한 단백질을 

발현시킨 경우가 Stx2eB 를 효율적으로 축적하는 클론이 높은 확률로 얻어지는 것을 알 수 있었다. 

또한, ER-2×Stx2eB(PG12) 를 발현시킨 경우의 시그널은, 약 15 kDa, 약 19 kDa 및 약 22 kDa 의 위치에서 검 

출되었다. Chl-1×Stx2eB(PG12) 를 발현시킨 경우의 시그널은 약 12 kDa 의 위치에서 검출되었다. 

Chl-2×Stx2eB(PG12) 를 발현시킨 경우의 시그널은 약 19 kDa 의 위치에서 검출되었다. Chl-3× 

Stx2eB(PG12) 를 발현시킨 경우의 시그널은 약 27 kDa 의 위치에서 검출되었다. 이들은 모두 DNA 구축물의 디 

자인으로부터 추정한 분자량과 일치하였다. 


(1) Stx2eB 형질 전환용 벡터의 구축 

상기 (1) 의 방법으로 ER-2×Stx2eB(PG12) 를 제작하였다. ER-2×Stx2eB(PG17), ER-2×Stx2eB(PG22) 

는 이하의 방법에 의해 제작하였다. DNA 구축물의 디자인을 도 20 에 나타낸다. 

PG7-F 프라이머 (배열 번호 65) 와 PG7-R 프라이머 (배열 번호 66) 를 어닐링하고 T4 PNK 로 인산화하였다. 

얻어진 인산화 DNA 단편을 (1) 에서 얻은 ER-1×Stx2eB(PG12) 의 BglII 갭에 삽입하였다 (plasmid 14). 

또한, PG12-F 프라이머 (배열 번호 43) 와 PG12-R 프라이머 (배열 번호 44) 를 어닐링하고 T4 PNK 로 인산화하 

였다. 얻어진 인산화 DNA 단편을 ER-1×Stx2eB(PG12) 의 BglII 갭에 삽입하였다 (plasmid 15). 

Plasmid 14 로부터 BamHI 및 BglII 를 사용하여 Stx2eB-PG17 단편을 잘라내고, ER-1×Stx2eB(PG12) 의 BamHI 

갭에 삽입하였다 (2×Stx2eB(PG17)). Plasmid 15 로부터 BamHI 및 BglII 를 사용하여 Stx2eB-PG22 단편을 

잘라내고, ER-1×Stx2eB(PG12) 의 BamHI 갭에 삽입하였다 (ER-2×Stx2eB(PG22)). 

식물의 안정 형질 전환체를 사용하여 Stx2eB 의 생산을 실시하기 위해서, 상기 각 Stx2eB 의 DNA 구축물을 형질 

전환용 벡터에 서브 클로닝하였다. 즉, ER-2×Stx2eB(PG12), ER-2×Stx2eB(PG17), ER-2×Stx2eB(PG22) 를 

XbaI 및 SacI 을 사용하여 pBI121 (Clontech 사) 에 삽입하고, 콜리플라워 모자이크 바이러스 35S RNA 프로모 

터 (35S pro.) 와 노팔린 합성 효소 유전자 전사 터미네이터 (NOS-T) 사이에 배치하였다. 

(2) CTB 형질 전환용 벡터의 구축 

상기 (2) 의 방법으로 ER-2×CTB(PG12) 를 제작하였다. ER-2×CTB(PG17), ER-2×CTB(PG22) 는 이하의 

방법에 의해 제작하였다. 각 DNA 구축물의 디자인을 도 21 에 나타낸다. 

PG7-F 프라이머 (배열 번호 65) 와 PG7-R 프라이머 (배열 번호 66) 를 어닐링하고 T4 PNK 로 인산화하였다. 

얻어진 인산화 DNA 단편을 (2) 에서 얻은 ER-1×CTB(PG12) 의 BglII 갭에 삽입하였다 (plasmid 16). 

PG12-F 프라이머 (배열 번호 43) 와 PG12-R 프라이머 (배열 번호 44) 를 어닐링하고 T4 PNK 로 인산화하였다. 

얻어진 인산화 DNA 단편을 ER-1×CTB(PG12) 의 BglII 갭에 삽입하였다 (plasmid 17). 

Plasmid 16 으로부터 BamHI 및 BglII 를 사용하여 CTB-PG17 단편을 잘라내고, ER-1×CTB(PG12) 의 BamHI 갭에 

삽입하였다 (ER-2×CTB(PG17)). Plasmid 17 로부터 BamHI 및 BglII 를 사용하여 CTB-PG22 단편을 

잘라내고, ER-1×CTB(PG12) 의 BamHI 갭에 삽입하였다 (ER-2×CTB(PG22)). 

식물의 안정 형질 전환체를 사용하여 CTB 의 생산을 실시하기 위해서, 상기 각 CTB 의 DNA 구축물을 형질 전환 

용 벡터에 서브 클로닝하였다. 즉, ER-2×CTB(PG12), ER-2×CTB(PG17), ER-2×CTB(PG22) 를 XbaI 및 SacI 

을 사용하여 pBI121 (Clontech 사) 에 삽입하고, 콜리플라워 모자이크 바이러스 35S RNA 프로모터 (35S pro.) 

와 노팔린 합성 효소 유전자 전사 터미네이터 (NOS-T) 사이에 배치하였다. 

(3) 형질 전환 실험 및 웨스턴 해석 

형질 전환 실험 및 웨스턴 해석은 상기 (2), (3) 의 방법으로 실시하였다. 

(a) Stx2eB 탠덤 연결에 있어서의 스페이서의 길이의 영향 



ER-2×Stx2eB(PG17), ER-2×Stx2eB(PG22) 를 발현시킨 경우에는, ER-2×Stx2eB(PG12) 를 발현시킨 경우와 동일 

한 정도의 시그널이 검출되었다. 이것으로부터, PG17, PG22 모두 PG12 와 동일한 효과를 나타낸다는 것을 

- 23 -

[0280] 

[0281] 

[0282] 

[0283] 

[0284] 

[0285] 

[0286] 

[0287] 

[0288] 

[0289] 

알 수 있었다. 

또한, ER-2×Stx2eB(PG12) 를 발현시킨 경우에는, 약 19 kDa 및 약 22 kDa 의 위치에 시그널이 검출되고, ER-2 

×Stx2eB(PG17) 을 발현시킨 경우에는, 약 19 kDa 및 약 22 kDa 의 위치에 시그널이 검출되며, ER-2× 

Stx2eB(PG22) 를 발현시킨 경우에는, 약 20 kDa 및 약 23 kDa 의 위치에 시그널이 검출되었다. 이들은 모두 

DNA 구축물의 디자인으로부터 추정한 분자량과 일치하였다. 

(b) CTB 탠덤 연결에 있어서의 스페이서의 길이의 영향 


ER-2×CTB(PG17), ER-2×CTB(PG22) 를 발현시킨 경우에는, ER-2×CTB(PG12) 를 발현시킨 경우와 동일한 정도의 

시그널이 검출되었다. 이것으로부터, PG17, PG22 모두 PG12 와 동일한 효과를 나타낸다는 것을 알 수 있었 

다. 

