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REVISTA

Mídia oficial da Instrumentação e

Controle de Qualidade Industrial

Ano 17 - Edição 100 - Abr/Mai 2019


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REVISTA

Ano 17 - Edição 100 - Abr/Mai 2019

EDITORIAL

Chegamos à edição de número 100 da revista Analytica, que continua se consolidando como a revista referência

no setor de controle de qualidade industrial. Nesta edição simbólica, trazemos dois grandes artigos para fornecer

bases científicas para todos que atuam na área. No ramo da qualidade dos alimentos, um dos artigos trata sobre a

qualidade de um dos produtos brasileiros que mais se destaca nos mercados europeus e norte-americanos: o mel.

Produzido com baixo custo, o consumo de mel vem aumentando entre os brasileiros, e assim, se faz cada dia mais

necessário o controle de qualidade para evitar a disseminação de patógenos, zelando pela constante qualidade dos

alimentos consumidos.

Em um segundo momento, iremos explorar um ramo completamente diferente: produtos biotecnológicos, como

o anticorpo bevacizumabe, um dos compostos de suma importância do medicamento Avastin. O estudo multicêntrico

focou na demonstração da capacidade de produzir resultados robustos, para dar suporte para a qualidade deste

princípio. Todos os artigos serão acompanhados do complemento normativo, uma inovação na revista que estamos

construindo para melhor informar o leitor sobre as demandas legais em torno das temáticas retratadas.

Na seção de Microbiologia, o leitor encontrará um tema que transita entre diversos ramos da indústria, e se

faz importante em todas elas: os aspectos microbiológicos do estudo de estabilidade de produtos farmacêuticos.

Pautado nas definições da ANVISA e nos manuais que regem nossa legislação, a seção traz um importante panorama

sobre o cuidado com contaminação de amostras segundo as normas de qualidade vigentes.

Na seção de Análises de minerais desta edição traremos uma discussão importante acerca dos erros sistemáticos

e aleatórios, bem como da importância de identificá-los e reduzi-los, parte fundamental da garantia da qualidade e

confiabilidade dos resultados. Em espectrometria de massas, traremos uma análise acerca dos isótopos, sua história

e importância industrial.

Tudo isso associado à importantes informes de mercado e uma agenda de eventos, planejados para embasar

todos que atuam nos mais diversos campos do setor industrial, priorizando custo, benefício e qualidade.

Boa Leitura!

AMANDA NAVARRO

Esta publicação é dirigida a laboratórios analíticos e de controle de qualidade dos setores:

FARMACÊUTICO | ALIMENTÍCIO | QUÍMICO | MINERAÇÃO | AMBIENTAL | COSMÉTICO | PETROQUÍMICO | TINTAS

Os artigos assinados sâo de responsabilidade de seus autores e não representam, necessariamente a opinião da Editora.

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Comercial | Para Assinaturas | Renovação | Para Anunciar: Daniela Faria | 11 98357-9843 | assinatura@revistaanalytica.com.br

11 3900-2390 | Dúvidas, críticas e ou sugestões, entre em contato, teremos prazer em atendê-lo.

Expediente

Realização: DEN Editora

Conselho Editorial: Sylvain Kernbaum | revista@revistaanalytica.com.br

Jornalista Responsável: Amanda Navarro | redação@newslab.com.br

Publicidade e Redação: Daniela Faria | 11 98357-9843 | assinatura@revistaanalytica.com.br

Coordenação de Arte: HDesign - arte@hdesign.com.br

Produção de conteúdo: Hdesign Comunicação - arte@hdesign.com.br

Impressão: Gráfica Vox | Periodicidade: Bimestral

REVISTA ANALYTICA - ABR/MAI 19

3


REVISTA

Ano 17 - Edição 100 - Abr/Mai 2019

ÍNDICE

03 Editorial

Artigo 1 12

11 Agenda

Avaliação da qualidade microbiológica e físico-química de

méis comercializados em munícipios do estado de Alagoas

Autores: João Paulo dos Santos 1 , Lucas Pedrosa Souto Maior 2 ,

Eliane Costa Souza 3 , Tatiana Almeida Omura de Paula 4 ,

Lúcia Helena Ferreira Santos 5 , Karwhory Wallas Lins da Silva 6 ,

Yáskara Veruska Ribeiro Barros 7 , Velber Xavier Nascimento 8 ,

Alessandra Valério de Almeida Guedes 9 .

Artigo 2 22

Sequenciamento das regiões F(ab)-12 LC e F(ab)-12 HC do anticorpo

monoclonal humanizado bevacizumabe: um estudo multicêntrico

Autores: Eduardo de Souza Matos 1 , Ronaldo Mohana-Borges *1 ,

Vitor Marcel Faça*2, Fábio César Gozzo *3 ,

Wagner Fontes4, Carlos André O. Ricart 4 ,

Fábio César Sousa Nogueira 5 ,

Mário Sérgio Palma §6 ,

Marcelo Valle de Sousa *4 .

Matéria de Capa 36

Vantagens do Método Rápido

na Microbiologia

42 Espectrometria

de Massa

44 Análise de

Minerais

6

REVISTA ANALYTICA - ABR/MAI 19

Microbiologia 46

48 Informe

Científico

50 Em Foco


A RDC nº 234, de 20 de Junho

de 2018 autoriza as Indústrias

Farmacêuticas 280 a terceirizarem as

análises de MATÉRIAS-PRIMAS

ÍNDICE

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REVISTA

Ano 17 - Edição 100 - Abr/Mai 2019

Índice remissivo de anunciantes

ordem alfabética

Anunciante

pág

Altmann 19

Analítica LAB 7

Arena Técnica 35

BCQ Consultoria e Qualidade Ltda 21

Bio Scie 45

Disotax 8-9 | 60

FCE Pharma 55

Feira Analítica 51

Anunciante

pág

Greiner Bio-One 53

Las do Brasil 1

Nova Analítica 2

Polar 27

Prime Cargo 59

Sartorius 47

Veolia 4-5

Esta publicação é dirigida a laboratórios analíticos e de controle de qualidade dos setores:

FARMACÊUTICO | ALIMENTÍCIO | QUÍMICO | MINERAÇÃO | AMBIENTAL | COSMÉTICO | PETROQUÍMICO | TINTAS

Os artigos assinados sâo de responsabilidade de seus autores e não representam, necessariamente a opinião da Editora.

10

REVISTA ANALYTICA - ABR/MAI 19

Conselho Editorial

Carla Utecher, Pesquisadora Científica e chefe da seção de controle Microbiológico do serviço de controle de Qualidade do I.Butantan - Chefia Gonçalvez Mothé, Prof ª Titular da Escola de Química

da Escola de Química da Universidade Federal do Rio de Janeiro - Elisabeth de Oliveira, Profª. Titular IQ-USP - Fernando Mauro Lanças, Profª. Titular da Universidade de São Paulo e Fundador do

Grupo de Cromatografia (CROMA) do Instituto de Química de São Carlos - Helena Godoy, FEA / Unicamp - Marcos E berlin, Profª de Química da Unicamp, Vice-Presidente das Sociedade Brasileira de

Espectrometria de Massas e Sociedade Internacional de Especteometria de Massas - Margarete Okazaki, Pesquisadora Cientifica do Centro de Ciências e Qualidade de Alimentos do Ital - Margareth

Marques, U.S Pharmacopeia - Maria Aparecida Carvalho de Medeiros, Profª. Depto. de Saneamento Ambiental-CESET/UNICAMP - Maria Tavares, Profª do Instituto de Química da Universidade de

São Paulo - Shirley Abrantes Pesquisadora titular em Saúde Pública do INCQS da Fundação Oswaldo Cruz - Ubaldinho Dantas, Diretor Presidente de OSCIP Biotema, Ciência e Tecnologia, e Secretário

Executivo da Associação Brasileira de Agribusiness.

Colaboraram nesta Edição:

Eduardo de Souza Matos, Ronaldo Mohana-Borges, Vitor Marcel Faça, Fábio César Gozzo,Wagner Fontes, Carlos André O. Ricart, Fábio César Sousa

Nogueira, Mário Sérgio Palma, Marcelo Valle de Sousa, João Paulo dos Santos, Lucas Pedrosa Souto Maior, Eliane Costa Souza, Tatiana Almeida Omura de

Paula, Lúcia Helena Ferreira Santos, Karwhory Wallas Lins da Silva, Yáskara Veruska Ribeiro Barros, Velber Xavier Nascimento, Alessandra Valério de Almeida

Guedes, Arena Técnica, Claudio Kiyoshi Hirai, Oscar Vegas Bustillos, Eduardo Pimenta de Almeida Melo.


agenda

Agenda 2019

42ª Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química

Data: 27 a 30/05/2019

Local: Expoville - Joinville, Santa Catarina

Informações: http://www.sbq.org.br/42ra/

42º Encontro de Outono da Sociedade Brasileira de Física

Data: 26 a 31/05/2019

Local: Aracaju, Sergipe.

Informações: http://www.sbfisica.org.br/~eosbf/2019/index.php/pt/

XIV Congresso da Associação Brasileira de Mutagênese e Genômica Ambiental

Data: 03 a 06/06/2019

Local: Dall’Onder Grande Hotel – Bento Gonçalves, Rio grande do Sul

Informações: https://congressomutagen.org/index.php

Ecoenergy 2019

Data: 21 a 23/05/2019

Local: São Paulo Expo – São Paulo, SP.

Informações: http://feiraecoenergy.com.br/16/

9º Seminário e 3ª Feira de Engenharia de Fundações Especiais e Geotecnia

Data: 03 a 06/06/2019

Local: Transamérica ExpoCenter – São Paulo, SP

Informações: https://www.sefe.eng.br/

CURSOS

Sociedade Brasileira de Metrologia (SBM)

Cursos presenciais

23 a 24/05/2019 – Calibração de instrumento de área – Massa

06 a 07/06/2019 – Interpretação dos requisitos da NBR ISO/IEC 17025:2017

Informações: http://metrologia.org.br/wpsite/

REVISTA ANALYTICA - ABR/MAI 19

11


artigo 1

Avaliação da qualidade

microbiológica e

físico-química de méis

comercializados em munícipios

do estado de Alagoas

Imagem Ilustrativa

Autores:

João Paulo dos Santos 1 ,

Lucas Pedrosa Souto Maior 2 ,

Eliane Costa Souza 3 ,

Tatiana Almeida Omura de Paula 4 ,

Lúcia Helena Ferreira Santos 5 ,

Karwhory Wallas Lins da Silva 6 ,

Yáskara Veruska Ribeiro Barros 7 ,

Velber Xavier Nascimento 8 ,

Alessandra Valério de Almeida Guedes 9 .

1. Biomédico, Centro de Estudos Superíores de Maceió - CESMAC,

Especialista em Hemoterapia e Imuno-Hematologia, Departamento

de Oncologia Clínica e Experimental, Disciplina de Hematologia e

Hemoterapia da Universidade Federal de São Paulo- UNIFESP –

EPM, Mestrando em Reumatologia, Universidade Federal de São

Paulo UNIFESP – EPM, Analista de Hemoterapia, Hospital Israelita

Albert Einstein-HMVSC.

2. Biomédico Graduada pelo Centro Universitário Cesmac.

3. Nutricionista, Hospital Escola Dr. Hélvio Auto- UNCISAL.

Especialista em Qualidade na Produção de Alimentos. Mestre em

Nutrição Humana-Universidade Federal de Alagoas (UFAL).

4. Bióloga, Especialista em Hemoterapia, SENAC-SP, Coordenadora

Hemoterapia,Hospital Israelita Albert Einstein-HMVSC.

5. Biomédica Graduada pelo Centro Universitário Cesmac.

6. Biomédico Graduada pelo Centro Universitário Cesmac.

7. Biomédica, Universidade Federal de Pernambuco (UFPE).

Professora assistente de Bioquímica na Universidade Estadual

de Ciências da Saúde de Alagoas e de Microbiologia no Centro

Universitário Cesmac.

8. Doutor em Biotecnologia em Saúde, Rede Nordeste de

Biotecnologia – RENORBIO, Pós-Doutorado, Universidade Federal

de Alagoas, UFAL. Professor do Curso de Nutrição do CESMAC.

9. Bióloga, Universidade de Guarulhos - SP

Instituição: Centro de Estudos Superiores de Maceió-CESMAC.

Rua. Cônego Machado, nº 918, CEP 57051 -160 – Maceió-AL.

Correspondência para: João Paulo dos Santos. Rua Jornal de

Alagoas, 41, Farol. Maceió-AL, CEP: 57051-420. Email: joaobiome@

hotmail.com. Tel. (11) 96473-7972.

12

REVISTA ANALYTICA - ABR/MAI 19

Resumo

O mel é um dos alimentos mais puros da natureza,

com mais de 180 substancias distintas e alta proporção

de carboidratos, que apresenta baixo investimento para

sua produção, e que mesmo pouco consumido pela população

brasileira, teve leve aumento de vendas nos últimos

anos, com isso se faz necessário um controle de

sua comercialização, evitando a disseminação de patógenos,

com isso este estudo contribuiu na avaliação da

qualidade sanitária e físico-química dos méis comercializados

no Estado de Alagoas. Sendo analisadas 32

amostras de méis de diversos municípios através da

quantificando bactérias do grupo coliformes, utilizando

a metodologia de número mais provável e analises

de pH, °brix e umidade, onde quatro méis apresentaram

valor para coliforme maior que 100 NMP/mL e 13

amostras apresentaram-se fora do padrão físico-químico

para umidade, além do fato da necessidade de

uma revisão da legislação atual, já que a mesma não

preconiza parâmetros oficiais para pH e °Brix.

Palavras-chave:

Mel, microbiológico, Físico-químico, Coliformes.

Abstract

Title: Evaluation of microbiological quality and

physicochemical of honey sold in the municipalities of

the state of Alagoas

Honey is one of nature's purest foods, with more than 180

different substances and high proportion of carbohydrates,

which has low investment for their production, and even

a little consumed by the Brazilian population had slightly

increased sales in recent years, with it is necessary to

control its marketing, preventing the spread of pathogens,

thus this study contributed to the assessment of the health

and physical-chemistry of honey sold in the State of Alagoas

quality. Being analyzed 32 honey samples from various

municipalities through the quantification of coliform bacteria,

using the most probable number methodology and analysis

of pH, ° Brix and moisture, where four honeys present

value greater than 100 MPN / mL and 13 coliform samples

presented themselves outside the physical-chemical pattern

for moisture, beyond the fact of the need for a revision of the

current legislation, since it does not seek official parameters

for pH and ° Brix.

Keywords: honey, microbiological, physicochemical,

coliforms.


João Paulo dos Santos1,

Bacharel em Biomedicina pelo Centro de Estudos Superiores de Maceió

(2008) e mestrando em Ciências da Saúde aplicadas à Reumatologia,

pela Universidade Federal de São Paulo, (UNIFESP-EPM).

Introdução

O mel é um dos alimentos mais

puros da natureza, sendo este muito

apreciado por seu sabor característico.

Sua composição complexa

pode apresentar mais de 180

substancias distintas e sua grande

quantidade de carboidratos e outras

substancias como enzimas,

vitaminas, grãos de pólen, cera e

muitas outras dependem basicamente,

da composição do néctar

da espécie vegetal produtora e da

espécie de abelha que o produz,

conferindo-lhe características específicas,

enquanto que as condições

edafo-climáticas e o manejo

do apicultor têm menor influência

nesta composição 1, 2 .

Sua produção não requer altos

volumes de investimentos iniciais

nem grandes áreas de terra. Também

não requer dos produtores

rurais, técnicas especializadas e

nem dedicação exclusiva. Os fatores

culturais, e de acessibilidade ao

mel reflete no baixo consumo por

parte da população brasileira, que

é um dos mais baixos do mundo, 3

mesmo o Brasil apresentando segundo

Lieven 4 um clima considerado

quase perfeito para o manejo do

mel e uma flora bastante ampla.

Com isso segundo IBGE 5 o Brasil

produziu 33.931,5 toneladas

de mel em 2012 destinado ao comercio,

tendo o estado de Alagoas

representado 0,4% de toda produção

de mel Brasileiro e 1,7% da

produção do nordeste com 133,7

toneladas e 7700 toneladas respectivamente.

Porém segundo SEBRAE 6 seu

comercio tem tido um leve aumento

desde 2011, devido à grande

procura da sociedade a produtos

naturais e saudáveis, em busca

de uma melhor qualidade de vida

e segundo SILVIA 7 pelo seu potencial

antimicrobiano evidente no

tratamento diante a uma gama de

infecções microbianas e fúngicas

como infecções cutâneas, pneumonia,

meningites e sinusites.

E mesmo o mel apresentando

uma grande propriedade antimicrobiana,

é possível se visualizar no

mel grupos de microrganismos que

podem se originar da flora intestinal

da própria abelha produtora,

esses que na maioria participam de

uma maneira simbiôntica, recebendo

nutrientes e vitaminas para seu

metabolismo em troca de participação

do processo de metabolismo

do mel e do organismo da abelha,

tendo mais destaque para as bactérias

do grupo que tem capacidade

de produzir ácido glucônico e os

localizados na vesícula melífera 8 .

Enquanto isso, o mel dos favos

pode apresentar além microrganismos

do trato intestinal da abelha

como Bacteridiums spp., Bacilluss

spp., Streptococcus spp. e Clostridium

spp., microrganismos oriundos

do ambiente ao redor da colmeia

como leveduras e bactérias

formadoras de esporos 9 .

Mais a presença de coliformes

totais e fecais, principalmente no

mel pós-extração ou com suspeita

de adulteração é indicador de mal

conformidade higiênica-sanitária

da cadeia produtora do mel, por

isso se faz necessário uma avaliação

constante do produtor da

qualidade microbiológica de seu

produto para uma melhor garantia

de minimização dos riscos de patógenos

se disseminarem para o

consumidor através do mel, tendo

o produtor várias regulamentações

nacionais e locais referentes ao

produção de mel como exemplo a

instrução normativa nº 11, de 20

de outubro de 2000 e a norma técnica

do MERCOSUL como referências

atuais 10,11,12 .

E juntamente com diversos parâmetros

físico-químicos se vêm

sendo utilizados na caracterização

do mel. A composição físico-química

varia em função de fatores

que interferem na qualidade, entre

elas estão as condições climáticas,

estágio de maturação, espécie de

abelhas, processamento e armazenamento

13 .

A partir destas informações, o

estudo contribui para: avaliar a

qualidade sanitária e físico-química

dos méis comercializados no Estado

de Alagoas, verificando pH,

°Brix, Umidade e quantificando

bactérias do grupo coliformes.

Material e Métodos

Coleta de Amostras

Foram coletadas Amostras de

méis artesanais produzidos e comercializados

nos municípios de

Barra de Santo Antônio, Barra de

São Miguel, Batalha, Branquinha,

Capela, Coruripe, Feliz Deserto,

Fleixeras, Inhapí, Jequiá da Praia,

Maceió, Marechal Deodoro, Maribondo,

Matriz do Camaragibe, Pão

de Açúcar, Penedo, Piaçabuçu, Porto

Calvo, Porto de Pedras, Roteiro,

Santana do Ipanema, São Luiz do

Quitunde e Senador Ruy Palmeira,

todos pertencentes ao estado de

Alagoas, onde foram submetidas

análises bacteriológicas e físico-

-químicas.

As amostras foram adquiridas

em forma de doação e compra em

suas embalagens originais contendo

no mínimo 200 mL de mel

e classificadas em embalagens

padronizadas e embalagens reutilizadas

de acordo com os critérios

da instrução normativa nº 11 de 20

de outubro de 2000, sendo em seguida

registradas em ficha de cadastro

padrão (Apêndice A) e transportadas

em caixa de isopor até o

Laboratório de Pesquisas do Centro

Universitário CESMAC.

REVISTA ANALYTICA - ABR/MAI 19

13


artigo 1

Autores:

RESULTADOS E DISCUSSÃO

João Paulo dos Santos 1 ,

Lucas Pedrosa Souto Maior 2 ,

COLETA DE AMOSTRAS

Eliane Costa Souza 3 ,

Tatiana Almeida Omura de Paula 4 ,

Lúcia Helena Ferreira Santos 5 ,

Foram coletadas 32 amostras de méis em suas embalagens Karwhory originais, Wallas Lins tendo da Silva 6 ,

Yáskara Veruska Ribeiro Barros 7 ,

somente 11 amostras (34,38%) comercializadas em embalagens Velber padronizadas,

Xavier Nascimento 8 ,

Alessandra Valério de Almeida Guedes

segundo a legislação brasileira em vigor (IN nº 11, de 20 de outubro de 2000),

9 .

