(19) 대한민국특허청(KR) (12) 공개특허공보(A) - Questel

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방법을 들 수 있고, 담배이면 Nagata 와 Takebe (Planta 99 : 12 (1971)) 의 방법을 들 수 있다.
양상추의 경우에는 0.1 ㎎/ℓ 의 NAA (나프탈렌아세트산), 0.05 ㎎/ℓ 의 BA (벤질아데닌) 및 0.5 g/ℓ 의
polyvinylpyrrolidone 을 함유하는 MS 배지에서 슛의 재생이 가능하고, 재생한 슛을 0.5 g/ℓ 의
polyvinylpyrrolidone 을 함유하는 1/2 MS 배지에서 배양함으로써 발근이 가능하다.
또한, 본 발명의 종자는 상기와 같이 하여 재생한 식물체로부터 종자를 채취함으로써 얻을 수 있다. 본 발
명의 종자는 적당한 방법으로 파종하여 재배함으로써, 상기 세균 독소 단백질을 생산하는 식물체로 할 수 있고,
이와 같은 식물체도 본 발명의 형질 전환체에 포함된다.
실시예
일과성 발현 실험
(1) Stx2eB 일과성 발현 벡터의 구축
Stx2e 단백질의 B 서브유닛 (Stx2eB) 을 코드하는 DNA (배열 번호 5) 가 담배 알코올디하이드로게나아제 유전자
의 5' 비번역 영역 (NtADH5'UTR) 에 연결된 DNA 구축물을 포함하는 벡터를 이하와 같이 하여 제작하였다.
벡터의 디자인을 도 1 에 나타낸다.
1×Stx2eB(PG12) 는 Stx2eB 를 코드하는 DNA 에 PG12 를 코드하는 DNA 를 연결한 DNA 를 포함하는 DNA 구축물
을 나타낸다. 2×Stx2eB(PG12) 는 2 개의 Stx2eB 를 코드하는 DNA 를, PG12 를 코드하는 DNA 를 스페이서
로 하여 연결한 DNA 를 포함하는 DNA 구축물을 나타낸다.
또한, 3 개의 Stx2eB 를 코드하는 DNA 를, PG12 를 코드하는 DNA 를 스페이서로 하여 연결한 DNA 구축물, 3×
Stx2eB(PG12), 및 4 개의 Stx2eB 를 코드하는 DNA 를, PG12 를 코드하는 DNA 를 스페이서로 하여 연결한 DNA
구축물, 4×Stx2eB(PG12) 도 제작하였다.
구체적 수법을 이하에 나타낸다.
Kozak-stx2eb-F 프라이머 (배열 번호 30) 와 stx2eb-R 프라이머 (배열 번호 31) 를 사용하여 PCR 을 실시하고,
Stx2eB 의 성숙 영역 (페리플라즘에 대한 분비 시그널 펩티드를 제외한, Ala19 ∼ Asn87) 을 코드하는 DNA 단편
을 증폭시켰다. 얻어진 DNA 단편을 pBluescript II SK 의 EcoRV 갭에 클로닝하였다. 얻어진 플라스미드를
HindIII 으로 절단하고, T4 DNA polymerase 로 처리한 후 셀프 라이게이션을 실시하고, HindIII 사이트를 NheI
사이트로 변환하였다 (plasmid 1).
Stx2eB 를 이하와 같이 하여 식물 세포에 있어서의 일과성 발현용 벡터, pBI221 (Clontech 사) 의 멀티 클로닝
사이트 (MCS) 에 삽입하였다.
MCS 에 SalI, KpnI 및 SmaI 사이트를 도입하기 위해서, SalKpnSma-F (배열 번호 32) 와 SalKpnSma-R (배열 번
호 33) 을 어닐링 후, T4 polynucleotide kinase (T4 PNK) (TaKaRa 사) 를 사용하여 인산화하고, pBI221 의
SacI 갭에 삽입하였다 (plasmid 2). Plasmid 1 로부터 XbaI 과 KpnI 로 Stx2eB 단편을 잘라내고, plasmid
2 에 삽입하고, 콜리플라워 모자이크 바이러스 35S RNA 프로모터 (35S pro.) 와 노팔린 합성 효소 유전자 전사
터미네이터 (NOS-T) 사이에 배치하였다 (plasmid 3).
담배 알코올디하이드로게나아제 유전자의 5' 비번역 영역 (NtADH 5'UTR, 배열 번호 23) 을, ADH-221 (Sato et.
al., 2004 (하기 참조)) 을 주형으로 하여, ADH XbaI-F 프라이머 (배열 번호 34) 및 ADH NsiI-R 프라이머 (배
열 번호 35) 를 사용한 PCR 에 의해 증폭시켰다. β-D glucan exohydrolase (GenBank ACCESSION AB017502)
의 분비 시그널 펩티드 (배열 번호 18) 를 코드하는 DNA 영역 (배열 번호 17) 을, 담배 게놈 DNA 를 주형으로
하여, βD NsiI-F 프라이머 (배열 번호 36) 및 βD BamHI-R 프라이머 (배열 번호 37) 를 사용하여 증폭시켰다.
얻어진 NtADH 5'UTR 및 분비 시그널 펩티드의 각 DNA 단편을 NsiI (TOYOBO 사 제조) 로 처리하고, Ligation
High (TOYOBO 사) 를 사용하여 라이게이션한 후, 말단을 평활화하고 pBluescript II SK (Stratagene 사 제조)
의 EcoRV 갭에 클로닝하였다 (plasmid 4).
Satoh et al., The 5'-untranslated region of the tobacco alcohol dehydrogenase gene functions as an
effective translational enhancer in plant. J. Biosci. Bioeng. (2004) 98, 1-8
공개특허 10-2011-0009197
Plasmid 4 를 NsiI 로 처리하고, T4 DNA polymerase (TOYOBO 사 제조) 로 말단을 평활화한 후 셀프 라이게이션
하고, NtADH 의 개시 코돈 (atg) 과 분비 시그널 펩티드의 개시 코돈이 일치하도록 연결하였다 (plasmid 5).
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