또한, ER-2×CTB(PG12) 를 발현시킨 경우에는, 약 32 kDa, 34 kDa 및 36 kDa 의 위치에 시그널이 검출되고, 

ER-2×CTB(PG17) 을 발현시킨 경우에는, 약 32 kDa, 34 kDa 및 36 kDa 의 위치에 시그널이 검출되며, ER-2× 

CTB(PG22) 를 발현시킨 경우에는, 약 32 kDa, 34 kDa 및 36 kDa 의 위치에 시그널이 검출되었다. 이들은 

모두 DNA 구축물의 디자인으로부터 추정한 분자량과 일치하였다. 

산업상 이용가능성 

본 발명의 하이브리드 단백질은 안정성이 높고, 고레벨로 식물 세포 내에 축적된다. 또한, 본 발명의 DNA 

구축물을 사용하여 식물에 본 발명의 하이브리드 단백질을 생산시킴으로써, 효율적인 시가 독소, 콜레라 독소, 

대장균 이열성 독소의 경구 백신의 생산이 가능해진다. 

본 발명은 면역성을 유도하기에 충분한 레벨의 세균 항원을 식물에 발현시킬 수 있게 한다. 본 발명은 동물 

에게 트랜스제닉 식물을 식이함으로써, 동물에게 세균 항원에 대한 면역을 저비용으로 부여할 수 있게 한다. 

예를 들어 돼지 부종병 백신, 콜레라 백신의 개발에 유용하다. 

배열표 

PCT 세균 독소 백신 20090427 173339 0.txt 

- 24 - 


도면 

도면1 

도면2 

- 25 - 


도면3 

도면4 

- 26 - 


도면5 

- 27 - 


도면6 

- 28 - 


도면7 

도면8 

- 29 - 


도면9 

- 30 - 


도면10 

- 31 - 


도면11 

- 32 - 


도면12 

- 33 - 


도면13 

- 34 - 


도면14 

도면15 

- 35 - 


도면16 

도면17 

- 36 - 


도면18 

- 37 - 


도면19 

- 38 - 


도면20 

도면21 

- 39 - 


도면22 

도면23 

서 열 목 록 

IDEMITSU KOSAN Co., Ltd. 