Imagem Ilustrativa

enquanto 21 amostras (65,63%) se apresentaram para comercio em embalagens

Análises de Bactérias do alização de uma nova encubação ômetro da marca DIGIMED, modelo

reutilizadas Grupo Coliforme ou fora dos padrões até completar da legislação 48±2h onde Brasileira foi repetir

a leitura.

de precisão, enquanto a concentra-

em DM-20, vigor com 11 duas . casas decimais

De cada amostra foi retirado 25

mL de Sendo mel em capela confirmada de fluxo la-minar e adicionados a 225 mL de confirmativa para a presença de e a Umidade foram determinadas

ausência Em seguida de foi informação realizada a etapa ou rotulo ção de sólidos prático solúveis e objetivo totais (ºBrix) para

o solução consumidor salina a 0,85%, sobre obtendo o produto coliformes em totais todas e termotolerantes. as embalagens refratômetro que foram portátil classificadas

OPPuma

diluição inicial de 10

como improprias de acordo -1 e a De cada tubo de LST considerado TECH, modelo RCZ, com escala a IN nº 11, de 20 de outubro de 2000, demonstrando

partir desta foi preparada diluições

decimais uma não até 10 -3 conformidade , tendo o de LST de através acordo de alça a de legislação platina para de °Brix envase e escala de de 10% produtos a 27%

positivo, foi transferido alíquotas 55% a 95% e precisão de ±0,2%

assim

uma parte do volume restante repartido

em 3 tubos do de centrifuga Mercosul Verde (GMC Brilhante 36/93), Lactose Bile enquanto 2% dade. todas Sendo todas as embalagens

análises re-

estéril para tubos contendo Caldo e precisão de ±0,5% para a Umi-

alimentícios

de fundo cônico estéreis de 25 ml (Caldo VB) e Caldo Escherichia coli alizadas em triplicata 15 .

padronizadas para caráter de análises estiveram futuras. dentro (Caldo dos EC), padrões os tubos foram estabelecidos incubados

em

pelo Mercosul e presença

Para a realização da etapa presuntiva

selo foi do inoculado ministério 1 mL de da cada agricultura 11,16 estufa 35º±0,5C/48±2h Resultados e

de e 45,5±0,2°C/48±2h . respectivamente.

E foram considerados po-

Coleta de Amostras

Discussão

diluição em três tubos de ensaio

O maior percentual de comercialização do mel em embalagens reutilizadas e

contendo 9 mL de caldo Lauril sitivos aqueles que apresentaram Foram coletadas 32 amostras de

inapropriadas Sulfato Triptose (LST) e com tubo ausência de turvação de rotulagem do caldo e correta produção de é confirmada méis em suas em embalagens outra literatura, originais,

tendo somente 11 amostras

Durhan invertido. Sendo em seguida

segundo incubados em Junior temperatura 17 muitos do utilizado consumidores a tabela de NMP os para preferem (34,38%) por comercializadas ser visualizado em em-

na

gás dentro do tubo de Durhan, sen-

onde

de 35°±0,5C/24±2h, sendo considerados

dos positivos casos pela recorrente turvação NMP/mL ao não 14 . tratamento do mel o legislação resíduo brasileira de cera, em vigor trazendo (IN nº

expressão final do resultado em balagens padronizadas, segundo a

maioria

do meio de cultura com produção

11, de 20 de outubro de 2000), enquanto

torna 21 amostras mais “puro”. (65,63%) Sendo se

uma de gás maior no interior confiança dos tubos e propriedade de Ph, Sólidos para Solúveis o produto Totais que se

Durhan, tendo nos casos que não (ºbrix) e Umidade

apresentaram para comercio em

também confirmado entre os municípios analisados, como mostra a figura 1, a

ocorreram a produção de gás no O potencial de hidrogênio (pH) foi embalagens reutilizadas ou fora

prevalência interior dos tubos de de comercio Durhan, a re-

de embalagens medido a 25ºC, reutilizáveis.

utilizando potenci-

dos padrões da legislação Brasileira

em vigor 11 .

Padronizada

Reutilizado

14

REVISTA ANALYTICA - ABR/MAI 19

4

3

2

1

0

Figura 1 – Municípios pesquisados e quantidade de amostras comercializadas em embalagens reutilizadas e

Fig.1 Padronizadas – Municípios de acordo pesquisados a legislação brasileira e quantidade em vigor. de amostras comercializadas em embalagens

reutilizadas e Padronizadas de acordo a legislação brasileira em vigor.


Sendo confirmada a ausência

de informação ou rotulo prático e

objetivo para o consumidor sobre o

produto em todas as embalagens

que foram classificadas como improprias

de acordo a IN nº 11, de

20 de outubro de 2000, demonstrando

assim uma não conformidade

de acordo a legislação de

envase de produtos alimentícios do

Mercosul (GMC 36/93), enquanto

todas as embalagens padronizadas

estiveram dentro dos padrões

estabelecidos pelo Mercosul e

presença de selo do ministério da

agricultura 11,16 .

O maior percentual de comercialização

do mel em embalagens

reutilizadas e inapropriadas e com

ausência de rotulagem correta é

confirmada em outra literatura,

onde segundo Junior 17 muitos

consumidores os preferem por ser

visualizado na maioria dos casos

recorrente ao não tratamento do

mel o resíduo de cera, trazendo

uma maior confiança e propriedade

para o produto que se torna mais

“puro”. Sendo também confirmado

entre os municípios analisados,

como mostra a figura 1, a prevalência

de comercio de embalagens

reutilizáveis.

Também foi constatada a presença

de sujidade, como insetos,

resíduos de plantas e entre outros,

em cinco amostras ou 23,8% do

total de méis comercializados em

embalagens reutilizadas ou inapropriadas,

representando assim

um indicador de baixa higiene no

armazenamento do produto, onde

Lieven 4 também visualizou a presença

de sujidade em suas amostras,

tendo 4 amostras de um total

de 18 com presença de resíduos

de plantas e insetos.

Análises de Bactérias do

Grupo Coliformes

Como é observado na tabela

1, das 32 amostras de méis analisados,

13 amostras (40,63%)

apresentaram resultados maiores

ou iguais a 3 NMP/mL de coliformes

totais (35°C) e termotolerantes

(45°C), enquanto 19 amostras

(59,37%) apresentaram resultados

< 3 NMP/mL caracterizando ausência

de Coliformes totais (35°C)

e termotolerantes (45°C).

Também foi constatando que das

13 amostras com resultado igual

ou superior a 3 NMP/mL, as amostras

A3, A16 e A28, apresentaram

o valor máximo em NMP/mL encontrados

em um alimento.

Desde a revogação da portaria

N° 367 de 04 de setembro de

1994 pelo atual regulamento técnico

de identidade e qualidade do

mel nº 11, de 20 de outubro de

2000, não se visualiza valores de

referência e parâmetros microbiológicos

para avaliação da qualidade

microbiológica do mel, que na portaria

revogada se considerava qualquer

mel com valor igual ou maior

que 3 NMP/mL como improprio

para comercio e consumo, onde

também é encontrada ausência de

valores microbiológicos específicos

para o mel na regulamentação

técnica sobre padrões microbiológicos

para alimentos de consumo

humano (RDC N° 12 de 02 de janeiro

2001), se fazendo necessário

a atualização dos padrões técnicos

do país para o produto, deixando

mais claro para o produtor o limar

de segurança de seu alimento 18 .

Com tudo, mesmo que a legislação

brasileira não apresente referências

microbiológicas para o

mel, a análise microbiológica foi

baseada segundo outras literaturas,

que fixam o limiar de aceitação

de acordo aos padrões da RDC

N° 12 de 02 de janeiro 2001 em

relação ao melado e o melaço que

é de 100NMP/mL, pois levam em

conta a sua similaridade físico-

-química, levando cinco amostras

da tabela 1 com resultados de coliformes

a 45°C maiores que 100

NMP/mL a se enquadrarem como

impróprias para consumo, já que

a presença de coliformes a 45° ou

Termotolerantes segundo Alves 19 e

JAY 20 nos alimentos revelam uma

baixa condição higiênica-sanitária

os tornando um causador de enfermidades,

e em outras literaturas

padrões microbiológicos parecidos

foram visualizados, mesmo em um

alimento com propriedades anti-

-microbianas 21, 22 .

Vide Tabela 1 – Valores dos micro-

-organismos nas amostras analisadas e seus

respectivos municípios.

Outros estudos apresentaram divergência

em relação a valores de

coliformes a 45° em relação a este

estudo, onde Pires 23 e Souza 10 encontraram

em todas as suas amostras

ausência de coliformes a 45°,

porem ambos focaram seu processo

de análise em méis retirados

diretamente da coméia, sugerindo

para os resultados do quadro 1

positivos para coliformes a 45° de

contaminação no processo de envase

do mel tanto nas embalagens

reutilizadas como nas embalagens

padronizadas.

A maior positividade microbiana

em recipientes reutilizados também

foi constatada por Lieven 4 ,

tendo uma maior positividade microbiológica

em méis comercializados

em recipientes reutilizados,

já que a forma rustica e artesanal

do envase contribui para um maior

contato entre o produto e produtor.

Foi visualizado nas amostras A3,

A4, A9, A14, A29 da tabela 1 tanto

uma positividade microbiológica

como a presença de sujidade no

produto comercializado sugerindo

assim uma relação entre os dois

quadros.

REVISTA ANALYTICA - ABR/MAI 19

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16

artigo 1

REVISTA ANALYTICA - ABR/MAI 19

Autores:

João Paulo dos Santos 1 ,

Lucas Pedrosa Souto Maior 2 ,

Eliane Costa Souza 3 ,

como impróprias para consumo, já que a presença de coliformes Tatiana Almeida a 45° Omura ou de Paula 4 ,

Lúcia Helena Ferreira Santos 5 ,

Termotolerantes segundo Alves 19 e JAY 20 nos alimentos revelam Karwhory uma Wallas baixa Lins da Silva 6 ,

Yáskara Veruska Ribeiro Barros

condição higiênica-sanitária os tornando um causador de enfermidades, e em outras

7 ,

Velber Xavier Nascimento 8 ,

literaturas padrões microbiológicos parecidos foram visualizados,

Alessandra

mesmo

Valério

em

de Almeida

um

Guedes 9 .

alimento com propriedades anti-microbianas 21, 22 .

Tabela. 1 – Valores dos micro-organismos nas amostras analisadas e seus

respectivos Tabela 1 – Valores municípios. dos micro-organismos nas amostras analisadas e seus respectivos municípios.

N° da

Micro-organismos

Municípios

Amostra

Coliformes a 35°C

(NMP/mL)

Coliformes a 45°C

(NMP/mL)

Barra de Santo Antônio A1 1100

Branquinha A4 6,2 6,2

Capela A5


O potencial de hidrogênio (pH) dos lotes analisados, representados na tabela

2 demonstram um padrão predominante de pH ácido com média de 4,01, onde o

menor e maior valor de pH respectivamente foram 2,27 e 5,03, enquanto o valor

médio encontrado para sólidos solúveis (°Brix) foi de 78,12%, apresentando uma

variação Determinações que ficou de PH, entre Sólidos

Solúveis (°Brix) e Umidade e maior valor de pH respectivamenmetro

descrito na legislação atual

74% com e 82%. média de 4,01, onde o menor A Umidade (%H2O) único parâ-

(%H2o) A Umidade (%H2O) único te foram parâmetro 2,27 e 5,03, descrito enquanto o na legislação em vigor apresentou atual em uma variação vigor

O potencial de hidrogênio (pH) valor médio encontrado para sólidos

solúveis

média de 19,88%, tendo o valor

dos

apresentou

lotes analisados,

uma

representados

variação média de 19,88%,

(°Brix) foi

tendo

de 78,12%,

o valor

máximo

máximo

encontrado

encontrado

de 24,50%

de

e

24,50% na tabela e o 2 valor demonstram mínimo um de 10,50%. apresentando uma variação que o valor mínimo de 10,50%.

padrão predominante de pH ácido ficou entre 74% e 82%.

Tabela 2 – Parâmetros de pH, °Brix e %H2O encontrados em amostras de méis

comercializados Tabela 2 – Parâmetros no de estado pH, °Brix de e %H2O Alagoas. encontrados em amostras de méis comercializados no estado de Alagoas.

Parâmetros pH °Brix %H2O

Máximo 5,03 82,00% 24,50%

Mínimo 2,27 74,00% 10,50%

Medias 4,01 78,12% 19,88%

O resultado

O resultado

médio e a

médio

faixa de

e a a faixa temperatura de resultados de armazenamento para o pH padrão demonstrados parecido pH na e tabela °Brix em

resultados 2, também para o pH são demonstrados visualizados para em comercio outras do mel literaturas, 26,xxx . relação a outras literaturas publicadas

21,27,31,32 , e uma relação entre

onde ANDRIGHETTO 24 e

na tabela 2, também são visualizados

CAMPOS em outras 25 visualizaram literaturas, onde respectivamente solúveis (°Brix) também um padrão foram ob-

ácido o com pH e valor a umidade média com de a vida 4,18 de

E além do pH, valores de sólidos

ANDRIGHETTO

e 4,08 de 24 e CAMPOS

pH das amostras 25 visualizaram

respectivamente um dos não na legislação atual, onde o desenvolvimento microbiológico.

servados, entretanto não são cita-

prateleira do mel, já que propicia o

estudadas. Porém, não se visualiza na legislação atual

padrão (IN nº ácido 11, com de 20 valor de média outubro de de °Brix 2000) se revela uma como faixa a quantidade de pH ideal para a comercialização

4,18 e 4,08 de pH das amostras de sólidos encontrados dissolvidos Conclusão

estudadas. do mel, Porém, já que não seu visualiza

na legislação atual (IN nº 11, de

pH está na ligado água dos diretamente alimentos e tem a gran-

florada De usada acordo pela com abelha os resultados na

encontrados, a uma necessidade

20 de outubro de 2000) uma faixa

de maior revisão da legislação em

de pH ideal para a comercialização

vigor, principalmente no quesito

do mel, já que seu pH está ligado

microbiológico e que o envase do

diretamente a florada usada pela

mel e seus parâmetros físico-químicos

devem ser observados para

abelha na produção do mel, sendo

assim a análise de pH baseada segundo

outras literaturas, que estão

conservação de sua vida de prateleira

em especial a umidade, já

estabelecendo uma faixa ideal para

que valores elevados podem além

o produto entre 2,3 e 5,5 de pH,

de acarretar uma menor segurança

sendo mais recomendado méis

microbiológica, gerar a suspeita de

com valores inferiores a 4, já que

adulteração.

valores muito altos diminuem sua

capacidade bactericida e sua vida

Referências

de prateleira 8,24,26 1 White Júnior JWH. Honey. New York: Advances in Food

. Valores de pH,

Research. 1978. v. 22, p.287-374.

°Brix e Umidade das amostras e

2 Vargas T. Avaliação da qualidade do mel produzido na região

dos Campos Gerais do Paraná. [Monografia de conclusão

seus respectivos municípios estão

de curso de Mestrado em Ciência e tecnologia de alimentos].

Ponta Grossa: Universidade Federal de Ponta Grossa, 2006.

descritos na tabela 3.

Tabela 3 – Valores de pH, °Brix

e Umidade das amostras analisadas

e seus respectivos municípios.

Com isso todos os méis da tabela

3 estão de acordo com os

valores de pH estabelecidos pelas

literaturas atuais, onde está grande

faixa de variação do pH pode ser

explicada pela variedade da flora

de cada município e a temperatura

de armazenamento dos méis,

já que estudos demonstram uma

variação do pH original de acordo

de importância para a agroindústria

na qualidade final do produto e seu

controle de ingredientes, sendo

esse parâmetro realizado como

mais uma variável de comparação

analítica, onde comparativos

a outras literaturas demonstram

uma faixa de resultados dentre

as visualizadas na tabela 3, tendo

Meireles 27 e Silva 28 apresentado

respectivamente uma variação entre

81,55% a 83,85% e 76,07%

a 80,80%.

Porem diferente do pH e do °Brix

a umidade se enquadra como único

parâmetro analisado que apresenta

descrição na legislação atual,

não podendo passar de 20%, já

que valores elevados afetam tanto

a atividade antimicrobiana como o

valor de pH 18,25,27,29 .

Com isso, os méis A2, A11, A21,

A22, A23, A28, A29 E A32 da tabela

3 estão classificados como inadequados

para comercialização, já

que estão com valores superiores

ao exigido pela legislação, sendo

também visualizado em Pires 21 e

Silva 28 valores acima do aceitável,

levando assim ao aumento do pH

e da diminuição do tempo de plateleira

29,30,31 .

Sendo assim demostrado um

3 Oliveira JTCO, Santos AF, Freitas WR, Almeida OC, Junior

JPS. O Mercado de mel e produtos apícolas no município de

Garanhuns-Pe. Garanhuns: Universidade Federal Rural de

Pernambuco, 2009. [Acesso em 15 de abril de 2013]. Disponível

em .

4 Lieven M, Correia KR, Flor TL, Fortuna JL. Avaliação da

qualidade microbiológica do mel comercializado no extremo

sul da Bahia. Bahia: Revista Baiana de Saúde Pública. 2009.

v.33, p.544-552.

5 IBGE - Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística.

Produção de origem animal, por tipo de produto. Rio de

Janeiro, 2013. [Acesso em 11 de Julho de 2014]. Disponível

em .

6 Sebrae. Produções de ovos, lã e mel crescem, enquanto

caem casulos de bicho da seda. São Paulo, 2012. [Acesso em

03 de Maio de 2014]. Disponível em: .

7 Lorenzetti ER, Marques P, Caldas RG. Microbiologia

do mel. São Paulo, 2009. [Acesso em 03 de Maio de 2014].

REVISTA ANALYTICA - ABR/MAI 19

17


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artigo 1

REVISTA ANALYTICA - ABR/MAI 19

Autores:

João Paulo dos Santos 1 ,

Lucas Pedrosa Souto Maior 2 ,

Eliane Costa Souza 3 ,

Tatiana Almeida Omura de Paula 4 ,

produção do mel, sendo assim a análise de pH baseada segundo outras Lúcia literaturas,

Helena Ferreira Santos 5 ,

Karwhory Wallas Lins da Silva 6 ,

que estão estabelecendo uma faixa ideal para o produto entre 2,3 Yáskara e 5,5 Veruska de Ribeiro pH, Barros 7 ,

Velber Xavier Nascimento 8 ,

sendo mais recomendado méis com valores inferiores a 4, já que Alessandra valores Valério muito de Almeida altos Guedes 9 .

diminuem sua capacidade bactericida e sua vida de prateleira 8,24,26 . Valores de pH,

Imagem Ilustrativa

°Brix e Umidade das amostras e seus respectivos municípios estão descritos na

tabela 3.

Tabela 3 – Valores de pH, °Brix e Umidade das amostras analisadas e seus

Tabela 3 – Valores de pH, °Brix e Umidade das amostras analisadas e seus respectivos municípios.

respectivos municípios.

