(19) 대한민국특허청(KR) (12) 공개특허공보(A) - Questel

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도 6 중, 최좌열의 화상 A 는 어느 프로토플라스트에 있어서의 mRFP 의 국재를 나타낸다. mRFP 의 국재는
소포체의 위치를 반영한다. 중열의 화상 B 는 동일한 프로토플라스트에 있어서의 Stx2eB-YFP 하이브리드 단
백질의 국재를 나타낸다. 최우열의 화상은 화상 A 및 B 의 합성 화상이다. 합성 화상으로부터, Stx2eB-
YFP 하이브리드 단백질은 소포체에 과립상으로 국재되어 있음을 알 수 있다.
(6) 소포 수송 기능의 영향
2×Stx2eB(PG12) 의 축적 및 응집이 단백질 번역 후의 어느 과정에서 일어나는지 조사하였다.
2×Stx2eB(PG12)-YFP 를, 애기장대의 소포 수송 조절 단백질 ARF1, 또는 그 도미넌트 네거티브 변이체 ARF1
(Q71L) (ARF1DN) 과 공발현시켰다. 또한, ARF1DN 의 공발현에 의해 골지체에 대한 단백질의 수송이 저해되
는 리포터로 하여 액포형 GFP (vacuole-GFP) 와 각 ARF1 의 공발현을 실시하였다. 각 ARF1 의 발현 벡터의
구축은 이하와 같이 실시하였다. 또한, 액포형 GFP 발현 벡터의 제작은 하기 문헌을 참조하여 실시할 수 있
다.
Di Sansebastiano et. al., Specific accumulation of GFP in a non-acidic vacuolar compartment via a C-
terminal propeptide-mediated sorting pathway. Plant J. (1998) 15, 449-457
소포 수송 조절 단백질로서 애기장대 ARF1 (GenBank Accession No. M95166) 및 그 도미넌트 네거티브 변이체
ARF1 (Q71L) (Masaki Takeuchi et al., 2002 (하기 참조)) 의 발현 벡터를 구축하였다. 애기장대 유식물체
로부터 조제한 cDNA 를 주형으로 하여, ARF1-F 프라이머 (배열 번호 59) 및 ARF1-R 프라이머 (배열 번호 60) 를
사용하여 PCR 을 실시하였다. 얻어진 DNA 단편을 pBluescript (Stratagene) 의 EcoRV 갭에 서브 클로닝하
였다. 또한, ARFQL-F 프라이머 (배열 번호 61) 및 ARFQL-R 프라이머 (배열 번호 62) 를 사용하여 PCR 을
실시하고, 71 번째의 글루타민 잔기를 류신 잔기로 치환하였다. 얻어진 각 ARF1 단편을 일과성 발현용 벡터
pBI221 에 서브 클로닝하였다.
제작한 각각의 벡터를 상기와 동일한 방법으로 담배 배양 세포의 프로토플라스트에 도입하고, 각 단백질을 공발
현시켜, 2×Stx2eB(PG12) 의 국재를 조사하였다.
결과를 도 7 에 나타낸다.
2×Stx2eB(PG12)-YFP 를 ARF1 과 공발현시킨 경우도, ARF1(Q71L) 과 공발현시킨 경우도, 2×Stx2eB(PG12)-YFP
를 단독으로 발현시킨 경우와 마찬가지로 과립이 관찰되었다. 한편, ARF(Q711) 와의 공발현은 소포체로부터
의 액포형 GFP 의 이출 (移出) 을 저해하였다. 이것으로부터, 과립의 형성은 소포체로부터 골지체에 대한
소포 수송 과정에 의존하지 않는 것으로 추측되었다.
담배 배양 세포를 사용한 형질 전환 실험
(1) 형질 전환용 벡터의 구축
상기와 동일하게 하여, 1×Stx2eB(PG12), 2×Stx2eB(PG12), 3×Stx2eB(PG12), 4×Stx2eB(PG12) 를 제작하였다.
또한 PG12 대신에, RS (Arg Ser), PG7 (배열 번호 63) 또는 SG12 (배열 번호 64) 를 스페이서에 사용한 DNA 구
축물, 2×Stx2eB(RS), 2×Stx2eB(PG7), 2×Stx2eB(SG12) 를 이하의 방법으로 제작하였다.
상기 plasmid 8 의 Stx2eB 와 HA 태그 사이에 PG7 스페이서 (배열 번호 63) 를 삽입하였다. PG7-F 프라이
머 (배열 번호 65) 와 PG7-R 프라이머 (배열 번호 66) 를 어닐링하고 T4 PNK 로 인산화하였다. 얻어진 인산
화 DNA 단편을 plasmid 8 의 BglII 갭에 삽입하였다 (plasmid 10).
또한, Stx2eB 와 HA 태그 사이에 SG12 스페이서 (배열 번호 64) 를 삽입하였다. SG12-F 프라이머 (배열 번
호 67) 와 SG12-R 프라이머 (배열 번호 68) 를 어닐링하고 T4 PNK 로 인산화하였다. 얻어진 인산화 DNA 단
편을 plasmid 8 의 BglII 갭에 삽입하였다 (plasmid 11).
공개특허 10-2011-0009197
Plasmid 1 로부터 BamHI 및 BglII 를 사용하여 Stx2eB 단편을 잘라내고, 1×Stx2eB(PG12) 의 BamHI 갭에 삽입
하였다 (2×Stx2eB(RS)). Plasmid 10 으로부터 BamHI 및 BglII 를 사용하여 Stx2eB-PG7 단편을 잘라내고,
1×Stx2eB(PG12) 의 BamHI 갭에 삽입하였다 (2×Stx2eB(PG7)). Plasmid 11 로부터 BamHI 및 BglII 를 사용
하여 Stx2eB-SG12 단편을 잘라내고, 1×Stx2eB(PG12) 의 BamHI 갭에 삽입하였다 (2×Stx2eB(SG12)).
식물의 안정 형질 전환체를 사용하여 Stx2eB 의 생산을 실시하기 위해서, 상기 각 Stx2eB 의 DNA 구축물을 형질
전환용 벡터에 서브 클로닝하였다 (벡터의 디자인은 도 1 을 참조). 1×Stx2eB(PG12), 2×Stx2eB(PG12), 3
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