BACTERIAL TOXIN VACCINE 

- 40 - 


0800224-8334 

JP 2008-120573 

2008-05-02 

114 

PatentIn version 3.5 

1 

36 

DNA 

Artificial Sequence 

an Artificial Sequencely synthesized DNA 

1 

agatcccctg gttctggtcc tggttctcct agatcc 36 

2 

12 

PRT 


an Artificial Sequencely synthesized peptide 

2 

Arg Ser Pro Gly Ser Gly Pro Gly Ser Pro Arg Ser 

1 5 10 

3 

959 

DNA 

Escherichia coli 

3 

atgaagtgta tattgttaaa gtggatactg tgtctgttac tgggtttttc ttcggtatcc 60 

tattcccagg agtttacgat agacttttcg actcaacaaa gttatgtatc ttcgttaaat 120 

agtatacgga cagcgatatc gacccctctt gaacatatat ctcagggagc tacatcggta 180 

tccgttatta atcatacacc accaggaagt tatatttccg taggtatacg agggcttgat 240 

gtttatcagg agcgttttga ccatcttcgt ctgattattg aacgaaataa tttatatgtg 300 

gctggatttg ttaatacgac aacaaatact ttctacagat tttcagattt gcacatatat 360 

cattgcccgg tgtgacaact atttccatga caacggacag cagttatacc actctgcaac 420 

gtgtcgcagc gctggaacgt tccggaatgc aaatcagtcg tcactcactg gtttcatcat 480 

- 41 - 


atctggcgtt aatggagttc agtggtaata caatgaccag agatgcatca agagcagttc 540 

tgcgttttgt cactgtcaca gcagaagcct tacggttcag gcaaatacag agagaatttc 600 

gtctggcact gtctgaaact gctcctgttt atacgatgac gccggaagac gtggacctca 660 

ctctgaactg ggggagaatc agcaatgtgc ttccggagta tcggggagag gctggtgtca 720 

gagtggggag aatatccttt aataatatat cagcgatact tggtactgtg gccgttatac 780 

tgaattgcca tcatcagggc gcacgttctg ttcgcgccgt gaatgaagag agtcaaccag 840 

aatgtcagat aactggcgac aggcccgtta taaaaataaa caatacatta tgggaaagta 900 

atacagcagc agcgtttctg aacagaaagt cacagccttt atatacaact ggtgaatga 959 

4 

304 

PRT 


4 

Met Lys Cys Ile Leu Leu Lys Trp Ile Leu Cys Leu Leu Leu Gly Phe 

1 5 10 15 

Ser Ser Val Ser Tyr Ser Gln Glu Phe Thr Ile Asp Phe Ser Thr Gln 

20 25 30 

Gln Ser Tyr Val Ser Ser Leu Asn Ser Ala Ile Ser Thr Pro Leu Glu 

35 40 45 

His Ile Ser Gln Gly Ala Thr Ser Val Ser Val Ile Asn His Thr Pro 

50 55 60 

Pro Gly Ser Tyr Ile Ser Val Gly Ile Arg Gly Leu Asp Val Tyr Gln 

65 70 75 80 

Glu Arg Phe Asp His Leu Arg Leu Ile Ile Glu Arg Asn Asn Leu Tyr 

85 90 95 

Phe Val Asn Thr Thr Thr Asn Thr Phe Tyr Arg Phe Ser Asp Phe Ala 

100 105 110 

His Ile Ser Leu Pro Gly Val Thr Thr Ile Ser Met Thr Thr Asp Ser 

115 120 125 

Ser Tyr Thr Thr Leu Gln Arg Val Ala Ala Leu Glu Arg Ser Gly Met 

130 135 140 

- 42 - 


Gln Ile Ser Arg His Ser Leu Tyr Leu Ala Leu Met Glu Phe Ser Gly 

145 150 155 160 

Asn Thr Met Thr Arg Asp Ala Ser Arg Ala Val Leu Arg Phe Val Thr 

165 170 175 

Val Thr Ala Glu Ala Leu Arg Phe Arg Gln Ile Gln Arg Glu Phe Arg 

180 185 190 

Leu Ala Leu Ser Glu Thr Ala Pro Val Tyr Thr Met Thr Pro Asp Leu 

195 200 205 

Thr Leu Asn Trp Gly Arg Ile Ser Asn Val Leu Pro Glu Tyr Arg Gly 

210 215 220 

Glu Ala Gly Val Arg Val Gly Arg Ile Ser Phe Asn Asn Ile Ser Ala 

225 230 235 240 

Ile Leu Gly Thr Val Ala Val Ile Leu Asn Cys His His Gln Gly Ala 

245 250 255 

Arg Ser Val Arg Ala Glu Ser Gln Pro Glu Cys Gln Ile Thr Gly Asp 

260 265 270 

Arg Pro Val Ile Lys Ile Asn Asn Thr Leu Trp Glu Ser Asn Thr Ala 

275 280 285 

Ala Ala Phe Leu Asn Arg Lys Ser Gln Pro Leu Tyr Thr Thr Gly Glu 

290 295 300 

5 

210 

DNA 


5 

gcggcggatt gtgctaaagg taaaattgag ttttccaagt ataatgagga taataccttt 60 

actgtgaagg tgtcaggaag agaatactgg acgaacagat ggaatttgca gccattgtta 120 

caaagtgctc agctgacagg gatgactgta acaatcatat ctaatacctg cagttcaggc 180 

tcaggctttg cccaggtgaa gtttaactga 210 

6 

69 

PRT 

- 43 - 



6 

Ala Ala Asp Cys Ala Lys Gly Lys Ile Glu Phe Ser Lys Tyr Asn Glu 

1 5 10 15 

Asp Asn Thr Phe Thr Val Lys Val Ser Gly Arg Glu Tyr Trp Thr Asn 

20 25 30 

Arg Trp Asn Leu Gln Pro Leu Leu Gln Ser Ala Gln Leu Thr Gly Met 

35 40 45 

Thr Val Thr Ile Ile Ser Asn Thr Cys Ser Ser Gly Ser Gly Phe Ala 

50 55 60 

Gln Val Lys Phe Asn 

65 

7 

312 

DNA 

Vibrio cholerae 

7 

accccccaga acatcaccga cctctgcgcc gagagccaca acacccaaat ctacaccctc 60 

aacgacaaga ttttcagcta caccgagagc ctcgccggca agagggagat ggccatcatc 120 

accttcaaga acggcgccat cttccaggtc gaggtccccg gcagccagca catcgacagc 180 