N° da

Físico-Químico

Municípios

Amostra

pH °Brix % H 2O Umidade

Barra de Santo Antônio A1 4,18 79,00% (±0,5%) 20,00% (±0,5%)

Barra de São Miguel A2 3,85 76,00% (±0,5%) 21,00% (±0,5%)

Batalha A3 4,08 78,00% (±0,5%) 19,50% (±0,5%)

Branquinha A4 3,75 80,00% (±0,5%) 18,00% (±0,5%)

Capela A5 4,1 77,50% (±0,5%) 20,50% (±0,5%)

Coruripe A6 4,46 79,00% (±0,5%) 19,00% (±0,5%)

Feliz Deserto A7 4,02 79,00% (±0,5%) 19,00% (±0,5%)

Flexeiras A8 5,03 78,00% (±0,5%) 20,00% (±0,5%)

Inhapi A9 3,3 76,00% (±0,5%) 20,25% (±0,5%)

A10 4,18 78,00% (±0,5%) 20,00% (±0,5%)

Jequiá da Praia

A11 4,19 77,50% (±0,5%) 21,50% (±0,5%)

Maceió A12 3,84 79,00% (±0,5%) 20,50% (±0,5%)

Marechal Deodoro A13 4,29 78,50% (±0,5%) 20,00% (±0,5%)

Maribondo A14 4,08 79,56% (±0,5%) 20,50% (±0,5%)

Matriz do Camaragibe A15 4,18 80,00% (±0,5%) 10,50% (±0,5%)

A16 3,62 80,00% (±0,5%) 19,50% (±0,5%)

Pão de Açúcar

Penedo

A17 3,61 79,00% (±0,5%) 19,00% (±0,5%)

A18 3,65 79,90% (±0,5%) 19,50% (±0,5%)

A19 4,19 82,00% (±0,5%) 18,00% (±0,5%)

A20 3,66 80,00% (±0,5%) 18,50% (±0,5%)

A21 3,63 74,00% (±0,5%) 23,50% (±0,5%)

A22 4,25 77,00% (±0,5%) 21,00% (±0,5%)

A23 3,8 76,00% (±0,5%) 22,00% (±0,5%)

Piaçabuçu

A24 4,12 78,30% (±0,5%) 20,00% (±0,5%)

Porto Calvo A25 4,36 79,50% (±0,5%) 18,50% (±0,5%)

Porto de Pedras A26 3,84 76,00% (±0,5%) 20,00% (±0,5%)

Roteiro A27 3,65 79,50% (±0,5%) 19,50% (±0,5%)

A28 2,77 74,00% (±0,5%) 24,50% (±0,5%)

Santana do Ipanema

A29 4,02 77,00% (±0,5%) 21,00% (±0,5%)

São Luís do Quitunde A30 4,35 79,00% (±0,5%) 19,00% (±0,5%)

A31 4,5 77,50% (±0,5%) 20,25% (±0,5%)

Senador Rui Palmeira

A32 5 76,00% (±0,5%) 22,20% (±0,5%)


Disponível em:

8 Silva RA, Maia GA, Sousa, PHM, Costa, JMC. Composição

e propriedades terapêuticas do mel de abelha. Araraquara:

Alim. Nutr. 2006. V.17, n.1, p.113-120.

9 Barros LB. Perfil sensorial e de qualidade do mel de abelha

(apismellifera) produzido no estado do Rio de Janeiro.

[Monografia de conclusão de curso Doutorado em medicina

veterinária]. Niterói: Universidade Federal Fluminense, 2011.

10 Souza BA, Marchini LC, Dias CTS, Oda-Souza M, Carvalho

CAL, Alves RMO. Avaliação microbiológica de amostras de mel

de trigoníneos (apidae: trigonini) do estado da Bahia. Campinas:

Ciênc. Tecnol. Aliment. 2009. V.29, n.4, p798-802.

11 Brasil. Ministério da Agricultura e do Abastecimento.

Instrução Normativa Nº 11, DE 20 DE OUTUBRO DE 2000.

12 Santos DC, Martins JN, Silva KFNL. Aspectos físico-

-químicos e microbiológicos do mel comercializado na cidade

de Tabuleiro Do Norte-Ceará. Mossoró: Revista Verde. 2009.

V.5, n.1, p.79-85.

13 Franco BDGM, Landegraf M. Microbiologia de alimentos.

São Paulo: Atheneu. 2003. 182p.

14 Silva N, Junqueira VCA, Silveira NFA. Manual de métodos

de análise microbiológica de alimentos e água. São Paulo:

Varela. 2010. 295p.

15 LANARA - Laboratório Nacional de Referência Animal.

Métodos Analíticos. II – Métodos físico-químicos para Mel.

Brasília: Ministério da Agricultura. 1981. cap. 25, p. 1-15.

16 Mercosur. GMC 36/93 - Reglamento Tecnico Mercosur

Para Rotulacion Dealimentos Envasados. Asunción, 1993

[Acesso em 18 de outubro de 2014]. Disponível em:

17 Júnior, JZS. Qualidade do mel em unidade de beneficiamento

de apicultores familiares. [Monografia de conclusão de

curso - Especialista em gestão da defesa sanitária agropecuária].

Curitiba: Universidade Federal do Paraná, 2011.

18 Brasil - Ministério da Saúde. Agência Nacional de Vigilância

Sanitária. Resolução RDC n°275, de 21 de outubro de

2002.

19 Alves TTL, Meneses ARV, Silva JN, Parente GDL, Holanda

neto, JP. Caracterização físico-química e avaliação microbiológica

de méis de abelhas nativas do nordeste brasileiro. Mossoró:

Revista Verde. v.6, n.3, p.91-97, 2011.

20 Jay JM. Microbiologia de alimentos. Porto Alegre: Artmed.

2005. 6. ed.

21 Matos ITSR, Nunes MT, Mota DA, Laureano MMM. Qualidade

microbiológica do mel de melípona sp. produzido na

Amazônia central (Parintins – AM – Brasil). Mossoró: Revista

Verde. 2011. V.6, n.4, p.91-95.

22 Sales DP, Souza PB, Brito LBS, Alves LMC, Bezerra JMD.

Avaliação da qualidade microbiológica de amostras de mel de

Melipona compressipese de apismelliferano estado do Maranhão.

Maranhão, 2011. [Acesso em 25 de Agosto de 2014].

Disponível em:

23 Pires RMC. Qualidade do mel de abelhas apismelliferalinnaeus,

1758 produzido no Piauí. [Monografia de conclusão

de curso - Mestre em alimentos e nutrição pelo programa de

Pós-Graduação em Alimentos em Nutrição]. Teresina: Universidade

Federal Do Piauí, 2011.

24 Andrighetto AJ, Andrighetto RM, Sarzi, MIV, Marque,

MS. Avaliação da qualidade físico-química do mel comercializado

em Santo Augusto- RS. In: Fórum Nacional de Iniciação

Científica no Ensino Médio e Técnico. Anais. Santa Catarina:

Universidade Federal de Santa Catarina, 2009.

25 Campos FS, Gois GC, Carneiro GG. Parâmetros físico-

-químicos do mel de abelhas Meliponas cutellaris produzido

no estado da Paraíba. Uberaba: FAZU em Revista. 2010. p.186

– 190.

26 Capuci K, Honorato CA. Efeito Da Temperatura De Estocagem

Na Qualidade Do Mel .Dourados : Revista de Ciências

Exatas e da Terra. 2012, v1, n.1.

27 Meireles S, Cançado IAC. Mel: Parâmetros de qualidade

e suas implicações para a saúde. Pará de Minas :Revista Digital

FAPAM. 2013. v.4, n.4, p207-219.

28 Silva CL, Queiroz AJM, Figueiredo RMF. Caracterização

físico-química de méis produzidos no Estado do Piauí para

diferentes floradas. Campina Grande: Revista Brasileira de Engenharia

Agrícola e Ambiental. 2004. v. 8, n. 2/3. [Acesso em

25 de Agosto de 2014]. Disponível em:

29 Bera A. Efeitos nas características físico-químicas, microbiológicas

e sensoriais em amostras de mel de abelhas

submetidas à radiação gama. [Monografia de conclusão de

curso - Doutorado em Ciências na Área de tecnologia Nuclear].

São Paulo: Universidade Federal de São Paulo, 2010.

30 Europen Commission. Opinion of the Scientific Committee

on Veterinary Measures Relting to Public Health on Honey

and Microbiological Hazards. Bruxelas. 2002.

31 Pinto CCOA, Lima LRP. Análises físico-químicas de méis

consumidos no Vale do Aço/ MG. Coronel Fabriciano: Farmácia

& Ciência. 2010. v.1, p.27-40.

32 Schlabitz C, Silva, SAF, Souza, CFV. Avaliação de parâmetros

físico-químicos e microbiológicos em mel. Lajeado: Revista

Brasileira de Tecnologia Agroindustrial. 2010. v. 04, n. 01.


Complemento Normativo

Referente ao artigo: 1

Disponibilizado por Analytica em parceria com

Arena Técnica

artigo 1

Avaliação da qualidade microbiológica

e físico-química de méis comercializados em

munícipios do estado de Alagoas

ABNT NBR 16581

Meliponicultura — Mel — Classificação e características

Norma publicada em: 05/2017. / Status: Vigente.

Classificação 1: Apicultura. Classificação 2: Norma recomendada.

Artigo: Avaliação da qualidade microbiológica e físico-química de méis comercializados em

municípios do estado de Alagoas.

Entidade: ABNT.

País de procedência/Região: Brasil. Resumo: Esta Norma estabelece um sistema para classificação

do mel produzido pelas abelhas sem ferrão, especificando suas características e

definindo as suas formas de apresentação, métodos de processamento e conservação. https://

www.abntcatalogo.com.br/norma.aspx?ID=370936

ABNT NBR 16573

Apicultura - Materiais - Vestimentas apícolas

Norma publicada em: 12/2016. / Status: Vigente.

Classificação 1: Apicultura. Classificação 2: Norma recomendada.

Artigo: Avaliação da qualidade microbiológica e físico-química de méis comercializados em

municípios do estado de Alagoas.

Entidade: ABNT.

País de procedência/Região: Brasil. Resumo: Esta Norma especifica os

requisitos de confecção, segurança e conforto para as vestimentas apícolas.

https://www.abntcatalogo.com.br/norma.aspx?ID=364601

ABNT NBR 16572

Apicultura - Equipamento - Centrífuga apícola.

Norma publicada em: 12/2016. / Status: Vigente.

Classificação 1: Apicultura. Classificação 2: Norma recomendada.

Artigo: Avaliação da qualidade microbiológica e físico-química de méis comercializados em

municípios do estado de Alagoas.

Entidade: ABNT.

País de procedência/Região: Brasil. Resumo: Esta Norma especifica os

requisitos para industrialização de centrífuga apícola.

https://www.abntcatalogo.com.br/norma.aspx?ID=364601

ABNT NBR 16576

Apicultura — Pólen apícola — Sistema de produção no campo

Norma publicada em: 05/2017. / Status: Vigente.

Classificação 1: Apicultura. Classificação 2: Norma recomendada.

Artigo: Avaliação da qualidade microbiológica e físico-química de méis comercializados em

municípios do estado de Alagoas.

Entidade: ABNT.

País de procedência/Região: Brasil. Resumo: Esta Norma estabelece os requisitos para instalação

de apiário, manejo das colmeias, coleta, acondicionamento, transporte e armazenamento

de pólen apícola. https://www.abntcatalogo.com.br/norma.aspx?ID=370927

DIN 10755

Analysis of honey - Determination of mineral content

Norma publicada em: 04/2001. / Status: Vigente. Classificação 1: Norma recomendada.

Artigo: Avaliação da qualidade microbiológica e físico-química de méis comercializados em

municípios do estado de Alagoas.

Entidade: DIN. País de procedência/Região: Alemanha.

https://www.beuth.de/en/standard/din-10755/38095701

DIN 10756

Analysis of honey - Determination of free acidity

Norma publicada em: 08/2009. / Status: Vigente. Classificação 1: Norma recomendada.

Artigo: Avaliação da qualidade microbiológica e físico-química de méis comercializados em

municípios do estado de Alagoas.

Entidade: DIN. País de procedência/Região: Alemanha.

https://www.beuth.de/en/standard/din-10756/117797171

DIN 10758

Analysis of honey - Determination of the content of saccharides fructose, glucose, saccharose,

turanose and altose - HPLC method

Norma publicada em: 05/1997. / Status: Vigente. Classificação 1: Norma recomendada.

Artigo: Avaliação da qualidade microbiológica e físico-química de méis comercializados em

municípios do estado de Alagoas.

Entidade: DIN. País de procedência/Região: Alemanha.

https://www.beuth.de/en/standard/din-10758/2949226

20

REVISTA ANALYTICA - ABR/MAI 19

DIN 10741

Analysis of honey - General guidelines for the ad hoc validation of analysis methods for organic

residues or contaminants

Norma publicada em: 08/2010. / Status: Vigente. Classificação 1: Norma recomendada.

Artigo: Avaliação da qualidade microbiológica e físico-química de méis comercializados em

municípios do estado de Alagoas.

Entidade: DIN. País de procedência/Região: Alemanha.

https://www.beuth.de/en/standard/din-10741/128420142

DIN 10762

Analysis of honey - Determination of ethanol content - Enzymatic method

Norma publicada em: 06/2004. / Status: Vigente. Classificação 1: Norma recomendada.

Artigo: Avaliação da qualidade microbiológica e físico-química de méis comercializados em

municípios do estado de Alagoas.

Entidade: DIN. País de procedência/Região: Alemanha.

https://www.beuth.de/en/standard/din-10762/71075024

DIN 10763

Analysis of honey - Determination of glycerol content - Enzymatic method

Norma publicada em: 06/2004. / Status: Vigente. Classificação 1: Norma recomendada.

Artigo: Avaliação da qualidade microbiológica e físico-química de méis comercializados em

municípios do estado de Alagoas.

Entidade: DIN. País de procedência/Região: Alemanha.

https://www.beuth.de/en/standard/din-10763/71076913

DIN 10759

Analysis of honey - Determination of saccharase activity - Siegenthaler method

Norma publicada em: 12/2016. / Status: Vigente. Classificação 1: Norma recomendada.

Artigo: Avaliação da qualidade microbiológica e físico-química de méis comercializados em

municípios do estado de Alagoas.

Entidade: DIN. País de procedência/Região: Alemanha.

https://www.beuth.de/en/standard/din-10759/264017752

DIN 10750-1

Analysis of honey - Determination of diastase activity - Part 1: Schade method

Norma publicada em: 09/2018. / Status: Vigente

Classificação 1: Norma recomendada.

Artigo: Avaliação da qualidade microbiológica e físico-química de méis comercializados em

municípios do estado de Alagoas.

Entidade: DIN.

País de procedência/Região: Alemanha.

https://www.beuth.de/en/standard/din-10750-1/292262555

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publicação em sua íntegra por estarem protegidos por copyright.


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artigo 2

Sequenciamento das regiões

F(ab)-12 LC e F(ab)-12

HC do anticorpo monoclonal

humanizado bevacizumabe: um

estudo multicêntrico

Autores:

Eduardo de Souza Matos 1 ,

Ronaldo Mohana-Borges *1 ,

Vitor Marcel Faça*2, Fábio César Gozzo *3 ,

Wagner Fontes4, Carlos André O. Ricart 4 ,

Fábio César Sousa Nogueira 5 ,

Mário Sérgio Palma §6 ,

Marcelo Valle de Sousa *4 .

1- Centro de Espectrometria de Massas de Biomoléculas (CEMBIO),

Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho (IBCCF), UFRJ

2- Laboratório de Proteômica do Câncer - Faculdade de Medicina de

Ribeirão Preto – USP.

3- Instituto de Química, Unicamp.

4- Núcleo de Proteômica, Laboratório de Bioquímica e Química de

Proteínas, Departamento de Biologia Celular, UnB.

5- Unidade de Proteômica, Instituto de Química, UFRJ e Laboratório de

Proteômica, LADETEC, Instituto de Química, UFRJ.

6- Laboratório de Biologia Estrutural e Zooquímica; CEIS/Instituto de

Biociências de Rio Claro-UNESP.

* Estes laboratórios contribuíram igualmente para o trabalho.

(§) Autor correspondente: Prof. Dr. Mario Sergio Palma;

e-mail: mario.palma@unesp.br; Fone : (19) 3526 4163

Imagem Ilustrativa

22

REVISTA ANALYTICA - ABR/MAI 19

Resumo

Produtos biotecnologicos, como o anticorpo bevacizumabe,

o ingrediente ativo do medicamento

Avastin, dependem de sua estrutura tridimensional

perfeita para serem terapeuticamente ativos. Sua

característica biológica de ligação muito específica

ao Fator de Crescimento Endotelial Vascular (VEGF)

é definida pela sequência de aminoácidos da proteína.

Quatro laboratórios diferentes especialistas em

espectrometria de massas de proteínas no Brasil

desenvolveram estratégias independentes para

sequenciar as cadeias pesada e leve do anticorpo

bevacizumabe. Usando diferentes tipos de instrumentação,

enzimas proteolíticas e ferramentas de

bioinformática para interpretação dos espectros de

massa, os quatro grupos foram capazes de confirmar

de forma independente as sequências dos

domínios que contêm as regiões hipervariáveis do

bevacizumabe em três diferentes lotes do produto

comercial Avastin. Desta forma, os laboratórios

envolvidos neste estudo multicêntrico, demonstraram

capacidade em fornecer resultados analíticos

robustos, que suportam a qualidade de tal princípio

ativo complexo em uso clínico.

Palavras-chave: anticorpos; espectrometria

de massas; sequenciamento de proteínas; peptídeos;

proteoma; bioinformática

Abstract

Biotechnology products such as the antibody

bevacizumab, the active ingredient of the drug

Avastin, depend on its perfect three-dimensional

structure to be therapeutically active. The

biological feature of the antibody bevacizumab

to bind very specifically to the Vascular

Endothelial Growth Factor (VEGF) is defined by

the amino acid sequence of the protein. Four

different laboratories specialized in protein mass

spectrometry in Brazil developed independent

strategies to sequence the heavy and light

chains of the antibody bevacizumab. Using

different types of instrumentation, proteolytic

enzymes and bioinformatics tools for mass

spectra interpretation, all four groups were able

to independently confirm the complete sequence

of the domains that contain the hypervariable

regions of bevacizumab in three different batches

of the commercial product Avastin. In conclusion,

the laboratories involved in this multicentric

study demonstrated capacity to provide robust

analytical results that support the quality of such

a complex active principle in clinical use.

Keywords: antibodies; mass spectrometry;

protein sequencing; peptides; proteomics;

bioinformatics.


Professor Dr. Mario Sergio Palma, químico, doutor em Bioquímica

pela USP e pós-doutorado em Quimica Bio-Orgânica pelo Instituto

SUNBOR em Osaka, Japão. Professor titular da UNESP.

1 Introdução

Desde que Kohler e Milstein

desenvolveram um procedimento

para produção de anticorpos

monoclonais (MAbs) (KÖHLER &

MILSTEIN, 1975) os cientistas reconheceram

que anticorpos em

geral poderiam potencialmente se

tornar ferramentas muito potentes

para o tratamento de muitas doenças

(SMITH, 1996). MAbs são

tipicamente modelados à forma/

função das imunoglobulinas (Igs),

que são tipicamente grandes proteínas

homodiméricas, de massa

molecular da ordem de 150 kDa,

em que cada molécula é constituída

de duas cadeias pesadas idênticas

(50 a 70 kDa), e duas cadeias

leves também idênticas entre si (22

a 24 kDa). As cadeias leves e pesadas

são ligadas entre si através

de pontes dissulfeto. As regiões

N-terminais destas cadeias contêm

as sequências hipervariáveis

de aminoácidos que determinam

a especificidade de ligação das Igs

aos antígenos específicos (Fab); já

as regiões C-terminais de ambas

as cadeias (Fc) contêm sequências

constantes, que caracterizam as

Igs por isotipo e classe.

Devido ao crescente uso terapêutico

de anticorpos, agências

regulatórias de muitos países desenvolvidos

têm estabelecido rígidos

padrões de controle de qualidade

para essas proteínas. As

características estruturais dessas

macromoléculas biológicas descritas

acima são fontes conhecidas

de heterogeneidade intrínseca,

que frequentemente resultam em

questionamentos tais como: i) quão

reprodutíveis são os diferentes lotes,

quando comparados entre si?;

ii) quão “pura” é cada preparação

(lote)?; iii) qual a homogeneidade

do produto final?; iv) Existem diferentes

padrões de modificações

pós-traducionais (glicosilações)

nessas preparações?; ou ainda v)

qual a concentração real de proteína

em cada preparação? Atualmente,

a espectrometria de massas

(EM) tem um papel central no

controle de qualidade da produção

e na caracterização estrutural de

proteínas e em especial dos MAbs

(LADWIG et al., 2017; SEN et al.,

2017).

A proteômica estuda o complemento

proteico do genoma das

células, ou seja, o proteoma (WA-

SINGER et al., 1995), incluindo a

identificação, modificação, quantificação

e localização das proteínas

(ZHANG et al., 2013). A proteômica

se vale da EM para caracterizar

as proteínas, através da obtenção

de suas sequências de aminoácidos

(AEBERSOLD & MANN, 2016).