cagaagaagg ccatcgagag gatgaaggac accctcagga tcgcctacct caccgaggcc 240 

aaggtcgaga agctctgcgt ctggaacaac aagacccccc acgccatcgc cgccatcagc 300 

atggccaact ga 312 

8 

103 

PRT 

Vibrio cholerae 

8 

Thr Pro Gln Asn Ile Thr Asp Leu Cys Ala Glu Ser His Asn Thr Gln 

1 5 10 15 

Ile Tyr Thr Leu Asn Asp Lys Ile Phe Ser Tyr Thr Glu Ser Leu Ala 

20 25 30 

- 44 - 


Gly Lys Arg Glu Met Ala Ile Ile Thr Phe Lys Asn Gly Ala Ile Phe 

35 40 45 

Gln Val Glu Val Pro Gly Ser Gln His Ile Asp Ser Gln Lys Lys Ala 

50 55 60 

Ile Glu Arg Met Lys Asp Thr Leu Arg Ile Ala Tyr Leu Thr Glu Ala 

65 70 75 80 

Lys Val Glu Lys Leu Cys Val Trp Asn Asn Lys Thr Pro His Ala Ile 

Ala Ala Ile Ser Met Ala Asn 

9 

453 

DNA 

100 


85 90 95 

an Artificial Sequencely synthesized DNA construct 

9 




tcaggctttg cccaggtgaa gtttaacaga tcccctggtt ctggtcctgg ttctcctaga 240 

tccgcggcgg attgtgctaa aggtaaaatt gagttttcca agtataatga ggataatacc 300 

tttactgtga aggtgtcagg aagagaatac tggacgaaca gatggaattt gcagccattg 360 

ttacaaagtg ctcagctgac agggatgact gtaacaatca tatctaatac ctgcagttca 420 

ggctcaggct ttgcccaggt gaagtttaac tga 453 

10 

150 

PRT 


an Artificial Sequencely sinthesized protein 

10 


1 5 10 15 

- 45 - 



20 25 30 


35 40 45 


50 55 60 

Gln Val Lys Phe Asn Arg Ser Pro Gly Ser Gly Pro Gly Ser Pro Arg 

65 70 75 80 

Ser Ala Ala Asp Cys Ala Lys Gly Lys Ile Glu Phe Ser Lys Tyr Asn 

85 90 95 

Glu Asp Asn Thr Phe Thr Val Lys Val Ser Gly Arg Glu Tyr Trp Thr 

100 105 110 

Asn Arg Trp Asn Leu Gln Pro Leu Leu Gln Ser Ala Gln Leu Thr Gly 


Met Thr Val Thr Ile Ile Ser Asn Thr Cys Ser Ser Gly Ser Gly Phe 

130 135 140 

Ala Gln Val Lys Phe Asn 

145 150 

11 

657 

DNA 


an Artificial Sequencely sinthesized DNA construct 

11 






atggccaaca gatcccctgg ttctggtcct ggttctccta gatccacccc ccagaacatc 360 

accgacctct gcgccgagag ccacaacacc caaatctaca ccctcaacga caagattttc 420 

- 46 - 


agctacaccg agagcctcgc cggcaagagg gagatggcca tcatcacctt caagaacggc 480 

gccatcttcc aggtcgaggt ccccggcagc cagcacatcg acagccagaa gaaggccatc 540 

gagaggatga aggacaccct caggatcgcc tacctcaccg aggccaaggt cgagaagctc 600 

tgcgtctgga acaacaagac cccccacgcc atcgccgcca tcagcatggc caactga 657 


218 

PRT 





1 5 10 15 


20 25 30 


35 40 45 


50 55 60 


65 70 75 80 


85 90 95 

Ala Ala Ile Ser Met Ala Asn Arg Ser Pro Gly Ser Gly Pro Gly Ser 

100 105 110 

Pro Arg Ser Thr Pro Gln Asn Ile Thr Asp Leu Cys Ala Glu Ser His 


Asn Thr Gln Ile Tyr Thr Leu Asn Asp Lys Ile Phe Ser Tyr Thr Glu 

130 135 140 

Ser Leu Ala Gly Lys Arg Glu Met Ala Ile Ile Thr Phe Lys Asn Gly 

145 150 155 160 

Ala Ile Phe Gln Val Glu Val Pro Gly Ser Gln His Ile Asp Ser Gln 

- 47 - 


165 170 175 

Lys Lys Ala Ile Glu Arg Met Lys Asp Thr Leu Arg Ile Ala Tyr Leu 


Thr Glu Ala Lys Val Glu Lys Leu Cys Val Trp Asn Asn Lys Thr Pro 


His Ala Ile Ala Ala Ile Ser Met Ala Asn 

210 215 

13 

489 

DNA 



13 








ggctcaggct ttgcccaggt gaagtttaac agatcccctg gttctggtcc tggttctcct 480 

agatcttga 489 

14 

162 

PRT 



14 


1 5 10 15 


20 25 30 

- 48 - 



35 40 45 


50 55 60 


65 70 75 80 


85 90 95 


100 105 110 




130 135 140 

Ala Gln Val Lys Phe Asn Arg Ser Pro Gly Ser Gly Pro Gly Ser Pro 

145 150 155 160 

Arg Ser 

15 

693 

DNA 



15 









- 49 - 




tgcgtctgga acaacaagac cccccacgcc atcgccgcca tcagcatggc caacagatcc 660 

cctggttctg gtcctggttc tcctagatct tga 693 

16 

230 

PRT 



16 


1 5 10 15 


20 25 30 


35 40 45 


50 55 60 


65 70 75 80 


85 90 95 


100 105 110 




130 135 140 


145 150 155 160 


165 170 175 

- 50 - 






His Ala Ile Ala Ala Ile Ser Met Ala Asn Arg Ser Pro Gly Ser Gly 

210 215 220 

Pro Gly Ser Pro Arg Ser 

225 230 

17 

72 

DNA 

Nicotiana tabacum 

17 

atggggagaa tgtcaatacc catgatgggt tttgtggtgt tatgtctatg ggcagtggta 60 

gcagaaggat cc 72 

18 

24 

PRT 


18 

Met Gly Arg Met Ser Ile Pro Met Met Gly Phe Val Val Leu Cys Leu 

1 5 10 15 

Trp Ala Val Val Ala Glu Gly Ser 


4 

PRT 

20 


an Artificial Sequencely sinthesized peptide 


Lys Asp Glu Leu 

1 

20 

- 51 - 


4 

PRT 

 



20 

His Asp Glu Leu 

1 

21 

4 

PRT 



21 

Lys Asp Glu Phe 

1 

22 

4 

PRT 



22 

His Asp Glu Phe 

1 

23 

91 

DNA 


23 

tatttaactc agtattcaga aacaacaaaa gttcttctct acataaaatt ttcctatttt 60 

agtgatcagt gaaggaaatc aagaaaaata a 91 

24 

547 

DNA 

- 52 - 




24 


agtgatcagt gaaggaaatc aagaaaaata aatggcggcg gattgtgcta aaggtaaaat 120 

tgagttttcc aagtataatg aggataatac ctttactgtg aaggtgtcag gaagagaata 180 

ctggacgaac agatggaatt tgcagccatt gttacaaagt gctcagctga cagggatgac 240 

tgtaacaatc atatctaata cctgcagttc aggctcaggc tttgcccagg tgaagtttaa 300 

cagatcccct ggttctggtc ctggttctcc tagatccgcg gcggattgtg ctaaaggtaa 360 

aattgagttt tccaagtata atgaggataa tacctttact gtgaaggtgt caggaagaga 420 

atactggacg aacagatgga atttgcagcc attgttacaa agtgctcagc tgacagggat 480 

gactgtaaca atcatatcta atacctgcag ttcaggctca ggctttgccc aggtgaagtt 540 

taactga 547 

25 

751 

DNA 



25 


agtgatcagt gaaggaaatc aagaaaaata aatgaccccc cagaacatca ccgacctctg 120 

cgccgagagc cacaacaccc aaatctacac cctcaacgac aagattttca gctacaccga 180 

gagcctcgcc ggcaagaggg agatggccat catcaccttc aagaacggcg ccatcttcca 240 

ggtcgaggtc cccggcagcc agcacatcga cagccagaag aaggccatcg agaggatgaa 300 

ggacaccctc aggatcgcct acctcaccga ggccaaggtc gagaagctct gcgtctggaa 360 

caacaagacc ccccacgcca tcgccgccat cagcatggcc aacagatccc ctggttctgg 420 

tcctggttct cctagatcca ccccccagaa catcaccgac ctctgcgccg agagccacaa 480 

cacccaaatc tacaccctca acgacaagat tttcagctac accgagagcc tcgccggcaa 540 

gagggagatg gccatcatca ccttcaagaa cggcgccatc ttccaggtcg aggtccccgg 600 

cagccagcac atcgacagcc agaagaaggc catcgagagg atgaaggaca ccctcaggat 660 

cgcctacctc accgaggcca aggtcgagaa gctctgcgtc tggaacaaca agacccccca 720 

- 53 - 


cgccatcgcc gccatcagca tggccaactg a 751 

26 

637 

DNA 


an Artificial Sequencely sintesized DNA construct 

26 


agtgatcagt gaaggaaatc aagaaaaata aatggggaga atgtcaatac ccatgatggg 120 

ttttgtggtg ttatgtctat gggcagtggt agcagaagga tccgcggcgg attgtgctaa 180 

aggtaaaatt gagttttcca agtataatga ggataatacc tttactgtga aggtgtcagg 240 

aagagaatac tggacgaaca gatggaattt gcagccattg ttacaaagtg ctcagctgac 300 

agggatgact gtaacaatca tatctaatac ctgcagttca ggctcaggct ttgcccaggt 360 

gaagtttaac agatcccctg gttctggtcc tggttctcct agatccgcgg cggattgtgc 420 

taaaggtaaa attgagtttt ccaagtataa tgaggataat acctttactg tgaaggtgtc 480 

aggaagagaa tactggacga acagatggaa tttgcagcca ttgttacaaa gtgctcagct 540 

gacagggatg actgtaacaa tcatatctaa tacctgcagt tcaggctcag gctttgccca 600 

ggtgaagttt aacagatctg aacatgatga attgtga 637 

27 

841 

DNA 



27 



ttttgtggtg ttatgtctat gggcagtggt agcagaagga tccacccccc agaacatcac 180 

cgacctctgc gccgagagcc acaacaccca aatctacacc ctcaacgaca agattttcag 240 

ctacaccgag agcctcgccg gcaagaggga gatggccatc atcaccttca agaacggcgc 300 

catcttccag gtcgaggtcc ccggcagcca gcacatcgac agccagaaga aggccatcga 360 

gaggatgaag gacaccctca ggatcgccta cctcaccgag gccaaggtcg agaagctctg 420 

cgtctggaac aacaagaccc cccacgccat cgccgccatc agcatggcca acagatcccc 480 

- 54 - 


tggttctggt cctggttctc ctagatccac cccccagaac atcaccgacc tctgcgccga 540 

gagccacaac acccaaatct acaccctcaa cgacaagatt ttcagctaca ccgagagcct 600 

cgccggcaag agggagatgg ccatcatcac cttcaagaac ggcgccatct tccaggtcga 660 

ggtccccggc agccagcaca tcgacagcca gaagaaggcc atcgagagga tgaaggacac 720 

cctcaggatc gcctacctca ccgaggccaa ggtcgagaag ctctgcgtct ggaacaacaa 780 

gaccccccac gccatcgccg ccatcagcat ggccaacaga tctgaacatg atgaattgtg 840 

a 841 

28 

667 

DNA 



28 











ggtgaagttt aacagatccc ctggttctgg tcctggttct cctagatctg aacatgatga 660 

attgtga 667 

29 

871 

DNA 



29 

- 55 - 















gaccccccac gccatcgccg ccatcagcat ggccaacaga tcccctggtt ctggtcctgg 840 

ttctcctaga tctgaacatg atgaattgtg a 871 

30 

38 

DNA 


an Artificial Sequencely sinthesized primer 

30 

tatctagagc caccatggga tccgcggcgg attgtgct 38 

31 

30 

DNA 



31 

ttcaagatct gttaaacttc acctgggcaa 30 

32 

23 

DNA 

- 56 - 




32 

gtcgacggta cccccgggga gct 23 

33 

23 

DNA 



33 

ccccgggggt accgtcgaca gct 23 

34 

41 

DNA 



34 

aatctagagt ctatttaact cagtattcag aaacaacaaa a 41 

35 

30 

DNA 



35 

aaatgcatta tttttcttga tttccttcac 30 

36 

30 

DNA 



36 

aaatgcatgg ggagaatgtc aatacccatg 30 

- 57 - 


37 

30 

DNA 



37 

tataggatcc cattattttt cttgatttcc 30 

38 

7 

PRT 



38 

Gly Ser Glu His Asp Glu Leu 

1 5 

39 

21 

DNA 



39 

gatctgaaca tgatgaattg t 21 

40 

21 

DNA 



40 

gatcacaatt catcatgttc a 21 

41 

33 

DNA 



- 58 - 


41 

gatcttatcc ttatgattat cctgattatg ctg 33 

42 

33 

DNA 



42 

gatccagcat aatcaggata atcataagga taa 33 

43 

30 

DNA 



43 

gatcccctgg ttctggtcct ggttctccta 30 

44 

30 

DNA 



44 

gatctaggag aaccaggacc agaaccaggg 30 

45 

40 

DNA 



45 

ttggatccac cccccagaac atcaccgacc tctgcgccga 40 

46 

39 

DNA 

- 59 - 




46 

cgttgagggt gtagatttgg gtgttgtggc tctcggcgc 39 

47 

40 

DNA 



47 

ccctcaacga caagattttc agctacaccg agagcctcgc 40 

48 

40 

DNA 



48 

cttgaaggtg atgatggcca tctccctctt gccggcgagg 40 

49 

32 

DNA 



49 

caccttcaag aacggcgcca tcttccaggt cg 32 

50 

45 

DNA 



50 

cttctggctg tcgatgtgct ggctgccggg gacctcgacc tggaa 45 

- 60 - 


51 

45 

DNA 



51 

agccagaaga aggccatcga gaggatgaag gacaccctca ggatc 45 

52 

43 

DNA 



52 

gcagagcttc tcgaccttgg cctcggtgag gtaggcgatc ctg 43 

53 

30 

DNA 



53 

aagctctgcg tctggaacaa caagaccccc 30 

54 

45 

DNA 



54 

aaagatctgt tggccatgct gatggcggcg atggcgtggg gggtc 45 

55 

31 

DNA 



- 61 - 


55 

tttggatcca gcaagggcga ggagctgttc a 31 