O progresso da proteômica tem

sido impulsionado pelo desenvolvimento

de novas tecnologias de

separação de proteínas/peptídeos,

de espectrômetros de massa de

alta resolução e desempenho e

da análise de dados empregando

ferramentas de bioinformática. A

principal abordagem empregada

para a identificação e a caracterização

de proteínas por EM se

baseia na hidrólise enzimática por

peptidases específicas como, por

exemplo, tripsina, endoproteinase

Glu-C e quimiotripsina. Acoplada

à cromatografia liquida (CL-EM), a

EM se torna ainda mais poderosa

para a análise e a identificação de

misturas complexas de peptídeos,

como por exemplo, um hidrolisado

enzimático de uma grande proteína

como um Mab. A bioinformática

tem um papel essencial na identificação

dos peptídeos e na inferência

e quantificação das proteínas

(ZHANG et al., 2013).

Historicamente, o Brasil tem uma

ampla atuação na área de química

de proteínas e EM. Esta experiência

tornou, recentemente, o Brasil reconhecido

internacionalmente (PA-

DRÓN & DOMONT 2014). Este reconhecimento

foi evidenciado nas

duas edições especiais publicadas

nas revistas internacionais Proteomics

e Journal of Proteomics, que

reuniram artigos de laboratórios

brasileiros que trabalham com

técnicas estado-da-arte em diferentes

áreas (MARTINS-DE-SOUZA,

2012; NOGUEIRA et al., 2017). Os

laboratórios brasileiros são bem

equipados com espectrômetros de

massas híbridos, que apresentam

na sua configuração analisadores

do tipo Tempo-de-Voo (TOF), Orbitrap

e ICR. Estes instrumentos

têm medidas de massa com alta

acurácia, resolução e velocidade

de varredura, o que faz destes

instrumentos ideais para a análise

da sequência de cadeias leves e

pesadas de anticorpos (LADWIG et

al., 2017).

O estabelecimento de análises

multicomplexas, como as descritas

acima, para fomentar o desenvolvimento

de biofármacos do tipo

MAbs no Brasil, é imperativo para

o desenvolvimento dessa área no

Brasil; e para isso, é importante

avaliar a comunidade analítica brasileira

com relação à infraestrutura

laboratorial, expertise e experiência

no meio acadêmico. Este trabalho

teve a finalidade de desenvolver

um estudo multicêntrico (prospectivo),

envolvendo quatro diferentes

laboratórios acadêmicos brasileiros,

para confirmar a sequência

de aminoácidos dos domínios que

contêm as regiões hipervariáveis

das cadeias leve e pesada do

MAb bevacizumabe (Avastin®) de

acordo com a publicação de Presta

e colaboradores (PRESTA et al.,

1997). Estes domínios são fundamentais

para a determinação da

REVISTA ANALYTICA - ABR/MAI 19

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artigo 2

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Autores:

Eduardo de Souza Matos 1 ,

Ronaldo Mohana-Borges *1 ,

Vitor Marcel Faça*2, Fábio César Gozzo *3 ,

Wagner Fontes4, Carlos André O. Ricart 4 ,

Fábio César Sousa Nogueira 5 ,

Mário Sérgio Palma §6 ,

Marcelo Valle de Sousa *4 .

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REVISTA ANALYTICA - ABR/MAI 19

especificidade do anticorpo e serão

denominadas de agora em diante

como F(ab)-12 LC para a cadeia

leve e F(ab)-12 HC para a cadeia

pesada (PRESTA et al, 1997). Os

resultados entre os laboratórios

foram convergentes, mesmo desenvolvendo

estratégias independentes

e utilizando diferentes

espectrômetros de massa, peptidases

e ferramentas bioinformáticas.

Materiais e Métodos

Laboratórios

participantes do Estudo

Foram convidados quatro laboratórios

brasileiros para participar

desse estudo multicêntrico:

1- Laboratório 1: Centro de Espectrometria

de massas de Biomoléculas

(CEMBIO) da Universidade

Federal do Rio de Janeiro;

2- Laboratório 2: Laboratório

de Bioquímica e Química de Proteínas,

Departamento de Biologia

Celular, Instituto de Ciências Biológicas,

Universidade de Brasília,

Brasília, DF;

3- Laboratório 3: Instituto de

Química, Universidade de Campinas,

Campinas, SP;

4- Laboratório 4: Laboratório

de Proteômica do Câncer, Departamento

de Bioquímica e Imunologia,

Faculdade de Medicina de Ribeirão

Preto - USP.

Descrição das amostras

Três frascos do medicamento

Avastin 100 mg/4mL, de três

diferentes lotes (B7233B21,

B7234B07 e B7234B12), produzidos

pelo grupo Roche, foram adquiridos

no mercado diretamente

por cada laboratório. Para cada

lote de Avastin (princípio ativo bevacizumabe),

foram aliquotados 20

tubos contendo 100 µL e 40 tubos

contendo 50 µL da amostra. O procedimento

foi realizado em câmara

de segurança biológica estéril com

fluxo laminar (Classe 2 BSC). Os

lotes aliquotados foram estocados

em freezer a -80 °C.

Estratégias experimentais

adotada pelos laboratórios

Cada laboratório teve a

liberdade de escolher os métodos

e estratégias experimentais que

julgassem mais adequados para se

alcançar os objetivos pretendidos.

Três laboratórios verificaram

a pureza e integridade dos

lotes recebidos por eletroforese

em gel de poliacrilamida com dodecilsulfato

de sódio (SDS-PAGE)

sob condições não redutoras e

redutoras. O Laboratório 2 utilizou

espectrometria de massa do tipo

MALDI-TOF para tal fim. Sendo

verificada a integridade e pureza

dos três lotes, cada laboratório desenhou

e executou separadamente

o sequenciamento dos aminoácidos

dos lotes de bevacizumabe.

Os procedimentos adotados serão

descritos a seguir.

Laboratório 1

O protocolo de digestão e a

análise por CL-EM foram realizados

em dois momentos diferentes.

Alíquotas dos três lotes de bevacizumabe

foram diluídas utilizando-

-se água grau HPLC para atingir

a concentração de 2 µg/µL. Dois

volumes de 50 µL de cada lote do

bevacizumabe foram diluídos como

duas amostras distintas, sendo

uma dessas submetida a protocolo

com digestão por tripsina e a outra

submetida a protocolo de digestão

simultânea por tripsina (Promega) e

endoproteinase Glu-C (Sigma).

Foram adicionados 10 µL de

solução de bicarbonato de amônio

a 50 mM e de cloreto de cálcio a

1 mM às amostras destinadas à

digestão por tripsina e 10 µL de

solução de bicarbonato de amônio

a 50 mM às amostras destinadas

à digestão simultânea por tripsina

e endoproteínase Glu-C. Adicionaram-se

a todas as amostras 10 µL

de solução RapiGest SF a 0,2%,

homogeneizou-se e aqueceu-se

durante 15 minutos a 80 °C. Para

a redução de pontes de sulfeto e

alquilação dos radicais de cisteína,

adicionaram-se 2,5 µL de DTT a

100 mM às amostras, aquecendo-

-as durante 30 minutos a 60 °C.

Após isso, as amostras foram resfriadas

à temperatura ambiente.

Em seguida, adicionaram-se 2,5

µL de iodoacetamida 300 a mM,

deixando reagir em temperatura

ambiente durante 30 minutos ao

abrigo da luz.

Adicionaram-se 20 µL da solução

de enzima proteolítica (tripsina


ou tripsina + Glu-C) e homogeneizou-se,

deixando a digestão ocorrer

durante 15 horas a 37 °C. Em

seguida, adicionaram-se 10 µL de

solução de ácido trifluoroacético a

5%, incubando-se as amostras por

90 minutos a 37 °C para a precipitação

do RapiGest SF. Em seguida,

centrifugou-se a mesma a 14000

g durante 15 minutos a 4 °C. Os

sobrenadantes foram transferidos

para microtubos, sendo as amostras

secas por liofilização. Para a

análise por CL-EM, cada amostra

foi ressuspensa em 100 μL de uma

mistura de ácido fórmico a 0,1%

com acetonitrila a 3% em água

grau HPLC. As amostras foram

transferidas para frascos de 1,5

mL e acondicionadas a temperatura

de 2 a 8°C até sua injeção no

cromatógrafo líquido.

A análise das digestões em solução

foi realizada no sistema de

cromatografia líquida de ultra alta

eficiência (UHPLC) Nexera X2, do

fabricante Shimadzu. A coluna cromatográfica

utilizada foi a Acquity

UPLC CSH C18, 150 x 1 mm, 1,7

µm de tamanho de partícula, do

fabricante Waters. A temperatura

de forno na análise foi de 50 ºC. As

fases móveis A e B usadas foram

respectivamente solução de ácido

fórmico a 0,1% em água e solução

de ácido fórmico a 0,1% em acetonitrila.

A cromatografia foi acoplada ao

espectrômetro de massas espectrômetro

de massas modelo Maxis

Impact, configuração ESI-Q-TOF,

do fabricante Bruker. Foram utilizadas

duas estratégias de aquisição

para análise espectrométrica dos

peptídeos eluídos da corrida cromatográfica:

estratégia de aquisição

por DDA (seleção automática

de três íons de maior abundância)

e estratégia de aquisição guiada,

que realizou a seleção de íons de

peptídeos para análise sequencial

a partir de uma lista de m/z previamente

determinada, baseada

em m/z de peptídeos gerados pela

digestão por tripsina ou gerados

pela co-digestão por tripsina e

endoproteinase Glu-C. Todas as

aquisições realizadas em ambas as

estratégias foram configuradas na

polaridade positiva, com faixa de

m/z medida foi de 50 a 1500 nas

varreduras em MS e MS2.

As listas de picos referentes às

análises realizadas com os métodos

de abordagem guiada e por

DDA do mesmo dia foram agrupadas

para cada lote e para cada

tipo de digestão, constituindo uma

única lista de picos para submissão

em softwares. As listas geradas

foram analisadas no software

Biotools versão 3.2 SR4, da Bruker

Daltonics, utilizando-se duas abordagens.

A primeira abordagem foi

a comparação dos conjuntos de

espectros de íon precursor e íons

produtos respectivos, com perfil de

fragmentação esperado de peptídeos

gerados pela digestão in silico

das cadeias leve e pesada do bevacizumabe.

A segunda abordagem

foi a análise dos mesmos conjuntos

de espectros pelo algoritmo de

identificação proteômica Mascot,

versão 2.4, tendo como referência

a combinação de três bancos de

dados: i) banco de dados curado

de proteínas Swissprot (atualizado

no dia 29/06/2018), disponível

na internet (www.uniprot.org); ii)

banco de dados de contaminantes

proteicos (disponível no próprio

servidor Mascot) e iii) banco de dados

criado a partir das sequências

das cadeias leve e pesada do bevacizumabe

contida no DrugBank

(https://www.drugbank.ca/drugs/

DB00112).

Laboratório 2

Os lotes de Avastin® tinham entre

seus excipientes o detergente

polissorbato 20 (Tween 20), que

poderia diminuir a eficiência das

etapas posteriores de digestão

enzimática, separação de peptídeos

em coluna de fase reversa e

de análises por EM. Tween 20 foi

então removido por ultrafiltração

em Amicon Ultra 0,5 mL – Ultracel

30 k, seguindo recomendações do

fabricante). Análise por MALDI-TOF

MS confirmou a redução do conteúdo

de Tween 20 nas amostras, assim

como a pureza e a integridade

estrutural da proteína.

As amostras foram então submetidas

a etapas de redução das

pontes dissulfeto com DTT e posterior

alquilação das cadeias laterais

de resíduos de cisteína com iodacetamida.

As amostras reduzidas

e alquiladas foram submetidas a

digestão com 3 diferentes proteases:

tripsina (Promega), Lys-C

(Promega) e quimotripsina (Sigma-

-Aldrich). Paralelamente, amostras

reduzidas e alquiladas foram submetidas

a cromatografia em fase

reversa (C4) para separação das

cadeias leve e pesada. Foram obtidas

duas frações principais que

foram analisadas por MALDI-TOF

EM. Verificou-se assim, que a cromatografia

não separou totalmente

a cadeia leve da pesada, mas proporcionou

um enriquecimento da

cadeia leve no pico 1 e da cadeia

pesada no pico 2. A fração obtida

no pico 1 foi submetida a digestão

proteolítica com as três enzimas

anteriores e adicionalmente com

a enzima Glu-C (protease V8 de

Staphylococcus aureus, Promega).

A utilização do pico 1, após digestão

com as quatro diferentes proteases,

contribuiu para a obtenção

da sequência completa da proteína.

As amostras digeridas foram dessalinizadas

em microcolunas C18

antes da etapa seguinte de LC-MS/

MS. A eficácia e a reprodutibilidade

das digestões enzimáticas foram

verificadas e comprovadas por

MALDI-TOF EM antes da análise

por CL-EM.

Os digestos foram submetidos

a CL-EM usando cromatógrafo

(UHPLC) Dionex Ultimate

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Mário Sérgio Palma §6 ,

Marcelo Valle de Sousa *4 .

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REVISTA ANALYTICA - ABR/MAI 19

300 (Thermo Scientific) acoplado

a espectrômetro de massas LTQ

Orbitrap Elite (Thermo Scientific).

Foram utilizadas as técnicas de

fragmentação “collision induced

dissociation “(CID), “higher-energy

collisional dissociation” (HCD) e

“electron transfer dissociation”

(ETD) e a combinação entre HCD

e ETD com auxílio de software que

define o método a ser usado após a

ionização (“decision tree”). Os dados

de íons precursores (MS 1 ) e de

fragmentos (MS 2 ) foram gravados

em formato “.raw” para posterior

análise.

Os arquivos “.raw” contendo os

espectros das quatro modalidades

de fragmentação, de cada uma das

quatro digestões de cada amostra,

foram analisados de forma combinada

utilizando-se o software

Peaks versão 7.0. Foi realizado

sequenciamento de novo de todos

os peptídeos fragmentados e

seu alinhamento com a sequência

esperada para cada uma das

cadeias. Foram selecionados os

peptídeos com score de sequenciamento

global de, no mínimo,

50, parâmetro recomendado pelo

software. As sequências obtidas

foram comparadas com a sequência

esperada para o bevacizumabe.

Ao final de todos os procedimentos

experimentais descritos, foi

possível determinar, para os três

lotes analisados, 100% da sequência

de aminoácidos do anticorpo.

Para tanto, foi necessário analisar

independentemente, para cada

amostra, os digestos com tripsina,

quimotripsina e com protease

Lys-C das amostras reduzidas e

alquiladas contendo a mistura das

cadeias leve e pesada. Como ainda

restavam alguns resíduos de aminoácidos

não sequenciados, utilizou-se

dados de sequência do pico

1 conforme descrito anteriormente.

Laboratório 3

As digestões em solução com

ambas as enzimas (tripsina e quimotripsina)

foram conduzidas em

tampão bicarbonato de amônio 50

mM, pH = 8, a 37 ºC por 16h. Foi

mantida constante, em 50:1 (m/m),

a proporção amostra:protease,

sendo aliquotadas 1 mg de amostra

para digestões com tripsina e

quimiotripsina. Após o período de

digestão, as amostras foram dessalinizadas

utilizando-se cartuchos

de extração em fase sólida (SPE)

Oasis HLB (Waters Co.), cujo procedimento

consistiu na lavagem

das amostras com 1 mL de água

contendo 0,1% (V/V) de ácido

fórmico por 4 vezes e posterior

eluição com 2 mL de uma mistura

água:acetonitrila 20:80 (v/v). A

amostra foi concentrada por evaporação

rotativa a vácuo até um

volume final de 50 µL.

Para a análise por EM, 2 µg de

cada amostra foram injetados no

LC EasyLC 1200 acoplado a um

espectrômetro LTQ Orbitrap Velos

(Thermo Scientific). O método cromatográfico

teve duração de 90

minutos, com aquisição de dados

de MS1 no orbitrap e MS2 no ion

trap. Os dados foram adquiridos

em modo DDA (data dependent

analysis) selecionando os top 10

precursores com cargas 2+, 3+ e

4+. Alternativamente, as amostras

foram analisadas em um espectrômetro

de massas Xevo Q-Tof G2X

acoplado a um cromatógrafo Nano-

Acquity com um método cromatográfico

de 90 minutos de duração.

Os dados foram adquirido em modo

DDA (data dependent analysis) selecionando

os top 5 precursores

com cargas 2+, 3+ e 4+.

O processamento das amostras

foi feito utilizando-se o software

Mascot 2.6 (Matrix Science) utilizando

os bancos de dados de E.

coli acrescida das sequências do

anticorpo além de sequências de

contaminantes comuns. Os parâmetros

de busca foram a enzima

utilizada para cada amostra (semi-

-específica), com o número de sítios

de clivagem não-digeridos de

3 para a tripsina e 5 para a quimiotripsina.

Foi adicionada a oxidação

de metionina como uma modificação

variável e carbamidometilcisteína

como modificação fixa. Os erros

utilizados foram de 100 ppm para

MS e 0,8 Da para MS2 para os dados

do Orbitrap Velos e 50 ppm tanto

para o precursor quanto para os

fragmentos. Os arquivos de dados

utilizados na busca foram arquivos

MGF gerados pelo software Mascot

Distiller 2.6 (Matrix Science). Para

as amostras digeridas com tripsina,

foram realizadas buscas com os

seguintes parâmetros: 25 ppm de

erro para o precursor, 50 ppm de

erro para os fragmentos, nenhum


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REVISTA ANALYTICA - ABR/MAI 19

sítio de clivagem perdido, carbamidometilcisteína

como modificação

fixa e oxidação de metionina como

modificação variável. Os dados

foram processados para um intervalo

de significância de p


ácidos contido nas cadeias leves

e pesadas do anticorpo bevacizumabe.

Ambiguidades na verificação

da sequência foram resolvidas utilizando-se

espectros redundantes

dos peptídeos.

Resultados

Laboratório 1

Perfil cromatográfico dos peptídeos

obtidos após hidrólise enzimática

do bevacizumabe

Após uma digestão teórica in silico

das sequências F(ab)-12 LC e

F(ab)-12 HC por tripsina verificou-

-se que alguns peptídeos poderiam

ser de difícil caracterização por

apresentarem massa molecular

muito próxima a 3kDa. Desta forma,

decidiu-se também realizar a

co-digestão do anticorpo com duas

enzimas, a tripsina e endoproteínase

Glu-C. A co-digestão gerou peptídeos

menores que os obtidos por

digestão única com tripsina. A separação

cromatográfica em coluna

de fase reversa C18 dos peptídeos

obtidos da hidrólise enzimática dos

3 lotes do bevacizumabe por digestão

com tripsina ou pela co-digestão

tripsina + endoproteinase



Glu-C (resultados não mostrados),

geraram um perfil cromatográfico

muito similar, demonstrando alta

reprodutibilidade do método de separação

entre os diferentes lotes.

Um segundo processo de hidrólise,

separação e análise por EM foi necessário

porque alguns pequenos

peptídeos obtidos durante a hidrólise

enzimática não foram selecionados

para sequenciamento MS2

pela estratégia automática (DDA),

sendo necessário o uso também da

estratégia guiada (vide abaixo).

Verificação da presença das sequências

F(ab)-12 LC e F(ab)-12

HC, nas amostras do bevacizumabe

À medida que os peptídeos foram

eluídos da coluna cromatográfica,

eles foram injetados imediatamente

no espectrômetro de massas configuração

ESI-q-TOF, que mediu a

sua razão massa/carga (m/z). Além

disso, o equipamento foi ajustado

para realizar o sequenciamento

MS 2 de forma automática dos peptídeos

mais abundantes DDA ou de

forma guiada dos peptídeos previamente

selecionados. Os cromatogramas

e os espectros MS e MS 2

de cada amostra de bevacizumabe

foram compilados e processados

pelo software Biotools. A primeira

análise realizada comparou as sequências

de aminoácidos obtidas

experimentalmente a partir deste

programa com as sequências teóricas

do bevacizumabe depositada

no DrugBank.

As tabelas 1 e 2 (representativa

para os três lotes analisados)

compilam as sequências hipervariáveis

de aminoácidos identificados

em cada uma destas análises, i.e.,

os primeiros 123 resíduos de aminoácidos

da cadeia pesada e os

primeiros 108 resíduos da cadeia

leve .

Identificação do bevacizumabe a

partir de busca de larga escala em

bancos de dados usando algoritmo

Mascot

Uma alternativa ao protocolo

experimental usado acima para

a confirmação das sequências

F(ab)-12 LC e F(ab)-12 HC foi feita

utilizando-se o software Mascot.