56 

33 

DNA 



56 

tttagatctc ttgtacagct cgtccatgcc gag 33 

57 

30 

DNA 



57 

aaaggatccg cctcctccga ggacgtcatc 30 

58 

30 

DNA 



58 

aaaagatctg gcgccggtgg agtggcggcc 30 

59 

30 

DNA 



59 

gatcaaaatg gggttgtcat tcggaaagtt 30 

60 

30 

DNA 

- 62 - 




60 

attccatcta tgccttgctt gcgatgttgt 30 

61 

24 

DNA 



61 

ctagacaaga tccgtccatt gtgg 24 

62 

24 

DNA 



62 

acccccaaca tcccacacgg tgaa 24 

63 

7 

PRT 



63 

Arg Ser Pro Gly Ser Arg Ser 

1 5 

64 


PRT 



64 

Arg Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Arg Ser 

- 63 - 


1 5 10 

65 

15 

DNA 



65 

gatcccctgg ttcca 15 

66 

15 

DNA 



66 

gatctggaac caggg 15 

67 

30 

DNA 



67 

gatccggttc tggttctggt tctggttcca 30 

68 

30 

DNA 



68 

gatctggaac cagaaccaga accagaaccg 30 

69 

25 

DNA 


- 64 - 



69 

gtgatcagtg aaggaaatca agaaa 25 

70 

23 

DNA 



70 

cataacacca caaaacccat cat 23 

71 

22 

DNA 



71 

ccaagccaaa gaagatcaag ca 22 

72 

24 

DNA 



72 

ccctgaatca tcgaccttgt agaa 24 

73 

700 

DNA 



73 



- 65 - 










ggtgaagttt aacagatccc ctggttctgg tcctggttct cctagatctt atccttatga 660 

ttatcctgat tatgctggat ctgaacatga tgaattgtga 700 

74 

904 

DNA 



74 














gaccccccac gccatcgccg ccatcagcat ggccaacaga tcccctggtt ctggtcctgg 840 

ttctcctaga tcttatcctt atgattatcc tgattatgct ggatctgaac atgatgaatt 900 

- 66 - 


gtga 904 

75 

21 

DNA 


75 

gatttgttgg ttgatactat g 21 

76 

7 

PRT 


76 

Asp Leu Leu Val Asp Thr Met 

1 5 

77 

45 

DNA 

Armoracia rusticana 

77 

ctactccatg atatggtgga ggtcgttgac tttgttagct ctatg 45 

78 

15 

PRT 

Armoracia rusticana 

78 

Leu Leu His Asp Met Val Glu Val Val Asp Phe Val Ser Ser Met 

1 5 10 15 

79 

75 

PRT 

Lactuca sativa 

79 

Met Ala Ser Ile Ser Ser Ser Ala Ile Ala Thr Val Asn Arg Thr Thr 

- 67 - 


1 5 10 15 

Ser Thr Gln Ala Ser Leu Ala Ala Pro Phe Thr Gly Leu Lys Ser Asn 

20 25 30 

Val Ala Phe Pro Val Thr Lys Lys Ala Asn Asn Asp Phe Ser Ser Leu 

35 40 45 

Pro Ser Asn Gly Gly Arg Val Gln Cys Met Lys Val Trp Pro Pro Ile 

50 55 60 

Gly Leu Lys Lys Tyr Glu Thr Leu Ser Tyr Leu 

65 70 75 

80 

225 

DNA 

Lactuca sativa 

80 

atggcctcca tctcctcctc agccatcgcc accgtcaacc ggaccacctc cacccaagct 60 

agcttggcag ctccattcac cggcctcaag tctaacgtag ctttcccagt taccaagaag 120 

gctaacaatg acttttcatc cctacccagc aacggtggaa gagtacaatg catgaaggtg 180 

tggccaccaa ttgggttgaa gaagtacgag actctttcat accta 225 

81 

51 

DNA 



81 

agatcccctg gttctggtcc tggttctcct agatcccctg gttccagatc t 51 

82 

17 

PRT 



82 

Arg Ser Pro Gly Ser Gly Pro Gly Ser Pro Arg Ser Pro Gly Ser Arg 

- 68 - 


Ser 

1 5 10 15 

83 

66 

DNA 



83 

agatcccctg gttctggtcc tggttctcct agatcccctg gttctggtcc tggttctcct 60 

agatct 66 

84 

22 

PRT 



< 

400> 84 

Arg Ser Pro Gly Ser Gly Pro Gly Ser Pro Arg Ser Pro Gly Ser Gly 

1 5 10 15 

Pro Gly Ser Pro Arg Ser 

85 

696 

DNA 

20 



85 







- 69 - 




agatccgcgg cggattgtgc taaaggtaaa attgagtttt ccaagtataa tgaggataat 540 

acctttactg tgaaggtgtc aggaagagaa tactggacga acagatggaa tttgcagcca 600 

ttgttacaaa gtgctcagct gacagggatg actgtaacaa tcatatctaa tacctgcagt 660 

tcaggctcag gctttgccca ggtgaagttt aactga 696 

86 

231 

PRT 



86 


1 5 10 15 


20 25 30 


35 40 45 


50 55 60 


65 70 75 80 


85 90 95 


100 105 110 




130 135 140 


145 150 155 160 

- 70 - 


Arg Ser Ala Ala Asp Cys Ala Lys Gly Lys Ile Glu Phe Ser Lys Tyr 

165 170 175 

Asn Glu Asp Asn Thr Phe Thr Val Lys Val Ser Gly Arg Glu Tyr Trp 


Thr Asn Arg Trp Asn Leu Gln Pro Leu Leu Gln Ser Ala Gln Leu Thr 


Gly Met Thr Val Thr Ile Ile Ser Asn Thr Cys Ser Ser Gly Ser Gly 

210 215 220 

Phe Ala Gln Val Lys Phe Asn 

225 230 

87 

732 

DNA 



87 









agatccgcgg cggattgtgc taaaggtaaa attgagtttt ccaagtataa tgaggataat 540 

acctttactg tgaaggtgtc aggaagagaa tactggacga acagatggaa tttgcagcca 600 

ttgttacaaa gtgctcagct gacagggatg actgtaacaa tcatatctaa tacctgcagt 660 

tcaggctcag gctttgccca ggtgaagttt aacagatccc ctggttctgg tcctggttct 720 

cctagatcct ga 732 

88 

243 

- 71 - 


PRT 



88 


1 5 10 15 


20 25 30 


35 40 45 


50 55 60 


65 70 75 80 


85 90 95 


100 105 110 




130 135 140 


145 150 155 160 

Arg Ser Ala Ala Asp Cys Ala Lys Gly Lys Ile Glu Phe Ser Lys Tyr 

165 170 175 

Asn Glu Asp Asn Thr Phe Thr Val Lys Val Ser Gly Arg Glu Tyr Trp 


Thr Asn Arg Trp Asn Leu Gln Pro Leu Leu Gln Ser Ala Gln Leu Thr 


Gly Met Thr Val Thr Ile Ile Ser Asn Thr Cys Ser Ser Gly Ser Gly 

- 72 - 


210 215 220 

Phe Ala Gln Val Lys Phe Asn Arg Ser Pro Gly Ser Gly Pro Gly Ser 

225 230 235 240 

Pro Arg Ser 

89 

504 

DNA 



89 





tcccctggtt ccagatctgc ggcggattgt gctaaaggta aaattgagtt ttccaagtat 300 

aatgaggata atacctttac tgtgaaggtg tcaggaagag aatactggac gaacagatgg 360 

aatttgcagc cattgttaca aagtgctcag ctgacaggga tgactgtaac aatcatatct 420 

aatacctgca gttcaggctc aggctttgcc caggtgaagt ttaacagatc ccctggttct 480 

ggtcctggtt ctcctagatc ttga 504 

90 

167 

PRT 



90 


1 5 10 15 


20 25 30 


35 40 45 

- 73 - 



50 55 60 


65 70 75 80 

Ser Pro Gly Ser Arg Ser Ala Ala Asp Cys Ala Lys Gly Lys Ile Glu 

85 90 95 

Phe Ser Lys Tyr Asn Glu Asp Asn Thr Phe Thr Val Lys Val Ser Gly 

100 105 110 

Arg Glu Tyr Trp Thr Asn Arg Trp Asn Leu Gln Pro Leu Leu Gln Ser 


Ala Gln Leu Thr Gly Met Thr Val Thr Ile Ile Ser Asn Thr Cys Ser 

130 135 140 

Ser Gly Ser Gly Phe Ala Gln Val Lys Phe Asn Arg Ser Pro Gly Ser 

145 150 155 160 

Gly Pro Gly Ser Pro Arg Ser 

91 


DNA 

165 


 