Assim, o objetivo da análise por

este software foi verificar se as

sequências dos peptídeos obtidos

por EM neste projeto iriam identificar

o anticorpo bevacizumabe


Tabela 1: Dados de caracterização da sequência primária da sequência C com análise LC-MS dos peptídeos gerados por hidrólise do lote

B7234B07 de Avastin.

Tabela 1: Dados de caracterização da sequência primária da sequência C com análise LC-MS dos peptídeos gerados por hidrólise do lote

B7234B07 de Avastin.

No. de

Tabela 1: Dados de caracterização da sequência primária da sequência F(ab)-12 HC com análise LC-MS dos

aminoácidos

Enzima Data de

peptídeos gerados por No. de hidrólise do lote B7234B07 de Avastin.

utilizada análise identificados na

Sequência identificada

região de

aminoácidos

Enzima Data de

interesse

identificados na

Sequência identificada

utilizada Tripsina 06/06/2018 análise No. 118/123

região de aminoácidos EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTNYGMNWVR_____GLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPHYYGSSHWYFDVWGQGTLVTVSS

de

Enzima

interesse

Sequência identificada

Tripsina + Glu-C Data 06/06/2018 de identificados 118/123 na região EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTNYGMNWVR_____GLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPHYYGSSHWYFDVWGQGTLVTVSS

utilizada Tripsina 06/06/2018 análise de interesse 118/123 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTNYGMNWVR_____GLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPHYYGSSHWYFDVWGQGTLVTVSS

Tripsina 27/06/2018 123/123 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTNYGMNWVRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPHYYGSSHWYFDVWGQGTLVTVSS

Tripsina + Glu-C 06/06/2018 118/123 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTNYGMNWVR_____GLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPHYYGSSHWYFDVWGQGTLVTVSS

Tripsina + Glu-C 27/06/2018 123/123 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTNYGMNWVRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPHYYGSSHWYFDVWGQGTLVTVSS

Tripsina 27/06/2018 123/123 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTNYGMNWVRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPHYYGSSHWYFDVWGQGTLVTVSS

Compilação de todas as

123/123 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTNYGMNWVRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPHYYGSSHWYFDVWGQGTLVTVSS

Tripsina + Glu-C

análises

27/06/2018 123/123 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTNYGMNWVRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPHYYGSSHWYFDVWGQGTLVTVSS

Sequência F(ab)-12 HC

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTNYGMNWVRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPHYYGSSHWYFDVWGQGTLVTVSS

Compilação de todas as

123/123 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTNYGMNWVRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPHYYGSSHWYFDVWGQGTLVTVSS

análises

Sequência F(ab)-12 HC

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTNYGMNWVRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPHYYGSSHWYFDVWGQGTLVTVSS


Tabela 2: Dados de caracterização da sequência primária da sequência F(ab)-12 LC com análise LC-MS dos peptídeos gerados por hidrólise do lote

Tabela B7234B07

Tabela 2: Dados de Avastin.

2: de Dados caracterização de caracterização da sequência primária da da sequência F(ab)-12 primária LC com da análise sequência LC-MS dos F(ab)-12 peptídeos gerados LC com por análise hidrólise do LC-MS lote dos

B7234B07 peptídeos Avastin. gerados por hidrólise do lote B7234B07 de Avastin.

No. de

aminoácidos

Enzima Data de

identificados na

Sequência identificada

utilizada análise No. No. de de aminoácidos

região de

Enzima Data de identificados aminoácidos

Enzima Data de

interesse na região

utilizada

identificados na

Sequência identificada

utilizada análise análise

Tripsina 06/06/2018 interesse

Sequência identificada

66/108 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKVLIYFTSSLHSGVPSR__________________________________________VEIKR

região de

Tripsina + Glu-C 06/06/2018

interesse

105/108 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGK___VLIYFTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTVPWTFGQGTKVEIKR

Tripsina 06/06/2018 66/108 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKVLIYFTSSLHSGVPSR__________________________________________VEIKR

Tripsina 27/06/2018 63/108 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGK___VLIYFTSSLHSGVPSR__________________________________________VEIKR

Tripsina + Glu-C 06/06/2018 105/108 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGK___VLIYFTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTVPWTFGQGTKVEIKR

Tripsina + Glu-C 27/06/2018 108/108 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKVLIYFTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTVPWTFGQGTKVEIKR

Tripsina 27/06/2018 63/108 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGK___VLIYFTSSLHSGVPSR__________________________________________VEIKR

Compilação de todas as análises 108/108 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKVLIYFTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTVPWTFGQGTKVEIKR

Tripsina + Glu-C 27/06/2018 108/108

Sequência F(ab)-12 LC

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKVLIYFTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTVPWTFGQGTKVEIKR

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKVLIYFTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTVPWTFGQGTKVEIKR

Compilação de todas as análises 108/108 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKVLIYFTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTVPWTFGQGTKVEIKR


Sequência F(ab)-12 LC

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKVLIYFTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTVPWTFGQGTKVEIKR

REVISTA ANALYTICA - ABR/MAI 19

29


artigo 2

Imagem Ilustrativa

Autores:

Eduardo de Souza Matos 1 ,

Ronaldo Mohana-Borges *1 ,

Vitor Marcel Faça*2, Fábio César Gozzo *3 ,

Wagner Fontes4, Carlos André O. Ricart 4 ,

Fábio César Sousa Nogueira 5 ,

Mário Sérgio Palma §6 ,

Marcelo Valle de Sousa *4 .

Tabela 3 – Compilação dos resultados de identificação do bevacizumabe obtida pelo software Mascot para todos os lotes de Avastin

Lote

Data de

análise

Enzima Proteínas identificadas Colocação Score

No. de

peptídeos

identificados

B7234B07 06/06/2018 Tripsina

Bev_HC-Bevacizumab_heavy_chain

Bev_LC-Bevacizumab_light_chain

1

2

1578

707

29

11


B7234B07 06/06/2018

Tripsina

+ Glu-C

B7234B07 27/06/2018 Tripsina

B7234B07 27/06/2018

Tripsina

+ Glu-C

Bev_HC-Bevacizumab_heavy_chain

Bev_LC-Bevacizumab_light_chain

Immunoglobulin heavy constant gamma 4 OS=Homo sapiens OX=9606 GN=IGHG4 PE=1

SV=1

Immunoglobulin heavy variable 3-48 OS=Homo sapiens OX=9606 GN=IGHV3-48 PE=1 SV=2

Glutamyl endopeptidase OS=Staphylococcus aureus (strain MRSA252) OX=282458 GN=sspA

PE=3 SV=1

Sarcoplasmic calcium-binding protein (Fragment) OS=Chionoecetes opilio OX=41210 PE=1

SV=1

Bev_HC-Bevacizumab_heavy_chain

Bev_LC-Bevacizumab_light_chain

Immunoglobulin kappa light chain OS=Homo sapiens OX=9606 PE=1 SV=1

Sarcoplasmic calcium-binding protein (Fragment) OS=Chionoecetes opilio OX=41210 PE=1

SV=1

Bev_HC-Bevacizumab_heavy_chain

Bev_LC-Bevacizumab_light_chain

Immunoglobulin kappa light chain OS=Homo sapiens OX=9606 PE=1 SV=1

Girdin OS=Mus musculus OX=10090 GN=Ccdc88a PE=1 SV=2

1

2

3

4

5

6

1

2

3

4

1

2

3

4

1946

971

294

72

54

45

1447

782

498

59

1981

1225

641

52

44

17

10

2

3

1

27

13

8

1

48

24

13

2

dentro de um conjunto enorme de

outras centenas de milhares de sequências

de peptídeos. Para isto,

necessitou-se incluir no banco de

dados Swissprot tanto as sequências

de aminoácidos das cadeias

leve e pesada do bevacizumabe

quanto os peptídeos contaminantes

provenientes da auto-hidrólise

da tripsina e endoproteinase Glu-C.

Após a execução de busca com

o algoritmo Mascot, utilizando-se

o conjunto de espectro para cada

lote de bevacizumabe , obtido nas

duas análises, e tanto para a digestão

com tripsina quanto para a

co-digestão com tripsina e endoproteinase

Glu-C, verificou-se que

os resultados destas buscas foram

a identificação das cadeias leve e

pesada do bevacizumabe , com a

obtenção de scores elevados (p <

0,01) em todas condições analisadas.

Os resultados de identificação

de proteínas obtidas a partir da

análise do Mascot foram compilados

na tabela 3, onde os scores de

proteínas e os números de peptídeos

encontrados na sequência do

bevacizumabe foram explicitados.

Os dados do conjunto de peptídeos

sequenciados com relevância

estatística para as cadeias leve e

pesada do bevacizumabe , nos três

lotes, foram todos compilados. Observou-se

que, para os três lotes, o

sequenciamento de peptídeos que

cobrem as sequências F(ab)-12 LC

e F(ab)-12 HC gerou score individual

superior ao limite mínimo significativo

calculado pelo software.

Os resultados experimentais

completos exigem um grande número

de páginas no formato de tabelas,

que não podem ser mostradas

no formato do presente manuscrito.

Por essa razão, esses dados

estão disponibilizados acessando

30

REVISTA ANALYTICA - ABR/MAI 19

Tabela 4 - Proteínas identificadas nos Lotes 1, 2 e 3 de Avastin® mostrando que houve cobertura (coverage) completa de sequência

das cadeias leve e pesada de Bevacizumabe para todos.

Lote Proteína Descrição -10lgP Cobertura (%) Peptídeos Massa média

1

2

3

1 Bevacizumabe, cadeia pesada 1048.59 100 528 49847

2 Bevacizumabe, cadeia leve 872.93 100 257 23451

1 Bevacizumabe, cadeia pesada 1056.35 100 513 49847

2 Bevacizumabe, cadeia leve 910.33 100 236 23451

1 Bevacizumabe, cadeia pesada 1064.82 100 459 49847

2 Bevacizumabe, cadeia leve 915.97 100 230 23451


o link: https://www.dropbox.com/

sh/1h1ybok5wqs5jid/AABEUa-

-uGFWNx7iqmKotezu7a?dl=0-- .

Laboratório 2

A tabela 4 (representativa para

os três lotes analisados) apresenta

os dados resultantes da análise

computacional gerados pelos

experimentos de LC-MS/MS para

os produtos de proteólise com as

enzimas tripsina, quimotripsina,

Lys-C e Glu-C (V8), mostrando que

100% das sequências das cadeias

leve e pesada de bevacizumabe

foram confirmadas. A título de

ilustração, a figura 1 (representativa

para os três lotes analisados)

mostra as sequências das cadeias

pesada e leve do princípio ativo do

Avastin®, indicando os peptídeos

sequenciados que proporcionaram

a cobertura de 100% da sequência

de aminoácidos do anticorpo

bevacizumabe. Dados similares

foram obtidos para os lotes 2 e 3

de Avastin®. Vale ressaltar que um

alto grau de redundância foi obtido

neste trabalho. Ou seja, os peptídeos

foram sequenciados muitas e

repetidas vezes e se sobrepuseram

exaustivamente à sequência de

aminoácidos do bevacizumabe.

Os resultados experimentais

completos exigem um grande número

de páginas no formato de

tabelas, que não podem ser mostradas

no formato do presente

manuscrito. Por essa razão, esses

dados estão disponibilizados acessando

o link: https://massive.ucsd.

edu/ProteoSAFe/dataset.jsp?task

=8a5ad7a21ac14139a474146f8

c4fe268. Para isso, deve-se utilizar

o login: LBQP_MAb, e a senha:

bevacizumabe.

Laboratório 3

A figura 2 (representativa para

os três lotes analisados) apresenta

os dados resultantes da análise

computacional gerados pelos

experimentos de LC-MS/MS para

os produtos de proteólise com as

enzimas tripsina, quimotripsina,

mostrando que 100% das sequências

das cadeias leve e pesada de

bevacizumabe foram confirmadas.

Os resultados experimentais

completos exigem um grande número

de páginas no formato de

tabelas, que não podem ser mostradas

no formato do presente

manuscrito. Por essa razão, esses

dados estão disponibilizados

acessando-se o link: http://dalton-

-server.iqm.unicamp.br/MSData/ .

Laboratório 4

A estratégia de sequenciamento

completo das regiões que contêm

as sequências F(ab)-12 LC e F(ab)-

12 HC baseou-se na produção de

peptídeos pelas enzimas tripsina

e quimotripsina, o que permite a

sobreposição por diferentes peptídeos

em regiões de ambiguidade

de sequência, devido às diferenças

de especificidade por aminoácidos

no ponto de clivagem. Ainda assim,

a análise de peptídeos específicos

produzidos pelas enzimas tripsina

e quimotripsina, não permitiu uma

cobertura completa da região de

interesse. Vários pontos da sequencia

não puderam ser comprovados

apenas pela sobreposição dos peptídeos

produzidos por ambas as enzimas.

Utilizando-se de ferramentas

de processamento dos dados

de EM mais poderosas, adotou-se

a estratégia de análise combinada

de peptídeos específicos e inespecíficos,

onde considera-se pontos

de clivagens em aminoácidos não

específicos ou perdas de pontos

de clivagens. Primeiramente ficou

claro que ambas as enzimas (tripsina

e quimotripsina), adquiridas

comercialmente em altos graus

de qualidade, não são totalmente

específicas, produzindo peptídeos

pela fragmentação da cadeia

em aminoácidos inespecíficos e a

incapacidade de clivagem em sítios

tidos como específicos. Esta

imperfeição enzimática, foi vista

neste estudo em particular como

importante e interessante para

o estabelecimento da sequência

completa da região de interesse,

visto que alguns desses peptídeos

permitiram completar posições na

sequência do bevacizumabe que

não haviam sido identificadas ou

ainda apresentavam-se ambíguas.

Este processo de clivagem inespecífica

é conhecido para as enzimas

proteolíticas, e dependem de vários

fatores, que incluem a sequência

da cadeia proteica e acessibilidade

às ligações químicas que serão

clivadas.

As sequências completas das

cadeias, bem como os peptídeos

utilizados para a confirmação da

estrutura primária do bevacizumabe

são apresentadas na figura 3

(representativa para os três lotes

analisados). Assim, a identificação

de peptídeos por estratégias de EM

combinada com métodos computacionais

de interpretação de espectros

de fragmentação permitiu

avaliar diferentes lotes do produto

comercial Avastin, através de um

processo simples e reprodutível, e

demostrar que princípio ativo do

produto comercial Avastin é uma

proteína única com sequência de

aminoácidos perfeitamente correspondente

ao anticorpo bevacizumabe

descrito na literatura (PRES-

TA et al., 1997).

Os resultados experimentais

completos exigem um grande

número de páginas no formato

de tabelas, que não podem

ser mostradas no formato do

presente manuscrito. Por essa

razão, esses dados estão disponibilizados

acessando o link:

http://143.107.199.97:8080. Para

isso, deve-se utilizar o login: conveniolicks@lpcfmrp.br,

e a senha:

DIQMTQSPSS.

REVISTA ANALYTICA - ABR/MAI 19

31


artigo 2

Imagem Ilustrativa

Autores:

Eduardo de Souza Matos 1 ,

Ronaldo Mohana-Borges *1 ,

Vitor Marcel Faça*2, Fábio César Gozzo *3 ,

Wagner Fontes4, Carlos André O. Ricart 4 ,

Fábio César Sousa Nogueira 5 ,

Mário Sérgio Palma §6 ,

Marcelo Valle de Sousa *4 .

Figura 1 - Cobertura de sequência das cadeias pesada e leve (representativa para o três lotes de Avastin®). Em azul, estão peptídeos sequenciados por espectrometria

de massa com “False Discovery Rate” (FDR) < 1 %. Em cinza, estão peptídeos sequenciados por espectrometria de massa com “False Discovery Rate” (FDR) > 1 %. Caixas

vermelhas correspondem a modificação (carbamidometilação) de cisteínas introduzidas durante o preparo da amostra para a separação das pontes dissulfeto. Caixas azuis

correspondem a oxidação de aminoácidos de ocorrência natural na amostra ou durante o preparo por exposição ao oxigênio atmosférico. Caixas amarelas correspondem a

deamidação de aminoácidos de ocorrência natural.

32

REVISTA ANALYTICA - ABR/MAI 19

Discussão

Com a finalidade de identificar

a sequência completa dos aminoácidos

correspondentes as sequências

F(ab)-12 LC e F(ab)-12 HC

do anticorpo monoclonal humanizado

bevacizumabe princípio ativo

do medicamento Avastin®, quatro

laboratórios brasileiros, reconhecidamente

proficientes na análise

de peptídeos e proteínas por EM,

desenvolveram estratégias independentes

para obter a sequência

de aminoácidos das cadeias leve e

pesada do bevacizumabe em três

diferentes lotes do produto comercial

Avastin®. Estas estratégias

compreendiam o uso de diferentes

espectrômetros de massas, métodos

de fracionamento das cadeias

do anticorpo (por exemplo, eletroforese

em gel de poliacrilamida com

SDS e agente redutor e cromatografia

líquida), precipitação de proteínas

com solvente orgânico, uso

de enzimas proteolíticas com distintos

sítios de clivagem, métodos

de fragmentação complementares

(CID, Collision Induced Dissociation;

HCD, Higher-energy Collisional

Dissociation; e ETD, Electron

Transfer Dissociation) e variadas

ferramentas bioinformáticas para

interpretação dos espectros de

fragmentação dos íons peptídicos e

inferência da sequência de aminoácidos

do anticorpo.

Todos os quatro laboratórios

alcançaram autonomamente

êxito na obtenção de 100% das

sequências F(ab)-12 LC e F(ab)-

12 HC do anticorpo monoclonal

humanizado bevacizumabe. Estes

resultados confirmam a sequência

publicada para os aminoácidos do

anticorpo (PRESTA et al., 1997),

em lotes diferentes e usando estratégias

variadas, além de demonstrar

a capacidade analítica

dos laboratórios brasileiros em

fornecer resultados robustos e de

qualidade mesmo em questões

complexas, como na caracterização

de biofármacos.

Conclusão

O Brasil dispõe de laboratórios

de proteômica muito bem

equipados e qualificados, para a

realização de análises multicomplexas

de química de proteínas,

aplicadas ao desenvolvimento e

controle de qualidade de anticorpos

monoclonais de uso terapêutico,

em apoio às indústrias farmacêuticas

interessadas.

Agradecimentos:

Nuno Manuel Domingues e Jaques

Ferreira de Souza, do Laboratório

de Bioquímica e Química

de Proteínas, Departamento de

Biologia Celular, Instituto de Ciências

Biológicas, Universidade de

Brasília, Brasília, DF.


Figura 2. Mapa de cobertura das cadeias leve e pesada do anticorpo monoclonal humanizado bevacizumabe, obtido por hidrolise com tripsina e quimotripsina e

sequenciamento feito por espectrometria de massas.

Figura 3. Sequência descrita para o anticorpo bevacizumabe. As sequências como F(ab)-12 LC e F(ab)-12 HC correspondente às cadeias leve (no painel superior) e

pesada (no painel inferior) têm suas destacadas em negrito (Presta e cols, 1997). Os segmentos, delimitados por bordas pretas representam os peptídeos observados

com as clivagens proteolíticas específicas produzidas pelas enzimas tripsina (segmentos verdes) e quimotripsina (segmentos vermelhos). Os segmentos azuis representam

os peptídeos identificados utilizando a estratégia de busca por clivagens enzimáticas inespecíficas. As linhas pretas verticais ao lado dos aminoácidos nas regiões variáveis

indicam a confirmação da sequência de aminoácidos pela análise do espectro de fragmentação dos peptídeos.

REVISTA ANALYTICA - ABR/MAI 19

33


artigo 2

Imagem Ilustrativa

Autores:

Eduardo de Souza Matos 1 ,

Ronaldo Mohana-Borges *1 ,

Vitor Marcel Faça*2, Fábio César Gozzo *3 ,

Wagner Fontes4, Carlos André O. Ricart 4 ,

Fábio César Sousa Nogueira 5 ,

Mário Sérgio Palma §6 ,

Marcelo Valle de Sousa *4 .

Agradecimentos:

O Laboratório 1 foi apoiado financeiramente pela

Licks Advogados Associados para a execução deste

projeto através de convênio de número 22075-2 firmado

com a Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ)

e a Fundação Universitária José Bonifácio (FUJB).

O Laboratório 2 foi apoiado financeiramente pela

Licks Advogados Associados para a execução deste

projeto através de contrato de número 054/2018 firmado

com a Universidade de Brasília e a Fundação de

Empreendimentos Científicos e Tecnológicos.