91 





tcccctggtt ctggtcctgg ttctcctaga tctgcggcgg attgtgctaa aggtaaaatt 300 

gagttttcca agtataatga ggataatacc tttactgtga aggtgtcagg aagagaatac 360 

tggacgaaca gatggaattt gcagccattg ttacaaagtg ctcagctgac agggatgact 420 

gtaacaatca tatctaatac ctgcagttca ggctcaggct ttgcccaggt gaagtttaac 480 

agatcccctg gttctggtcc tggttctcct agatcttga 519 

92 

- 74 - 


172 

PRT 



92 


1 5 10 15 


20 25 30 


35 40 45 


50 55 60 


65 70 75 80 

Ser Pro Gly Ser Gly Pro Gly Ser Pro Arg Ser Ala Ala Asp Cys Ala 

85 90 95 

Lys Gly Lys Ile Glu Phe Ser Lys Tyr Asn Glu Asp Asn Thr Phe Thr 

100 105 110 

Val Lys Val Ser Gly Arg Glu Tyr Trp Thr Asn Arg Trp Asn Leu Gln 


Pro Leu Leu Gln Ser Ala Gln Leu Thr Gly Met Thr Val Thr Ile Ile 

130 135 140 

Ser Asn Thr Cys Ser Ser Gly Ser Gly Phe Ala Gln Val Lys Phe Asn 

145 150 155 160 

Arg Ser Pro Gly Ser Gly Pro Gly Ser Pro Arg Ser 

93 

1002 

DNA 

165 170 



- 75 - 


93 












cctggttctg gtcctggttc tcctagatcc accccccaga acatcaccga cctctgcgcc 720 

gagagccaca acacccaaat ctacaccctc aacgacaaga ttttcagcta caccgagagc 780 

ctcgccggca agagggagat ggccatcatc accttcaaga acggcgccat cttccaggtc 840 

gaggtccccg gcagccagca catcgacagc cagaagaagg ccatcgagag gatgaaggac 900 

accctcagga tcgcctacct caccgaggcc aaggtcgaga agctctgcgt ctggaacaac 960 

aagacccccc acgccatcgc cgccatcagc atggccaact ga 1002 

94 

333 

PRT 



94 


1 5 10 15 


20 25 30 


35 40 45 


- 76 - 


50 55 60 


65 70 75 80 


85 90 95 


100 105 110 




130 135 140 


145 150 155 160 


165 170 175 






210 215 220 

Pro Gly Ser Pro Arg Ser Thr Pro Gln Asn Ile Thr Asp Leu Cys Ala 

225 230 235 240 

Glu Ser His Asn Thr Gln Ile Tyr Thr Leu Asn Asp Lys Ile Phe Ser 

245 250 255 

Tyr Thr Glu Ser Leu Ala Gly Lys Arg Glu Met Ala Ile Ile Thr Phe 

260 265 270 

Lys Asn Gly Ala Ile Phe Gln Val Glu Val Pro Gly Ser Gln His Ile 

275 280 285 

Asp Ser Gln Lys Lys Ala Ile Glu Arg Met Lys Asp Thr Leu Arg Ile 

290 295 300 

Ala Tyr Leu Thr Glu Ala Lys Val Glu Lys Leu Cys Val Trp Asn Asn 

- 77 - 


305 310 315 320 

Lys Thr Pro His Ala Ile Ala Ala Ile Ser Met Ala Asn 

95 

1038 

DNA 

325 330 



95 












cctggttctg gtcctggttc tcctagatct accccccaga acatcaccga cctctgcgcc 720 

gagagccaca acacccaaat ctacaccctc aacgacaaga ttttcagcta caccgagagc 780 

ctcgccggca agagggagat ggccatcatc accttcaaga acggcgccat cttccaggtc 840 

gaggtccccg gcagccagca catcgacagc cagaagaagg ccatcgagag gatgaaggac 900 

accctcagga tcgcctacct caccgaggcc aaggtcgaga agctctgcgt ctggaacaac 960 

aagacccccc acgccatcgc cgccatcagc atggccaaca gatcccctgg ttctggtcct 1020 

ggttctccta gatcttga 1038 

96 

345 

PRT 


- 78 - 



96 


1 5 10 15 


20 25 30 


35 40 45 


50 55 60 


65 70 75 80 


85 90 95 


100 105 110 




130 135 140 


145 150 155 160 


165 170 175 






210 215 220 

Pro Gly Ser Pro Arg Ser Thr Pro Gln Asn Ile Thr Asp Leu Cys Ala 

- 79 - 


225 230 235 240 

Glu Ser His Asn Thr Gln Ile Tyr Thr Leu Asn Asp Lys Ile Phe Ser 

245 250 255 

Tyr Thr Glu Ser Leu Ala Gly Lys Arg Glu Met Ala Ile Ile Thr Phe 

260 265 270 

Lys Asn Gly Ala Ile Phe Gln Val Glu Val Pro Gly Ser Gln His Ile 

275 280 285 

Asp Ser Gln Lys Lys Ala Ile Glu Arg Met Lys Asp Thr Leu Arg Ile 

290 295 300 

Ala Tyr Leu Thr Glu Ala Lys Val Glu Lys Leu Cys Val Trp Asn Asn 

305 310 315 320 

Lys Thr Pro His Ala Ile Ala Ala Ile Ser Met Ala Asn Arg Ser Pro 

325 330 335 

Gly Ser Gly Pro Gly Ser Pro Arg Ser 

97 

708 

DNA 

340 345 



97 






atggccaaca gatcccctgg ttctggtcct ggttctccta gatcccctgg ttccagatct 360 


aacgacaaga ttttcagcta caccgagagc ctcgccggca agagggagat ggccatcatc 480 




- 80 - 


atggccaaca gatcccctgg ttctggtcct ggttctccta gatcttga 708 

98 

235 

PRT 



98 


1 5 10 15 


20 25 30 


35 40 45 


50 55 60 


65 70 75 80 


85 90 95 


100 105 110 

Pro Arg Ser Pro Gly Ser Arg Ser Thr Pro Gln Asn Ile Thr Asp Leu 


Cys Ala Glu Ser His Asn Thr Gln Ile Tyr Thr Leu Asn Asp Lys Ile 

130 135 140 

Phe Ser Tyr Thr Glu Ser Leu Ala Gly Lys Arg Glu Met Ala Ile Ile 

145 150 155 160 

Thr Phe Lys Asn Gly Ala Ile Phe Gln Val Glu Val Pro Gly Ser Gln 

165 170 175 

His Ile Asp Ser Gln Lys Lys Ala Ile Glu Arg Met Lys Asp Thr Leu 


- 81 - 


Arg Ile Ala Tyr Leu Thr Glu Ala Lys Val Glu Lys Leu Cys Val Trp 


Asn Asn Lys Thr Pro His Ala Ile Ala Ala Ile Ser Met Ala Asn Arg 

210 215 220 

Ser Pro Gly Ser Gly Pro Gly Ser Pro Arg Ser 

225 230 235 

99 

723 

DNA 



99 






atggccaaca gatcccctgg ttctggtcct ggttctccta gatcccctgg ttctggtcct 360 

ggttctccta gatctacccc ccagaacatc accgacctct gcgccgagag ccacaacacc 420 

caaatctaca ccctcaacga caagattttc agctacaccg agagcctcgc cggcaagagg 480 

gagatggcca tcatcacctt caagaacggc gccatcttcc aggtcgaggt ccccggcagc 540 

cagcacatcg acagccagaa gaaggccatc gagaggatga aggacaccct caggatcgcc 600 

tacctcaccg aggccaaggt cgagaagctc tgcgtctgga acaacaagac cccccacgcc 660 

atcgccgcca tcagcatggc caacagatcc cctggttctg gtcctggttc tcctagatct 720 

tga 723 

100 

240 

PRT 



100 

- 82 - 



1 5 10 15 


20 25 30 


35 40 45 


50 55 60 


65 70 75 80 


85 90 95 


100 105 110 

Pro Arg Ser Pro Gly Ser Gly Pro Gly Ser Pro Arg Ser Thr Pro Gln 


Asn Ile Thr Asp Leu Cys Ala Glu Ser His Asn Thr Gln Ile Tyr Thr 

130 135 140 

Leu Asn Asp Lys Ile Phe Ser Tyr Thr Glu Ser Leu Ala Gly Lys Arg 

145 150 155 160 

Glu Met Ala Ile Ile Thr Phe Lys Asn Gly Ala Ile Phe Gln Val Glu 

165 170 175 

Val Pro Gly Ser Gln His Ile Asp Ser Gln Lys Lys Ala Ile Glu Arg 


Met Lys Asp Thr Leu Arg Ile Ala Tyr Leu Thr Glu Ala Lys Val Glu 


Lys Leu Cys Val Trp Asn Asn Lys Thr Pro His Ala Ile Ala Ala Ile 

210 215 220 

Ser Met Ala Asn Arg Ser Pro Gly Ser Gly Pro Gly Ser Pro Arg Ser 

225 230 235 240 

101 

- 83 - 


583 

DNA 



101 










taacagatcc cctggttctg gtcctggttc tcctagatcc tga 583 

102 

682 

DNA 



102 







gaagtttaac agatcccctg gttctggtcc tggttctcct agatcccctg gttccagatc 420 