O Laboratório 3 foi apoiado financeiramente pela

Licks Advogados Associados para a execução deste

projeto através de convênio de número 588 firmado

com a UNICAMP e a Fundação de Desenvolvimento da

Unicamp – FUNCAMP.

O Laboratório 4 foi apoiado financeiramente pela

Licks Advogados Associados para a execução deste projeto

através de convênio de número 7056 firmado com

a Universidade de São Paulo e a Fundação Hemocentro

de Ribeirão Preto.

Complemento Normativo

Referências

bibliográficas

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specificity. Nature 256, 495–497 (1975).

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MARTINS-DE-SOUZA, D. Brazil: The Country of Proteomics. PROTEOMICS 12 (17): 2599–2600,

2012. https://doi.org/10.1002/pmic.201270114.

NOGUEIRA, F.C.S.; JUNQUEIRA, M.; DOMONT, G.B. Editorial: Special Issue on Brazilian Proteomics.

Journal of Proteomics, Brazilian Proteomics, 151 (January): 1, 2017. https://doi.

org/10.1016/j.jprot.2016.11.015.

PRESTA, L.G.; CHEN, H.; O’CONNOR, S.J.; CHISHOLM, V.; MENG, Y.G.; KRUMMEN, L.; WINKLER,

M.; FERRARA, N. Humanization of an anti-vascular endothelial growth factor monoclonal antibody

for the therapy of solid tumors and other disorders. Cancer Res. 57(20): 4593-4599, 1997.

Referente ao artigo: 2

34

REVISTA ANALYTICA - ABR/MAI 19

artigo 2

Disponibilizado por Analytica em parceria com

Arena Técnica

Sequenciamento das regiões

F(ab)-12 LC e F(ab)-12

HC do anticorpo monoclonal

humanizado bevacizumabe: um

estudo multicêntrico

ISO 21572

Foodstuffs -- Molecular biomarker analysis -- Protein-based methods

Norma publicada em: 02/2013. / Status: Vigente.

Classificação 1: Métodos gerais de testes e análises para produtos alimentícios.

Classificação 2: Norma recomendada.

Artigo: Sequenciamento das regiões F(ab)-12 LC e F(ab)-12 HC do anticorpo monoclonal

humanizado bevacizumabe: um estudo multicêntrico.

Entidade: ISO.

País de procedência/Região: Suiça.

Resumo: ISO 21572:2013 provides general guidelines and performance criteria for methods

for the detection and/or quantification of specific proteins or protein(s) of interest [POI(s)] in

a specified matrix

https://www.iso.org/standard/51005.html

DIN 51002-1

Inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS) - Part 1: Principles

and definitions

Norma publicada em: 11/2004. / Status: Vigente. Classificação 1: Norma recomendada.

Artigo: Sequenciamento das regiões F(ab)-12 LC e F(ab)-12 HC do anticorpo monoclonal

humanizado bevacizumabe: um estudo multicêntrico.

Entidade: DIN. País de procedência/Região: Alemanha.

https://www.beuth.de/en/standard/din-51002-1/64088589

Safety & Risk Strategy report é um relatório reservado produzido pela Arena Técnica conforme acordo com a Editora.

Os resumos aqui expostos foram retirados da internet dos sites das entidades respectivas, portanto, deverão ser consultadas em caso de

publicação em sua íntegra por estarem protegidos por copyright.


REVISTA ANALYTICA - ABR/MAI 19

35


Matéria de capa

Matéria de capa

VANTAGENS DO MÉTODO RÁPIDO

NA MICROBIOLOGIA

Uma tecnologia criada originalmente para detectar o crescimento

Uma de tecnologia microrganismos criada originalmente em amostras para de detectar sangue o está crescimento ganhando

de microrganismos terreno no Brasil, porém em amostras com outra de finalidade: sangue reduzir está o ganhando tempo de

terreno quarentena no Brasil, no porém controle com de outra qualidade finalidade: de produtos reduzir farmacêuticos o tempo de

quarentena estéreis. no controle de qualidade de produtos farmacêuticos

estéreis. A utilização desse sistema, embora ainda seja considerado um

A utilização método desse alternativo*, sistema, está embora atraindo ainda a atenção seja dos considerado farmacêuticos um

método visto alternativo*, que, ao automatizar está atraindo o processo a atenção manual e dos retirar farmacêuticos a interferência

visto humana que, ao automatizar de leitura dos o testes, processo praticamente manual e retirar diminui a pela interferência metade a

humana quarentena de leitura para dos liberação testes, de praticamente lotes de seus diminui produtos. pela Com metade isso, as a

quarentena

companhias

para liberação

ganham eficiência

de lotes

em

de seus

seus trâmites

produtos.

logísticos.

Com isso, as

companhias No Brasil, ganham a Anvisa eficiência exige validação em seus do trâmites método rápido logísticos. no controle

de qualidade de cada produto, assim como em outros países.

No Brasil, a Anvisa exige validação do método rápido no controle

Porém, em mercados desenvolvidos, como os EUA e Europa, o

de qualidade

método rápido

de cada

já é usado

produto,

a mais

assim

tempo,

como

sendo

em

habituais

outros países.

e mais

Porém, frequentes em mercados essas validações desenvolvidos, para o uso. como os EUA e Europa, o

método rápido já é usado a mais tempo, sendo habituais e mais

Além da rapidez, os projetos já avaliados e autorizados pela

frequentes

ANVISA,

essas

demonstraram

validações

dados

para

estatísticos

o uso.

que comprovam ainda,

Além a superioridade rapidez, dos projetos métodos já alternativos, avaliados em e limite autorizados de detecção, pela

ANVISA, em relação demonstraram ao sistema dados de estatísticos cultura manual. que comprovam O reflexo disso ainda, é o

a superioridade aumento de dos segurança métodos para alternativos, consumidores em limite e pacientes. de detecção,

em relação “Os métodos ao sistema tradicionais de cultura são baratos manual. e bem O reflexo conhecidos, disso é mas o

aumento consomem de segurança muito tempo para os e consumidores têm detecção e limitada. pacientes. Por outro

“Os métodos lado, estão tradicionais disponíveis são diversas baratos tecnologias e bem conhecidos, alternativas, mas que

consomem

são rápidas

muito

e têm

tempo

maior

e

poder

têm detecção detecção.

limitada.

Como

Por

estatístico,

outro

tive a oportunidade de acompanhar a performance de algumas

lado, estão disponíveis diversas tecnologias alternativas, que

metodologias alternativas versus a metodologia tradicional.

são rápidas e têm maior poder de detecção. Como estatístico,

Principalmente em níveis baixos de contaminação, a performance

tive a

dos

oportunidade

métodos alternativos

de acompanhar

é bem melhor

a performance

que a performance

de algumas

dos

metodologias métodos tradicionais”, alternativas disse versus o estatístico a metodologia Dorival Leão tradicional. proprietário

Principalmente da Estatcamp, em uma níveis empresa baixos de consultoria contaminação, que suporta a performance projetos

dos métodos de validação alternativos nesta área. é bem melhor que a performance dos

métodos Uma tradicionais”, das companhias disse a o se estatístico beneficiar Dorival do método Leão automatizado proprietário

da Estatcamp, produz soluções uma empresa parenterais de e consultoria atende hospitais que suporta e farmácias projetos em

de validação todo território nesta nacional. área. Pioneira em validar e utilizar o método

Uma das companhias a se beneficiar do método automatizado

produz soluções parenterais e atende hospitais e farmácias em

todo território nacional. Pioneira em validar e utilizar o método

36

alternativo, libera seus produtos com registros aprovados pela

alternativo, ANVISA desde libera 2016. seus “Inicialmente, produtos com optamos registros por aprovados validar um pela

ANVISA método alternativo desde 2016. pela “Inicialmente, necessidade de optamos continuar por liberando validar um

método nossos produtos alternativo em pela um prazo necessidade de 7 dias. de Após continuar a publicação liberando

nossos da RDC- produtos 17, em em 2010, um obrigando prazo de a 7 extensão dias. Após do a prazo publicação de

da testes RDC- microbiológicos 17, em 2010, para obrigando 14 dias, enfrentamos a extensão um do desafio prazo de

testes logístico, microbiológicos de armazenagem para e prazos 14 dias, de entrega, enfrentamos que nos um forçou desafio

logístico, a buscar alternativas de armazenagem que aumentassem e prazos de a velocidade entrega, que dos ensaios nos forçou

a microbiológicos. buscar alternativas que aumentassem a velocidade dos ensaios

microbiológicos.

Consultamos quais eram as tecnologias rápidas disponíveis,

Consultamos

e optamos por

quais

iniciar

eram

a validação

as tecnologias

com o sistema

rápidas

baseado

disponíveis,

em

cultivo. Para nossa surpresa, após finalizada a validação, ao

e optamos por iniciar a validação com o sistema baseado em

analisar os dados estatísticos, além do ganho de velocidade em

cultivo. Para nossa surpresa, após finalizada a validação, ao

nosso ensaio, houve expressivo ganho de precisão, comparado

analisar

ao método

os dados

anterior,

estatísticos,

tradicionalmente

além do

utilizado

ganho de

no

velocidade

mercado

em

nosso farmacêutico. ensaio, Visto houve a eficiência expressivo deste ganho novo de método, precisão, e o comparado rápido

ao retorno método de investimento anterior, do tradicionalmente projeto, prosseguimos utilizado para no registrar mercado

farmacêutico. nossos produtos Visto com a sua eficiência utilização”, deste aponta novo os método, líderes técnicos e o rápido

retorno do projeto. de investimento do projeto, prosseguimos para registrar

nossos A gerente produtos de qualidade, com sua responsável utilização”, pelo aponta projeto os líderes se orgulha técnicos

do em projeto. ter assumido este desafio e poder ter contribuído com sua

A empresa gerente para de esse qualidade, processo responsável de melhoria, e pelo ainda projeto acrescenta se que orgulha

em a escolha ter assumido pelo método este foi desafio sustentada e poder pela facilidade ter contribuído de operacao com sua

empresa do sistema para e pela esse analise processo de payback de melhoria, do projeto, e ainda visto acrescenta que o custo que

a total escolha do investimento pelo método gerou foi um sustentada balanco significantemente pela facilidade de positivo. operacao

Com um sistema optico ultrassensível e algoritmos otimizados

do sistema e pela analise de payback do projeto, visto que o custo

para alertar qualquer presenca de microrganismos de forma

total do investimento gerou um balanco significantemente positivo.

rapida e definitiva, o sistema proporcionou ao setor de qualidade

Com um sistema optico ultrassensível e algoritmos otimizados

atuar ativamente, na realidade e na dinâmica de atendimento do

para

mercado,

alertar

contribuindo

qualquer

para

presenca

linearizar

de

a distribuição

microrganismos

de produtos,

de forma

rapida resultando e definitiva, em ganho o de sistema eficiencia proporcionou operacional. ao setor de qualidade

atuar ativamente, na realidade e na dinâmica de atendimento do

*Metodo Alternativo = Metodo Rápido

mercado, contribuindo para linearizar a distribuição de produtos,

resultando em ganho de eficiencia operacional.

Tiago Simões, Ph.D.

*Metodo Alternativo = Metodo Rápido Sales Execuive BD Life Science

Tiago Simões, Ph.D.

Sales Execuive BD Life Science


SOLUÇÃO SOLUÇÃO BD BD BACTEC BD BACTEC FX FX FX PARA PARA TESTE TESTE DE DE ESTERILIDADE DE ESTERILIDADE AUTOMATIZADO.

AUTOMATIZADO.

Proporciona Proporciona um um ambiente um ambiente favorável favorável de de crescimento de crescimento para para uma uma para comunidade uma comunidade microbiana microbiana que que rapidamente que rapidamente detecta sua sua presença detecta sua presença

através através de de um um de sistema um sistema sensível sensível à à variação à variação do do sinal sinal de do de luz sinal luz e, e, de por por luz meio meio e, de por de alarme meio de sonoro alarme e e indicadores sonoro e luminosos, indicadores alerta alerta luminosos, alerta

prontamente prontamente o o usuário o usuário a a detecção a detecção uma uma cultura de uma positiva. cultura positiva.

COMO COMO O O BD BD O BACTEC BD BACTEC FX FX IMPACTA FX IMPACTA POSITIVAMENTE POSITIVAMENTE A A SUA ROTINA?

A SUA ROTINA?

11

Promove redução significativa do do tempo de de preparo de de meios e e ensaio;

1 Promove redução significativa do tempo de preparo de meios e ensaio;

22

Procedimento simples, com com rastreabilidade das das ações passo a a passo, e e resultados definitivos, independentes de de análises

posteriores; 2 Procedimento simples, com rastreabilidade das ações passo a passo, e resultados definitivos, independentes de análises

posteriores;

33

Detecta em em até até 5h 5h e e libera libera em em até até 55 dias, dias, reduzindo período de de quarentena em em inventário.

3 Detecta em até 5h e libera em até 5 dias, reduzindo período de quarentena em inventário.

44

Ensaio robusto em em rotina, sem sem interferentes de de método, não não havendo necessidade de de materiais específicos ou ou cuidado em em

monitoramento 4

Ensaio robusto ambiental em intensivo. rotina, sem interferentes de método, não havendo necessidade de materiais específicos ou cuidado em

monitoramento ambiental intensivo.

CARACTERÍSTICAS & BENEFÍCIOS DIRETOS

CARACTERÍSTICAS & BENEFÍCIOS DIRETOS

Tecnologia de de

fluorescência

Tecnologia de

Sistema

fluorescência

automatizado

Sistema

Qualitativo

automatizado

automatizado

Qualitativo

High High Throughput

automatizado

(200 ensaios simultâneos)

High Throughput

Bactérias, (200 ensaios

fungos

simultâneos)

e e leveduras

Bactérias, fungos

e leveduras

Precisão de de 1UFC

nos nos ensaios

Precisão de 1UFC

Praticidade

nos ensaios

operacional

Praticidade

Segurança na operacional

liberação de de produtos

Segurança na

Rapidez na na liberação validação

de produtos

e e implementação

Rapidez na validação

Monitoramento e implementação

para para

controle efetivo

Monitoramento para

controle efetivo

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37


38

REVISTA ANALYTICA - ABR/MAI 19


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A LAS do Brasil, buscando melhor atender seus clientes, vem aprimorando

cada vez mais a prestação de serviços com entregas de

produtos analíticos e prazos de importação recorde, utilizando de

processos novos e inteligentes.

Com um portfólio completo de produtos e serviços qualificados,

procura dar suporte e entender as peculiaridades de seus clientes

em todo o processo de compra. A LAS do Brasil possui todos os

requisitos legais para atender em todos os aspectos a legislação de

importação e entregar seus produtos de forma ágil e segura.

Toda a documentação de funcionamento da LAS do Brasil está

disponível no site: http://www.lasdobrasil.com.br/downloads.

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aos requisitos legais de seu

fornecedor (licenças e alvarás), frente

à vigilância sanitária local, ANVISA

(AFE), Autorização Especial (AE) para

substâncias normais e sujeitas a controle

especial pela Portaria 344/98, licença

ambiental, da Prefeitura, Bombeiro,

CRF, entre outros.

Consolidação de remessas.

Empresa totalmente licenciada.

O cliente garante que o processo de importação

estará em conformidade com as normas brasileiras.

Decisões estratégicas em menor tempo.

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farmacêuticas brasileiras.

Emissão de faturas customizadas de acordo com

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Despacho mais rápido de bens com Alfândega

no Brasil devido a execução do processo de

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farmacêutico, clínico, químico e alimentos.

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lançado pelo IRS, sem limites de restrições

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39

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REVISTA ANALYTICA - ABR/MAI 19


Tecnologia inovadora que utiliza

Água Ultrapura

Destaque para atuação da água ultrapura

O MasSpec Pen® é uma espécie de “caneta” que analisa os

tecidos em 10 segundos e dá um diagnóstico com 96% de

precisão, de acordo com o estudo desenvolvido pelo Instituto de

Química da Universidade do Texas.

Esse dispositivo de ionização portátil e descartável libera uma

pequena gota de água ultrapura sobre o tecido com suspeita de

câncer. O conteúdo molecular é analisado por um espectrômetro

de massas conectado à “caneta” para determinar se o perfil

biomolecular é correspondente ao tecido canceroso.

Utilizando essa tecnologia, médicos podem saber em tempo real,

como eliminar todo o rastro do câncer em uma operação. Explica

Lívia Schiavianato Eberlin, Professora de Química na Universidade

do Texas e diretora do estudo.

A detecção do câncer com uma gota de água ultrapura ressalta

o avanço da tecnologia de precisão e tem um papel crucial no

desenvolvimento de testes em diagnósticos clínicos.

Informe de Mercado

Atrelando a utilização da água ultrapura como tecnologias

cada vez mais rápidas e precisas, as indústrias farmacêuticas

também se beneficiam com o uso dessa ciência.

Todo tipo de produto, principalmente vinculado ao consumo

humano como medicamentos demanda muita pesquisa. A LAS

do Brasil pensando em atender esse ritmo de desenvolvimento

dos laboratórios industriais, traz ao mercado, purificadores e

ultrapurificadores de alta qualidade.

A indústria farmacêutica aumentou significativamente sua

produção ao longo dos anos utilizando equipamentos

altamente sensíveis de HPLC (Cromatografia Líquida de Alta

Eficiência) e como consequência ao aumento do número

de análises. A demanda de água ultrapura se extende para

abastecer esses equipamentos. Portanto, a água ultrapura é

o reagente com melhor custo benefício comparada a outros

como acetonitrila ou metanol.

40

REVISTA ANALYTICA - ABR/MAI 19

Conheça a linha de purificadores de água

THERMO FISHER.

Uma linha completa de purificadores de água para o seu

laboratório. Água tipo I e II que abrangem inúmeras aplicações

laboratoriais.

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REVISTA ANALYTICA - ABR/MAI 19

41


Espectrometria de Massa

Os isótopos e a espectrometria de massas

Por Oscar Vega Bustillos*

42

REVISTA ANALYTICA - ABR/MAI 19

Muitos elementos químicos coexistem

na natureza com diferentes

massas denominadas isótopos. O

termo isótopo é usado para descrever

átomos de um mesmo elemento,

isto é com mesmo número de

prótons, porém pode conter número

variado de nêutrons. A palavra isótopo

provem do grego, “iso” significa

“igual” e topos significa “lugar”,

assim os isótopos de um único elemento

ocupam a mesma posição na

tabela periódica. A doutora escocesa

Margaret Todd sugeriu o nome

isótopo em 1913, a pedido do rádio

químico inglês Frederick Soddy que

ganhou o prêmio Nobel de Química

em 1921.

Os isótopos podem ser radiativos

ou não radiativos. Os isótopos não

radiativos são chamados de isótopos

estáveis. Os isótopos radiativos

são isótopos que sofrem decaimento

radioativo espontaneamente e são

capazes de emitir algum tipo de radiação.

Os isótopos radiativos transformam-se

em outros elementos

químicos tal como explicou F. Soddy

na transformação do U-238 para Pb-

206, que passa por várias etapas de

decaimento, emitindo radiação alfa

e beta. Cada etapa do decaimento

acontece em um tempo especifico

denominada meia-vida equivalente a

um relógio natural. Este fenômeno é

usado para datação de eventos naturais.

Graças aos estudos da datação

por radioisótopos, sabemos que

o planeta Terra foi formado há 4,2

bilhões de anos, que os dinossauros

desapareceram da face da Terra há

65 milhões de anos e que existem pirâmides

do Egito com idade de 4.500

anos.

O primeiro cientista que descobriu

a existência dos isótopos foi

J.J. Thomson em 1912. Ele mesmo

construiu um espectrômetro de

massas e explorou os íons positivos

de Neônio, ele descobre a existência

de dois isótopos Ne-20 e Ne-22.

Thomson conclui que alguns átomos

do gás Neônio possuem massas

maiores que o resto do gás. Este

descobrimento incitou seu aluno

Francis Willian Aston à construção

de um novo espectrômetro de massas,

especifico para pesquisar as

massas dos isótopos dos elementos

químicos conhecidos até então.

Aston descobre que a massa molar

do elemento Cloro, representada na

tabela periódica com massa 35,45 é

na realidade a média ponderada da

contribuição de seus isótopos Cl-35

e Cl-37, tendo abundancias de 76%

e 24%, respectivamente. Por este

feitio, Aston recebe o Premio Nobel

de Química em 1922.

O estudo da Química é dividido em

dois universos: inorgânica e orgânica.

Os isótopos tem um papel muito importante

nos dois ramos desta Ciência.

Na Química Inorgânica é explorado

com maiores detalhes os efeitos

isotópicos.

Existem vários tipos de espectrômetros

de massas comercialmente

ofertados para análise de elementos

inorgânicos. Os mais conhecidos

são:

1) A Espectrometria de Massa com

Plasma Indutivamente Acoplado ICP-

-MS “Inductively Coupled Plasma

Mass Spectrometry”; é um método

sensível para análise e confirmação

de íons metálicos com uma alta faixa

dinâmica linear. O ICP-MS é capaz de

analisar quase todos os elementos da

tabela periódica e pode ser aplicado

em soluções, sólidos e gases. Uma

configuração típica de um ICP-MS é

mostrada na Figura 1. As amostras,

na forma de solução são vaporizadas

usando um nebulizador. Amostras na

forma sólida são analisadas usando

ablação a laser e amostras na forma

gasosa são introduzidas diretamente

no espectrômetro. Todas as amostras

são introduzidos em um plasma

de argônio composto de elétrons e

íons de argônio carregados positivamente.

No plasma que atinge a

temperatura de 10.000 K, o material

se divide em átomos individuais que

perdem elétrons e se tornam íons

carregados positivamente (os ânions

não são detectados pela ICP-MS). O

feixe de íons positivos entra em um

analisador de massa quadrupolo,

onde os íons são separados de acordo

com sua relação massa/carga. O

ICP-MS permite análises qualitativas

de quase 100 metais em várias matrizes,

em um tempo relativamente

curto e em concentrações inferiores

à 1 parte por 1015 (1 ppq).

2) A Espectrometria de Massa

por Ionização Térmica, TIMS “Thermal

Ionization Mass Spectrometry”

é uma técnica de caracterização de

espectrometria de massa de isótopos

altamente sensível. As razões isotópicas

de radionuclídeos são usadas

para obter uma medida precisa para

a análise elementar de uma amostra.

A diluição isotópica permite este cálculo.

Íons da amostra são formados

pelo efeito de ionização térmica. Uma

amostra líquida quimicamente pura

é colocada num filamento de metal

que é então aquecido para evaporar

o solvente (Figura 2). A remoção de

um elétron da amostra purificada é

obtida aquecendo o filamento o suficiente

para liberar um elétron, o que

consequentemente ioniza os átomos

da amostra. Os íons ganham veloci-


ser ocupado por estes espectrômetros, devendo os laboratórios manter uma

elevada limpeza para evitar interferentes nas análises. Exige-se também,

analistas com excelente treinamento para atingir resultados consistentes.

Fonte: Research Gate

dade por um gradiente de potencial

elétrico e são focados em um feixe

por lentes eletrostáticas. O feixe de

íons passa então pelo campo magnético

do eletroímã, onde é dividido

em feixes de íons separados com

base na razão massa/carga.

3) O Espectrômetro de Massas

de Íons Secundários, SIMS “Secondary-ion

mass spectrometry” é

uma técnica utilizada para analisar a

composição de superfícies sólidas e

filmes finos através da aplicação de

“sputtering” na superfície da amostra

com um feixe de íon primário, focalizado,

coletando e analisando os íons

secundários ejetados da mesma.

A razão massa/carga destes íons

secundários é medida com um espectrômetro

de massas a fim de determinar

a composição isotópica ou

molecular da superfície em profundidades

de 1 a 2 nm. SIMS é a técnica

de análise mais sensitiva à superfície,

o espectrômetro de massas SHRIMP

“Sensitive High-Resolution Ion Microprobe”

(Figura 3) é dedicado para

análises de geocronologia podendo

medir abundâncias isotópicas em

minerais a uma escala de 30 micrômetros.

A Geologia da Universidade

de São Paulo USP possui o referido

analisador.

As vantagens do ICP-MS comparadas

com o TIMS e SIMS são: A versatilidade

de utilizar diferentes matrizes

e estados físicos, graças à tocha

plasma como fonte de íons. Rapidez

de concretizar um ciclo analítico desde

a preparação da amostra até a

leitura dos espectros de massas.

A vantagem do TIMS, comparada

com o ICP-MS é na maior exatidão

de medidas isotópicas tornando este

espectrômetro um referencial para

matérias.

Fonte: Research Gate

Figura 1. Diagrama esquemático do Espectrômetro de Massa

A vantagem Fonte: do Research SIMS Gate comparada Figura 1. Diagrama esquemático do Espec-

Indutivamente com o ICP-MS é na maior Acoplado reprodu-

(ICP-MS)

Figura 1. Diagrama esquemático trômetro de do Massa Espectrômetro com Plasma de Indutivamente Massa com Plasma

tibilidade das análises, já que por

Indutivamente Acoplado (ICP-MS) Acoplado (ICP-MS)

ablação de Laser utilizado no ICP-MS

a amostra é destruída no local de coleta,

no caso do SIMS a amostra não

é destruída podendo repetir várias

vezes a análise da mesma amostra

além da robustez analítica.

As desvantagens dos três espectrômetros

de massa em discussão

são: Elevado custo dos analisadores

e da manutenção. Exige um grande

espaço

Fonte:

a ser

Research

ocupado

Gate.

por estes

espectrômetros, devendo os laboratórios

manter Figura uma 2: elevada Diagrama limpeza esquemático da fonte de íons com duplo filamento utilizada

Fonte: Research Gate.

para evitar na interferentes Espectrometria nas análises. de Massa por Ionização Térmica TIMS

Fonte: Exige-se Research também, Gate. analistas com

Figura 2: Diagrama esquemático da fonte

excelente treinamento para atingir

de íons com duplo filamento utilizada na Espectrometria

de Massa por Ionização Térmica

resultados consistentes.

TIMS

Figura 2: Diagrama esquemático da fonte de íons com duplo fila

na Espectrometria de Massa por Ionização Térmica TIMS

Referências Bibliográficas

• Walczyk, T. TIMS versus

multicollector-ICP-MS: coexistence

or struggle for survival? Anal. Bioanal.

Chem. (2004) 378 : 229–231.

• Taylor, H. Inductively Coupled

Plasma Mass Spectrometry.

Academic Press. 2001.

• Moraes, N.M.P. Aplicação

e avalição da técnica de diluição isotópica

por espectrometria de massas

na determinação de elementos de

Terras Raras em materiais geológicos.

Tese IPEN 1988.

Fonte: Australian Scientific Instruments.

Figura 3: Diagrama do espectrômetro de massas SHRIMP “Sensitive High-

Resolution Ion

Microprobe”

Microprobe”

Referências bibliográficas

*Oscar Vega Bustillos

Pesquisador do Centro de Química e Meio


Ambiente CQMA do Instituto de Pesquisas

Energéticas e Nucleares IPEN/CNEN-SP


55 11 3133 9343

Fonte: Australian Scientific Instruments.

Figura 3: Diagrama do espectrômetro de

massas SHRIMP “Sensitive High-Resolution Ion

Walczyk, T. TIMS versus multicollector-ICP-MS: coexistence or struggle

for survival? Anal. Bioanal. Chem. (2004) 378 : 229–231.

Taylor, H. Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry. Academic

Press. 2001. ovega@ipen.br

www.vegascience.blogspot.com.br

Moraes, N.M.P. Aplicação e avalição da técnica de diluição isotópica por

espectrometria de massas na determinação de elementos de Terras Raras em

materiais geológicos. Tese IPEN 1988.

*Oscar Vega Bustillos

Pesquisador do Centro de Química e Meio Ambiente CQMA do Instituto de


Análise de Minerais

44

REVISTA ANALYTICA - ABR/MAI 19

Erros Sistemáticos em Sistemas de Medição

As incertezas de um sistema de

medição podem ser divididas em

dois componentes básicos: um

componente aleatório e outro sistemático.

O componente aleatório,

comumente chamado de erro, no

caso das análises minerais está

diretamente relacionado às características

intrínsecas dos minérios

submetidos à análise e não apenas

ao sistema de medição utilizado.

Isto ocorre independentemente das

técnicas amostrais ou analíticas estão

sendo utilizadas no processo de

determinação.

Já o componente sistemático,

também conhecido como vício ou

viés, está diretamente relacionado

ao sistema de medição, variando

de acordo com o minério que está

sendo amostrado ou analisado naquele

sistema. Ou seja, este vício

é a resultante do somatório da interação

dos efeitos dos elementos

sistema de medição e do minério. A

alteração de um minério em um determinado

sistema pode resultar em

um vício maior, menor ou ausente

quando comparado a outro mineral.

Mas, invariavelmente um erro sistemático

é sempre provocado pelo

projeto, modelo construtivo, ajustes

ou modelo operacional definido para

o sistema de medição.

Para uma amostra ser representativa

do todo é preciso que todas as

partículas tenham as mesmas chances

de serem amostradas. Podemos

extrapolar, de forma inequívoca,

esta definição para as mais diversas

etapas do processo analítico. Assim,

o erro sistemático pode ocorrer em

qualquer etapa: amostragem, preparação

da amostra para ensaios ou

análises e ensaios.

Esta falta de oportunidade de uma

partícula ser amostrada pode ocorrer

por uma infinidade de motivos,

como por exemplo, pelo volume

de produção da indústria mineral o

sistema de amostragem pode ser

incapaz de transpassar o fluxo e

coletar uma porção proporcional do

mesmo, ou porque durante a etapa

de preparação de amostras existe a

perda de um material extremamente

fino que constitui a amostra do minério

em análise.

Outro ponto fundamental para a

inserção de erros sistemáticos nos

sistemas de medição vem de um

importante conceito preconizado

pela ISO 9001:2015:

“Quando a rastreabilidade de

medição for um requisito, ou for

considerada pela organização parte

essencial da provisão da confiança

na validade de resultados de medição,

os equipamentos de medição

devem ser:

a) verificados ou calibrados, ou

ambos, a intervalos especificados,

ou antes do uso, contra padrões de

medição rastreáveis a padrões de

medição internacionais ou nacionais.”

Este ponto é capital, pois frente a

necessidade de redução de custos,

aumento de produtividade dos empregados

e equipamentos e a entrega

de resultados em prazos cada

vez mais curtos, os laboratórios se

preocuparam apenas em calibrar

seus equipamentos periodicamente,

em especial, balanças. Porém, entre

duas calibrações, muitos eventos

podem acontecer e os equipamentos

de medição podem não mais se

encontrar nas condições ideais pós

calibração. A verificação periódica

irá identificar o momento em que o

distúrbio ocorreu e, impedir que o

sistema de medição apresente vício

em seus resultados.

Em colunas anteriores já dissemos

a importância do uso de padrões de

qualidade, importantes aliados na

eliminação ou redução de vícios dos

equipamentos analíticos, como, espectrômetros,

tituladores, colorímetros,

entre outros. Os padrões que

permitirão o adequado ajuste destes

equipamentos, garantindo uma boa

acurácia dos resultados.

Outro elemento importante é o

operador, que muitas vezes tem

sua importância minimizada, em

especial em tempos de automação

dos processos analíticos, sendo um

potencial causador de erros sistemáticos.

Divergências operacionais

entre dois empregados, seja na for-

ma de calibrar e verificar um equipamento

ou no modo como interpreta

um determinado indicador de

qualidade, pode levar a sérios erros

operacionais sistemáticos de difícil

identificação. Assim, uma equipe

bem treinada é crucial, uma das

formas é através da construção de

fóruns, onde operadores compartilham

experiências e técnicas.

Estes são os erros sistemáticos

mais comuns que se pode ter nas

análises minerais e em um processo

de medição em geral. A redução

dos erros sistemáticos para níveis

aceitáveis para o cliente é uma obrigação

dos laboratórios de análises

minerais, uma vez que é a partir dos

resultados mensurados nestes que

se tem a valoração de reservas minerais,

a definição de valores para

comércio entre partes e ajustes de

qualidade de produtos comercializados.

Claro que reduzir ou eliminar

este vício tem um preço e que, por

óbvio, é menor do que a falta de

confiança nos resultados emitidos.

Eduardo Pimenta de Almeida Melo

é Engenheiro Químico,

Gerente de Laboratórios da CSN Mineração,

MBA em Gestão Empresarial,

Pós–Graduado em Gestão de Laboratórios e

Especializado em Data Science.

Coordenador da Comissão de Estudos para

Amostragem e Preparação de Amostras em

Minério de Ferro para a ABNT – Associação

Brasileira de Normas Técnicas.

LinkedIn: https://br.linkedin.com/in/eduardo-

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Telefone: 31 3749 1516

E-mail: eduardo.melo@csn.com.br


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Microbiologia

46

REVISTA ANALYTICA - ABR/MAI 19

Aspectos microbiológicos do estudo de

estabilidade de produtos farmacêuticos

Por Claudio K. Hirai*

De acordo com as normas vigentes,

os estudos de estabilidade de

medicamentos devem ser realizados

sob diversas condições de temperatura

e umidade. A incubação dos produtos

em diferentes temperaturas e

condições de umidade tem o objetivo

de verificar a estabilidade do produto

nas diversas regiões do pais.

Sabe-se que Anvisa, através da RE

nº 1 de 2005, normatizou a realização

dos estudos de estabilidade de

produtos farmacêuticos com o objetivo

de determinar e acompanhar o

seu prazo de validade.

A regulamentação atual sobre o

tema está dividida em quatro normas

diferentes, além de existirem

diversas recomendações em outros

documentos da Anvisa, prejudicando

a compreensão dos critérios. Os

regulamentos não têm abrangência

total sobre o tema e falta clareza

sobre os requisitos para estudos de

estabilidade, o que motiva interpretações

subjetivas.

Os estudos de estabilidade de longa

duração levam 2 anos ou mais,

enquanto os estudos acelerados

levam cerca de 6 meses. Considerando

o investimento de tempo e de

recursos, é necessário que as empresas

que desenvolvem medicamentos

tenham certeza sobre a validade dos

estudos para análise pela Anvisa.

A revisão das regras também faz

parte do processo de aceitação da

Anvisa no International Conference

on Harmonisation (ICH), um

conselho internacional dedicado à

harmonização dos requisitos técnicos

para medicamentos humanos.

Em dezembro de 2017, foi publicada

a consulta pública nº 453 que

altera a RE nº 1 e atualiza os critérios

para a realização de estudos de estabilidade

de insumos farmacêuticos

ativos e medicamentos, exceto biológicos.

Com a conclusão desta fase inicial, aguarda-se a publicação da nova

norma.

Assim, nesta edição da revista Analytica, focaremos nos aspectos microbiológicos

dos medicamentos estéreis e não estéreis, com um foco concentrado

no último.

Em primeiro lugar, a estabilidade dos produtos não estéreis deve considerar a

carga microbiana dos excipientes, matérias primas ativas (ifas) e as condições

ambientais de fabricação. Tal informação pode ser obtida na 5º edição da Farmacopeia

Brasileira, manual produzido pela Anvisa, na qual informa os limites

microbianos.

A contaminação microbiana de um produto não estéril (especialidade e matéria-prima

farmacêutica) pode conduzir não somente à sua deterioração, com

as mudanças físicas e químicas associadas, mas também ao risco de infecção

para o usuário. Consequentemente, os produtos farmacêuticos orais e tópicos

(cápsulas, comprimidos, suspensões, cremes, etc.) que não são estéreis devem

ser submetidos aos controles da contaminação microbiana.

A garantia de qualidade e os controles de produção devem preconizar que os

micro-organismos capazes de proliferar e contaminar o produto estejam dentro

dos limites aceitáveis. Os limites microbianos devem ser adequados às várias

categorias de produtos que reflitam o tipo de contaminação mais provável introduzida

durante a fabricação, bem como a via de administração, o consumidor

final (neonatos, crianças, idosos, debilitados), o uso de agentes imunossupressores,

corticosteroides e outros fatores. Ao avaliar os resultados dos testes microbiológicos,

o número e os tipos de micro-organismos presentes devem ser

considerados no contexto do uso do produto proposto.

O teste microbiológico de produtos não estéreis e de matéria-prima para uso

farmacêutico é realizado segundo a metodologia descrita em ensaios microbiológicos

para produtos não estéreis, também descrito pela Farmacopeia Brasileira.

Além da descrição metodológica dos ensaios, o manual também oferece os

limites de aceitação, interpretados do seguinte modo:

- 10 1 UFC: valor máximo aceitável = 20

- 10 2 UFC: valor máximo aceitável = 200

- 10 3 UFC: valor máximo aceitável = 2000 e, assim sucessivamente.

Entretanto, há um grande questionamento quanto aos valores máximos

aceitáveis, quando desenvolvemos uma formulação de um comprimido, por

exemplo, devemos considerar a qualidade microbiológica dos excipientes, das

matérias primas ativas e das condições de fabricação. Assim, é inaceitável em

um estudo de estabilidade no qual dados iniciais apresentam um limite de 102

UFC, que seja aceito uma contagem de 200 UFC ou mais.

A repetição dos valores máximos aceitáveis devem ser objeto de uma reavaliação

da formulação e das condições de fabricação, portanto a especificação

final do produto não pode ser relacionada aos valores máximos aceitáveis.

Desta maneira, o valor máximo aceitável não deve fazer parte da especificação

de liberação final do produto. Valores acima da especificação devem ser

objeto de uma investigação pela Garantia de Qualidade.

Os produtos de uso múltiplo devem ser protegidos contra a contaminação microbiana

por meio da adição de conservantes. O ensaio do desafio microbiano

de conservantes deve ser realizado para todas formulações, antes do início dos


estudos de estabilidade, uma vez que

o produto pode estar contaminado

com: Candida albicans ATCC 10231;

Aspergillus niger ATCC 16404; Escherichia

coli ATCC 8739; Pseudomonas

aeruginosa ATCC 9027; e

Staphylococcus aureus ATCC 6538.

A quantidade de conservante utilizada

em uma formulação deverá

ser a mínima necessária para a proteção

do produto sem prejudicar o

paciente ou consumidor. A eficácia

antimicrobiana, seja ela inerente ao

produto ou devida à adição de conservantes,

precisa ser demonstrada

para produtos tópicos múltipla-

-dose, produtos orais, oftálmicos,

otológicos, nasais, fluidos de diálise,

irrigação, entre outros.

Com relação aos produtos estéreis,

os mesmos devem atender a

especificação, sendo que o ensaio

deve ser realizado no início e no final

do estudo de estabilidade.

Bibliografia:

BRASIL, Ministério da Saúde. Agência Nacional

de Vigilância Sanitária. Farmacopeia Brasileira. 5ª

Ed. Brasília, 2010. (pag 59 – 207).

*Claudio Kiyoshi Hirai

Gerente Técnico Biolab

É farmacêutico bioquímico, diretor científico da BCQ

consultoria e qualidade, membro da American Society

of Microbiology e membro do CTT de microbiologia da

Farmacopeia Brasileira.

Telefones: 55 11 3573-2905 55 11 3573-6812

chirai@biolabfarma.com.br www.biolabfarma.com.br

BRASIL, Ministério da Saúde. Agência Nacional

de Vigilância Sanitária. Resolução nº 1 Anvisa de

29/07/2005 - Guia para a Realização de Estudos

de Estabilidade.

BRASIL, Ministério da Saúde. Agência Nacional

de Vigilância Sanitária. Consulta Pública nº 453 de

28/12/2017 - Critérios para a Realização de Estudos

de Estabilidade de insumos farmacêuticos ativos

e medicamentos, exceto biológicos, e dá outras

providências.

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Informe Científico

Filtros Integrados

Quando escolher Ultrafiltração ou

Microfiltração?

Autores:

João Paulo dos Santos1,

Lucas Pedrosa Souto Maior2,

Eliane Costa Souza3,

Tatiana Almeida Omura de Paula4,

Lúcia Helena Ferreira Santos5,

Karwhory Wallas Lins da Silva6,

Yáskara Veruska Ribeiro Barros7,

Velber Xavier Nascimento8,

Alessandra Valério de Almeida Guedes9

Filtração é o processo de separação utilizado em sistemas de purificação de água, como uma barreira

física para eliminar contaminantes, tais como partículas e microrganismos, que possam reagir com as

amostras e causar efeitos negativos em aplicações laboratoriais específicas. A grande diferença entre os

dois sistemas de filtração integrado utilizados no PURELAB Chorus, são os tipos e tamanhos dos contaminantes

que podem ser removidos.