tgcggcggat tgtgctaaag gtaaaattga gttttccaag tataatgagg ataatacctt 480 

tactgtgaag gtgtcaggaa gagaatactg gacgaacaga tggaatttgc agccattgtt 540 

acaaagtgct cagctgacag ggatgactgt aacaatcata tctaatacct gcagttcagg 600 

ctcaggcttt gcccaggtga agtttaacag atcccctggt tctggtcctg gttctcctag 660 

- 84 - 


atctgaacat gatgaattgt ga 682 

103 

697 

DNA 



103 







gaagtttaac agatcccctg gttctggtcc tggttctcct agatcccctg gttctggtcc 420 

tggttctcct agatctgcgg cggattgtgc taaaggtaaa attgagtttt ccaagtataa 480 

tgaggataat acctttactg tgaaggtgtc aggaagagaa tactggacga acagatggaa 540 

tttgcagcca ttgttacaaa gtgctcagct gacagggatg actgtaacaa tcatatctaa 600 

tacctgcagt tcaggctcag gctttgccca ggtgaagttt aacagatccc ctggttctgg 660 

tcctggttct cctagatctg aacatgatga attgtga 697 

104 

805 

DNA 



104 


agtgatcagt gaaggaaatc aagaaaaata aatggcctcc atctcctcct cagccatcgc 120 

caccgtcaac cggaccacct ccacccaagc tagcttggca gctccattca ccggcctcaa 180 

gtctaacgta gctttcccag ttaccaagaa ggctaacaat gacttttcat ccctacccag 240 

caacggtgga agagtacaat gcatgaaggt gtggccacca attgggttga agaagtacga 300 

gactctttca tacctagcgg cggattgtgc taaaggtaaa attgagtttt ccaagtataa 360 

- 85 - 





tcctggttct cctagatccg cggcggattg tgctaaaggt aaaattgagt tttccaagta 600 

taatgaggat aataccttta ctgtgaaggt gtcaggaaga gaatactgga cgaacagatg 660 

gaatttgcag ccattgttac aaagtgctca gctgacaggg atgactgtaa caatcatatc 720 

taatacctgc agttcaggct caggctttgc ccaggtgaag tttaacagat cccctggttc 780 

tggtcctggt tctcctagat cctga 805 

105 

826 

DNA 



105 










taacagatcc cctggttctg gtcctggttc tcctagatcc gcggcggatt gtgctaaagg 600 

taaaattgag ttttccaagt ataatgagga taataccttt actgtgaagg tgtcaggaag 660 

agaatactgg acgaacagat ggaatttgca gccattgtta caaagtgctc agctgacagg 720 

gatgactgta acaatcatat ctaatacctg cagttcaggc tcaggctttg cccaggtgaa 780 

gtttaacaga tcccctggtt ctggtcctgg ttctcctaga tcctga 826 

106 

910 

DNA 


- 86 - 



106 











ggtgaagttt aacagatccc ctggttctgg tcctggttct cctagatccg cggcggattg 660 

tgctaaaggt aaaattgagt tttccaagta taatgaggat aataccttta ctgtgaaggt 720 

gtcaggaaga gaatactgga cgaacagatg gaatttgcag ccattgttac aaagtgctca 780 

gctgacaggg atgactgtaa caatcatatc taatacctgc agttcaggct caggctttgc 840 

ccaggtgaag tttaacagat cccctggttc tggtcctggt tctcctagat ccgaacatga 900 

tgaattgtga 910 

107 

1048 

DNA 



107 






gactctttca tacctagcgg cggattgtgc taaaggtaaa attgagtttt ccaagtataa 360 


- 87 - 




tcctggttct cctagatccg cggcggattg tgctaaaggt aaaattgagt tttccaagta 600 

taatgaggat aataccttta ctgtgaaggt gtcaggaaga gaatactgga cgaacagatg 660 

gaatttgcag ccattgttac aaagtgctca gctgacaggg atgactgtaa caatcatatc 720 

taatacctgc agttcaggct caggctttgc ccaggtgaag tttaacagat cccctggttc 780 

tggtcctggt tctcctagat ccgcggcgga ttgtgctaaa ggtaaaattg agttttccaa 840 

gtataatgag gataatacct ttactgtgaa ggtgtcagga agagaatact ggacgaacag 900 

atggaatttg cagccattgt tacaaagtgc tcagctgaca gggatgactg taacaatcat 960 

atctaatacc tgcagttcag gctcaggctt tgcccaggtg aagtttaaca gatcccctgg 1020 

ttctggtcct ggttctccta gatcctga 1048 

108 

787 

DNA 



108 


agtgatcagt gaaggaaatc aagaaaaata aatgaccccc cagaacatca ccgacctctg 120 

cgccgagagc cacaacaccc aaatctacac cctcaacgac aagattttca gctacaccga 180 

gagcctcgcc ggcaagaggg agatggccat catcaccttc aagaacggcg ccatcttcca 240 

ggtcgaggtc cccggcagcc agcacatcga cagccagaag aaggccatcg agaggatgaa 300 

ggacaccctc aggatcgcct acctcaccga ggccaaggtc gagaagctct gcgtctggaa 360 

caacaagacc ccccacgcca tcgccgccat cagcatggcc aacagatccc ctggttctgg 420 

tcctggttct cctagatcca ccccccagaa catcaccgac ctctgcgccg agagccacaa 480 

cacccaaatc tacaccctca acgacaagat tttcagctac accgagagcc tcgccggcaa 540 

gagggagatg gccatcatca ccttcaagaa cggcgccatc ttccaggtcg aggtccccgg 600 

cagccagcac atcgacagcc agaagaaggc catcgagagg atgaaggaca ccctcaggat 660 

cgcctacctc accgaggcca aggtcgagaa gctctgcgtc tggaacaaca agacccccca 720 

cgccatcgcc gccatcagca tggccaacag atcccctggt tctggtcctg gttctcctag 780 

atcctga 787 

- 88 - 


109 

886 

DNA 



109 









tggttctggt cctggttctc ctagatcccc tggttccaga tctacccccc agaacatcac 540 






tggttctggt cctggttctc ctagatctga acatgatgaa ttgtga 886 

110 

901 

DNA 



110 






- 89 - 





tggttctggt cctggttctc ctagatcccc tggttctggt cctggttctc ctagatctac 540 

cccccagaac atcaccgacc tctgcgccga gagccacaac acccaaatct acaccctcaa 600 

cgacaagatt ttcagctaca ccgagagcct cgccggcaag agggagatgg ccatcatcac 660 

cttcaagaac ggcgccatct tccaggtcga ggtccccggc agccagcaca tcgacagcca 720 

gaagaaggcc atcgagagga tgaaggacac cctcaggatc gcctacctca ccgaggccaa 780 

ggtcgagaag ctctgcgtct ggaacaacaa gaccccccac gccatcgccg ccatcagcat 840 

ggccaacaga tcccctggtt ctggtcctgg ttctcctaga tctgaacatg atgaattgtg 900 

a 901 

111 

1009 

DNA 



111 






gactctttca tacctaaccc cccagaacat caccgacctc tgcgccgaga gccacaacac 360 

ccaaatctac accctcaacg acaagatttt cagctacacc gagagcctcg ccggcaagag 420 

ggagatggcc atcatcacct tcaagaacgg cgccatcttc caggtcgagg tccccggcag 480 

ccagcacatc gacagccaga agaaggccat cgagaggatg aaggacaccc tcaggatcgc 540 

ctacctcacc gaggccaagg tcgagaagct ctgcgtctgg aacaacaaga ccccccacgc 600 

catcgccgcc atcagcatgg ccaacagatc ccctggttct ggtcctggtt ctcctagatc 660 

caccccccag aacatcaccg acctctgcgc cgagagccac aacacccaaa tctacaccct 720 

caacgacaag attttcagct acaccgagag cctcgccggc aagagggaga tggccatcat 780 

caccttcaag aacggcgcca tcttccaggt cgaggtcccc ggcagccagc acatcgacag 840 

- 90 - 


ccagaagaag gccatcgaga ggatgaagga caccctcagg atcgcctacc tcaccgaggc 900 

caaggtcgag aagctctgcg tctggaacaa caagaccccc cacgccatcg ccgccatcag 960 

catggccaac agatcccctg gttctggtcc tggttctcct agatcctga 1009 


30 

DNA 




tataggatcc cattattttt cttgatttcc 30 

113 

30 

DNA 



113 

aaatgcatgg cctccatctc ctcctcagcc 30 

114 

30 

DNA 



114 

tttggatcct aggtatgaaa gagtctcgta 30 

- 91 -

(19) 대한민국특허청(KR) (12) 공개특허공보(A) - Questel

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