Como funciona a

filtração?

Ambos, microfiltração e ultrafiltração, utilizam membranas como uma

barreira física para retenção de partículas. Estes sistemas permitem a filtração

em baixa pressão, entretanto, se houver um bloqueio, então o gradiente

de pressão irá aumentar, e irá forçar o permeado a passar pelos poros das

membranas. Em aplicações que o PURELAB Chorus é utilizado, os cartuchos

de microfiltração ou ultrafiltração são utilizados após a Osmose Resversa

(OR), que remove efetivamente a maioria das partículas. Isto significa

que a filtração atua como a última etapa do sistema, removendo qualquer

partícula que, por ventura, não foi removida no filtro de pré-tratamento ou

na fase de Osmose Reversa (OR) ou ainda no caso improvável de quantidades

vestigiais de bactérias se proliferando no interior do reservatório.

Microfiltração?

O sistema de microfiltração (MF) é desenhado para remoção e retenção

de todas as partículas maiores que o tamanho controlado do poro da superfície

da membrana: tipicamente entre 0,05 e 0,2µm. Estes filtros, geralmente

são utilizados e posicionados o mais próximo possível do ponto

de uso do sistema, e funciona como uma “peneira”, retendo partículas e

bactérias com tamanho maior que 0,2 µm.

48

REVISTA ANALYTICA - ABR/MAI 19

A importância em

Aplicações Analíticas

A microfiltração é particularmente

muito utilizada para aplicações

analíticas, como por exemplo a

preparação da fase móvel para Cromatografia

Líquida de Alta Eficiência

(CLAE) ou High Performance Liquid

Cromatography (HPLC). Podendo

remover moléculas orgânicas (como

por exemplo, pesticidas, herbicidas

ou vestígios de tecido vegetal ou

animal), bactérias (< 0,1UFC/ml) e

particulados (


Ultrafiltração

A ultrafiltração (UF) não é muito diferente da microfiltração, a não ser o

tamanho das partículas que podem ser removidas. Partículas tão pequenas

quanto proteínas e macromoléculas são removidas pela membrana, que

geralmente, é composta por fibras na forma de “tubos ocos” para aumentar

o fluxo de água. O tamanho do poro da membrana, tipicamente está entre

0,001 e 0,1µm. A água pode passar pela membrana de duas formas:

1. Toda a água passa diretamente pela

membrana (“dead-ended”);

2. Uma porção da água passa pela

superfície da membrana em

“cross-flow” (fluxo tangencial).

O benefício deste modelo é a

possibilidade de reduzir o acúmulo

de contaminantes através da

rinsagem do transportado pela água;

Filtração Integrada

(Interna) x Filtro de

Ponto de Uso

O PURELAB Chorus fornece

sistemas com ultrafiltração ou

microfiltração integrados aos sistemas.

Estes sistemas integrados

permitem uma maior efetividade

da filtração, combinando tecnologias

como Osmose Reversa, Troca

Iônica, Lâmpada UV. Sanitização

Química e Micro ou Ultrafiltração

para fornecer água ultrapura, não

dependendo apenas de um único

filtro de ponto de uso. O principal

benefício em relação aos filtros típicos

de ponto de uso (POU) é que

os níveis de bactérias ou endotoxinas

na água ultrapurificada ainda

podem ser garantidos pela filtração

antes da utilização. Como segurança

extra e tranquilidade, filtros de

ponto de uso podem ser adicionados,

também, aos dispensadores.

A importância em Aplicações Life Science

A microfiltração é particularmente muito utilizada para aplicações Life

Science, como por exemplo para Reação em Cadeia da Polimerase ou Polymerase

Chain Reaction (PCR). Promovendo a remoção de nucleases (RNase

/ DNase), endotoxinas bacterianas e pirogênios, compostos orgânicos

(como por exemplo, pesticidas, herbicidas ou vestígios de tecido vegetal ou

animal), bactérias (< 0,1UFC/ml) e particulados (


Em Foco

Fritsch e Altmann, uma nova parceria.

Há 84 anos no mercado de instrumentação

analítica, a Altmann sempre

busca novos desafios e prima

pela qualidade dos equipamentos

oferecidos aos seus clientes.

Representante de renomadas

marcas, muitas exclusivas, agregou

recentemente mais uma para seu

time: FRITSCH, fabricante líder mundial

em equipamentos para moagem,

preparação de amostra e peneiramento.

Possui uma linha de equipamentos

composta por diversas técnicas

de moagem (esferas, facas, rotores,

mandíbulas, discos, almofariz) que

se adequam para cada preparação,

volume de amostra e tipo de material,

obtendo resultados rápidos, com alto

rendimento e reprodutíveis.

Com uma gama de peneiras e

acessórios, os peneiradores da linha

são robustos e atendem a demanda

para peneiramentos via úmida e

seca, além de software de avaliação

incluído no fornecimento para uso

sem custos durante 90 dias.

Para completar a linha, oferece

equipamentos para divisão, dosagem

e limpeza ultrassônica, otimizando o

tempo na preparação e resultando

trabalho ainda mais eficiente.

A equipe de vendas e assistência

técnica da Altmann está preparada e

à disposição para fornecer todas as

informações e serviços.

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50

REVISTA ANALYTICA - ABR/MAI 19

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aos clientes a atingir a melhor

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técnicos altamente qualificados e

material de primeira linha para que

os serviços sejam realizados sempre

com excelência.

Além de ações de manutenção

corretiva/ preventiva, a Sartorius

oferece serviços de IQ| OQ para

todos os equipamentos de seu portfólio.

Outra grande vantagem são

os contratos de manutenção pois

estes se adequam as necessidades

específicas de cada cliente e

garantem uma resposta mais ágil

aos chamados.

Outro importante serviço é Calibração

RBC de balanças até 1500

KG e pipetas de 1uL a 10000µL,

que quando realizadas em conjunto

com a manutenção preventiva,

mantem a precisão dos equipamentos.

Esta calibração também

pode ser executada em balanças

e pipetas que não são da marca

Sartorius.

A calibração RBC de balanças

deve ser realizada no local de operação

do equipamento pois sofre

influência das condições do ambiente.

No caso das pipetas, este

serviço é realizado em um laboratório

dedicado para este fim na

sede da Sartorius do Brasil.

Para saber mais,

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REVISTA ANALYTICA - ABR/MAI 19

Local

51


Em Foco

Soluções para o cultivo de células e tecidos

Placas e microplacas da Greiner Bio-One oferecem qualidade e versatilidade.

Um dos processos mais requisitados

no dia a dia dos laboratórios,

a cultura de células e tecidos é de

suma importância para aplicações

em diversos campos, contribuindo

desde o uso para a fabricação de

vacinas, pesquisas relacionadas

a doenças como o câncer, desenvolvimento

e testes pré-clínicos de

medicamentos, até terapia utilizando

células-tronco. Com todas estas

aplicações, é um processo que

necessita atender a diversas variáveis,

como o tipo de células que

estão sendo cultivadas, a escala

das culturas, finalidade da análise

e até mesmo o espaço físico disponível

para receber estas demandas

e, por isso, soluções versáteis e

com alto padrão de qualidade são

essenciais para facilitar e agilizar

as rotinas com os melhores resultados.

Por isso, a Greiner Bio-One

oferece uma variedade de placas

para a cultura de células para as

mais diversas finalidades. Entre os

destaques estão as inovações das

linhas CELLSTAR® e Advanced

TC oferecidas em diferentes tamanhos

e tipos de superfícies.

Para o cultivo de células aderentes,

as placas e microplacas

CELLSTAR® TC são fisicamente

modificadas por meio da inserção

de grupos polares no plástico, o

que torna a superfície hidrofílica

para otimizar a adesão celular. Enquanto

para células aderentes mais

sensíveis, o tratamento inovador da

superfície dos produtos Advanced

TC proporciona um ambiente

excelente para o cultivo celular em

condições de ausência ou redução

de soro, células primárias raras,

células transfectadas ou transduzidas.

Ambos os produtos estão

disponíveis em placas de 35 a 145

mm de diâmetro e microplacas de

6 a 1536 poços.

No cultivo de células não aderentes,

a CELLSTAR® Suspensão

oferece a superfície hidrofóbica,

indicada para o cultivo de células

que não necessitam de ancoragem

para se proliferar e sobreviver,

como células de origem hematopoética.

Há também a linha “Cell-repellent”,

uma tecnologia exclusiva

da Greiner que evita efetivamente

a adesão celular, muito utilizada

no cultivo de células em 3D, é indicada

para processos em que as

superfícies hidrofóbicas convencionais

não são suficientes para

impedir a adesão. As placas estão

disponíveis de 35 a 145 mm de diâmetro

e microplacas de 6 a 384

poços.

Os produtos apresentam o alto

nível de qualidade da Greiner Bio-

-One, já reconhecido no mercado,

e estão em conformidade com as

normas do Instituto Nacional Padrão

Americano (ANSI) para microplacas.

Para saber mais sobre estes e

outros produtos, entre em contato

pelo e-mail: info@br.gbo.com.

Analisadores de Carbono Orgânico Total (COT) Sievers®

52

REVISTA ANALYTICA - ABR/MAI 19

Desempenho analítico, confiabilidade

e facilidade de uso incomparáveis

Como fabricante líder mundial de

analisadores e instrumentos analíticos

de COT, fornecemos tecnologia,

design, e qualidade superiores.

Os analisadores de COT da Sievers

cobrem um intervalo analítico dinâmico

de 0,03 ppb até 50.000 ppm

e fornecem soluções em diversos

setores e aplicações.

Sievers M9 Laboratório,

Portátil e On-line

Meça o COT mais precisamente

e maximize a produtividade

O Sievers M9 fornece dados

estáveis e precisos para monitoramento

de água ultrapura (UPW) e

farmacêutica, validação de limpeza

e outras aplicações. Com a tecnologia

de membrana condutométrica

Sievers, os analisadores M9 fornecem

desempenho analítico incomparável,

confiabilidade e facilidade

de uso. Recursos exclusivos, como

o teste simultâneo de condutivida-


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Cultura celular

Inovação e tecnologia ao seu alcance

A variedade de superfícies das placas e microplacas da Greiner

Bio-One oferecem qualidade e versatilidade na cultura de células

para as mais diversas finalidades.

A linha CELLSTAR ® TC oferece opções de superfície

hidrofílica para otimizar a adesão celular.

Os produtos Advanced TC são excelentes para o cultivo

celular em condições de ausência ou redução de soro,

células primárias raras, células transfectadas ou

transduzidas.

A CELLSTAR ® Suspensão oferece superfície hidrofóbica

para cultivo de células que não necessitam de ancoragem

para se proliferar e sobreviver.

A nossa tecnologia exclusiva “Cell-repellent” é indicada para

processos em que as superfícies hidrofóbicas convencionais

não são suficientes para impedir a adesão como, por

exemplo, para a realização de Cultura de Células em 3D.

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Em Foco

de Estágio 1 e COT. Nossa tecnologia

ajuda os clientes a aumentar

a eficiência e manter a conformidade,

principalmente em setores

como o de produtos farmacêuticos

e microeletrônicos.

Sievers 500 RL On-line

Cumpra os regulamentos e melhore

o controle do processo com

o monitoramento on-line preciso e

estável da UPW

O Sievers 500RL fornece a estabilidade

e a precisão, particularmente

para aplicações farmacêuticas.

Com operações variando

de 0,03 ppb até 2,5 ppm, esses

analisadores oferecem o menor

limite de detecção para analisadores

UPW on-line de COT sem

reagentes. Conformidade com a

USP e outras farmacopeias

internacionais e pode ser fornecido

com os protocolos críticos necessários

para a validação do processo

de teste em tempo real (RTT) e

conformidade com a 21 CFR Parte

11. O 500 RL usa a tecnologia de

membrana condutométrica Sievers

para fornecer precisão e confiabilidade,

sem leituras de falso positivo

e falso negativo associadas a outras

tecnologias de COT simplificadas.

Sievers 860 Laboratório

Excelente desempenho analítico

com um conjunto de recursos simplificado

Foi criado para testes gerais de

água farmacêutica, inclusive água

para injeção (WFI) e água purificada

(PW) e está em conformidade

com os principais requisitos

da farmacopeia global. Com um

intervalo linear de 0,3 ppb a 1,5

ppm, o 860 Lab utiliza a tecnologia

comprovada de membrana condutométrica

Sievers e oferece uma

alternativa mais robusta ao método

de condutividade direta. O 860

Lab é fácil de configurar, operar e

pode ser usado com o amostrador

automático RT12 para aumentar a

produtividade.

Padrões e vials Sievers

Minimize os riscos e elimine as

variáveis com vials e padrões certificados

Ao medir o COT é importante minimizar

os riscos de contaminação

e eliminar as variáveis de teste em

todas as análises.

• Padrões Sievers: de precisão,

de calibração, de verificação,

de condutividade, conjuntos de linearidade

e mais.

• Vials Sievers incluem:

vials certificados de baixo COT

(


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NEGÓCIOS.

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junho

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Em Foco

Grupo Polar inova mais uma vez e lança linha SafePack com o Polar PCM,

solução que elimina potencial risco de excursão de temperatura

Novas tecnologias, que serão apresentadas na 24 ª FCE Pharma, foram desenvolvidas para manter e

garantir estabilidade sob temperaturas extremas por muito mais tempo

56

REVISTA ANALYTICA - ABR/MAI 19

O Grupo Polar, líder na fabricação

de elementos térmicos, desenvolveu

tecnologias exclusivas

para atender as novas exigências

regulatórias do mercado farmacêutico:

a linha SafePack com o Polar

PCM (Phase Change Material). As

novidades serão apresentadas durante

a FCE Pharma, maior feira da

indústria farmacêutica na América

Latina, entre os dias 21 a 23 de

maio no São Paulo Expo, em São

Paulo.

“Os PCMs são estudados há

mais de uma década em diversas

aplicações com o intuito de reduzir

o consumo de energia e melhorar

a qualidade de algumas aplicações

especificas, como o transporte de

produtos com temperatura controlada.

A Polar trouxe essa novidade

juntamente com a linha SafePack,

diversificando a gama de produtos

e os tipos de isolamento disponíveis

no mercado, como por exemplo

o VIP, que apresenta o melhor

isolamento térmico do mercado nacional

e internacional”, explica Anderson

Fernandes, engenheiro de

desenvolvimento do Grupo Polar.

Disponíveis em três versões “SafePack

Tec, SafePack Max e SafePack

Vip”, foram desenvolvidas

pela Polar Técnica e seguem os

parâmetros do Guia Anvisa para a

Qualificação de Transporte de Produtos

Biológicos, 2ª Edição (2017).

Elas serão comercializadas junto

com o Polar PCM, respeitando o

conceito de química verde, e mantendo

a faixa de temperatura, sejam

elas 2°C a 8°C, 15°C a 25°C

ou negativo.

Conheça a Linha SafePack

SafePack VIP:

Os painéis são fabricados por

meio de um material termicamente

não condutor, embalado a vácuo

e envolto por camadas de filme

especial impermeável. O vácuo

presente nos painéis, mitiga a variação

de temperatura, inibindo assim

a transferência de calor entre o

sistema passivo de transporte e o

exterior. Além disso, possui o melhor

isolante térmico atualmente no

mercado, é reutilizável, e garante

maior tempo de transporte seguro,

aumentando a confiabilidade

aos processos de manutenção da

temperatura para produtos termolábeis.

As placas POLAR VIP, que ficam

na parte interna da caixa, não

contêm asbestos (amianto), utilizando

materiais seguros e aprovados

pelas legislações ambientais.

SafePack Max:

Utiliza como isolante térmico

um plástico rígido de poliestireno

extrudado, chamado XPS, que possui

altíssima resistência mecânica.

Material com baixíssima absorção

de água ou vapor, sua estrutura

celular fechada e homogênea garante

excelentes características de

isolamento térmico e resistência

mecânica, tornando o tempo de

vida útil muito maior que o EPS.

Disponível com revestimento externo

em papelão corrugado branco

ou poliondas.

SafePack Tec:

É feita em EPS (Poliestireno Expandido)

para isolamento térmico,

uma ótima opção, por ser um material

altamente versátil. As possibilidades

de trabalho com o EPS são

diversas devido aos nossos modelos

exclusivos em parede tripla. A

SafePack Tec trabalha com caixas

de alta densidade garantindo um

melhor isolamento térmico para

o sistema passivo de transporte.

Sistema de alta confiabilidade,

propiciando uma excelente relação

custo x benefício para o transporte

de seus produtos.

24 ª edição da FCE Pharma

Data: 21 a 23 de maio de 2019

Horário: 11h às 19h

Estande E-107

Local: São Paulo Expo

Endereço: Rodovia dos Imigrantes,

KM 1,5 – São Paulo


A qualidade necessária

com a agilidade

desejada!

















Laboratório Habilitado pela ANVISA desde 2004

Centro Analítico Reblas 131.

Certificado de Acreditação CRL 1117.

Centro de Estudos de Equivalência Farmacêutica -

EQFAR048

Centro Analítico de Análises e Estudos MAPA -

Licença SP-000545-2

Analítica Analises Fisico-químicas e

Microbiológicas Ltda.

R. Giovanni Batista Raffo nº 120 - Bairro Raffo

Suzano - São Paulo - CEP 08653-005

Fones +55 (11) 4747-7485

analitica@analiticalab.com.br

www.analiticalab.com.br


Em Foco

A importância da qualidade na logística

Para falarmos sobre a importância da qualidade na logística, precisamos falar sobre a importância do

sistema de gestão da qualidade.

58

REVISTA ANALYTICA - ABR/MAI 19

A principal atividade do sistema

de gestão da qualidade é gerar melhorias

em seus produtos e serviços,

garantindo a completa satisfação

dos clientes e superando suas

expectativas.

A NBR ISO 9001, é uma das

principais referências de qualidade

para as empresas por orientar as

empresas a focar seu trabalho na

satisfação do cliente, na melhoria

constante e no gerenciamento do

processo.

A atuação do farmacêutico é

fundamental para que a empresa

consiga atingir uma alta qualidade

na prestação do serviço, com a realização

de treinamentos aos colaboradores,

qualificação de fornecedores

e agentes de carga, controle

de higiene e limpeza do local e dos

veículos, controle de pragas e vetores,

controle de temperatura e

umidade do estoque e dos veículos,

compatibilidade de cargas, garantindo

a chegada ao usuário final, de

produtos íntegros e com qualidade

assegurada.

A empresa deve dispor de uma

boa infraestrutura para a guarda e

armazenamento dos produtos, com

área construída adequada que permita

o monitoramento de temperatura

e a conservação dos produtos,

fatores relacionados diretamente

é qualidade dos medicamentos e

produtos para a saúde.

A empresa deve cumprir as legislações

vigentes para a distribuição

e transporte de produtos farmacêuticos,

cosméticos e produtos para

a saúde conforme determinação

da ANVISA, órgãos certificadores e

vigilâncias sanitárias do município

onde atua.

A vontade da direção da empresa

em desenvolver um planejamento

a curto, médio e longo

prazo, e o comprometimento dos

seus gestores é fundamental para

a implementação do SGS.

Para aplicar a gestão da qualidade

nos processos logísticos é necessário

que os gestores entendam

a necessidade de aprimorar os

procedimentos de armazenagem e

transporte, a necessidade de qualificar

a mão de obra, a implantação

dos indicadores de desempenho

que possibilitam validar a execução

das tarefas e assegurar que estejam

sendo cumpridas, possibilitando

a tomada de decisões estratégicas

e assertivas, a eficiência na

gestão de estoque a fim de evitar

processos ineficientes que geram

desperdícios e prejuízos, o registro

das informações permite que haja

eficiência e agilidade na execução

das atividades.

Com o sistema de gestão da

qualidade implementado, com a

atuação direta do farmacêutico,

com mão de obra qualificada e com

o comprometimento dos gestores é

possível garantir as boas práticas

de armazenagem e distribuição de

produtos farmacêuticos, cosméticos

e produtos para a saúde.

Tâmisa Da Silva Barbosa

Farmacêutica/Coordenadora de

Qualidade


Em Foco

Grupo APS Brasil

REPRESENTADAS

THE INERTSIL COLUMNS' FAMILY

24ª edição

EXPOSIÇÃO INTERNACIONAL DE TECNOLOGIA

PARA A INDÚSTRIA FARMACÊUTICA

visite nosso estande B075

Mantenedores

Academia de Ciências Farmacêuticas do Brasil

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