Auflösung des schnellen Schaltens bei Patch-Clamp Untersuchungen

Analyse von Strom-Spannungskurven
und Markov-Schalten des K + -Kanals in Chara in Hinblick
auf die Beteiligung schnellen Schaltens beim anomalen
Molfraktionseffekt in Anwesenheit von Tl +
Diplomarbeit der
Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät der
Christian-Albrechts-Universität zu Kiel
vorgelegt von
Afshin Farokhi
Kiel, im Januar 1998

Inhaltsverzeichnis
1.Einleitung ............................................................................................................................ 1
2. Biologische Grundlagen und Patch-Clamp-Technik ..................................................... 3
2.1. Biologische Grundlagen ......................................................................................... 3
2.1.1. Biologische Membran ................................................................................ 3
2.1.2. Membran-Transport-Klassifizierung ......................................................... 4
2.1.3. Kanäle und Carrier ..................................................................................... 4
2.1.4. Chara corallina .......................................................................................... 4
2.1.5. Aufbau eines Membranproteins ................................................................. 5
2.2. Die Patch-Clamp-Technik ...................................................................................... 6
2.2.2. Patchkonfigurationen ................................................................................. 6
3. Der anomale Molfraktionseffekt ...................................................................................... 8
3.1. Bisherige Meßergebnisse ........................................................................................ 8
3.1.1. Ergebnisse von Hagiwara ........................................................................... 8
3,1.2. Ergebnisse von Draber ............................................................................... 9
3.1.3. Ergebnisse von Albertsen ......................................................................... 10
3.1.3. Ergebnisse von Keunecke ........................................................................ 11
4. Modelle für die Beschreibung der Transport-vorgänge in Membrankanälen .......... 14
4.1. Markov-Modelle ................................................................................................... 14
4.2. Multi-Ion-Single-File-Modell ............................................................................... 15
4.3. Das enzymkinetische lazy-state-Modell ............................................................... 17
4.4. Wechselwirkungsmodell von Wu ......................................................................... 18
5. Veränderung des Schaltverhaltens beim Block durch Metallionen ........................... 20
5.1. Veränderung der Leitfähigkeit durch schnelles Schalten ..................................... 20
5.2. Reduzierte scheinbare Leitfähigkeit bei der Cs + -Blockade des K + -Kanals .......... 22
5.3. Der Na + -Effekt beim K + -Kanal und der Nachweis des
schnellen Schaltens in Chara ................................................ 23
6. Experimenteller Aufbau und Methoden ....................................................................... 27
6.1. Der Aufbau ........................................................................................................... 27
6.2. Meßkammer .......................................................................................................... 28
6.3. Bearbeiten und Ziehen der Pipetten ..................................................................... 29
i

6.4. Erd- und Pipettenelektrode ................................................................................... 29
6.5. Der Patch-Clamp Verstärker ................................................................................ 30
6.6. Das Patchen .......................................................................................................... 31
6.7. Die Kühlung ......................................................................................................... 32
6.8. Temperaturmessung und Probleme durch die Kühlung ....................................... 32
6.9. Auswerteprogramm .............................................................................................. 33
6.9.1. Bestimmung von Kanalzahl, Niveaus und Standardabweichung ............ 33
6.9.2. Die Rekonstruktion der Zeitreihe mit dem Hinkley-Detektor ................ 34
7. Meßergebnisse ................................................................................................................. 37
7.1. Strom-Spannungskurven ...................................................................................... 37
7.1.1. Bestimmung der Einzelkanalströme ........................................................ 37
7.1.2. Aufstellung von Strom-Spannungskurven ............................................... 39
7.1.3. Der anomale Molfraktionseffekt im scheinbaren Einzelkanalstrom ................. 39
7.2. Motivation zur Untersuchung des Zusammenhangs zwischen
schnellem Schalten und scheinbarem Einzelkanalstrom ............................ 42
7.3. Verweildauerhistogramme ................................................................................... 43
7.3.1. Analyseprogramme .................................................................................. 43
7.3.2. Auswahl eines geeigneten Markov-Modells für den K + -Kanal in Chara 45
7.3.3. Der Vergleich von COC- und
OOCCC-Modelle ...................................................... 47
7.3.4. Betrachtung der Fitergebnisse bei den verschiedenen Modellen ............ 50
7.3.5. Analyse auf der Basis des Modells SOGCZ ................. 51
7.3.5.1. Änderung der Ratenkonstanten bei
unterschiedlichen Temperaturen ............................................ 51
7.3.5.2. Änderung der Ratenkonstanten unter Einfluß von Tl + ............... 57
7.3.5.2.1. Mittelung im Burstbereich ............................................. 57
7.3.6. Betrachtung der Besetzungswahrscheinlichkeiten der einzelnen
Zustände im blockierten und unblockierten Kanal ..................... 64
7.3.6.1. Definition der Besetzungswahrscheinlichkeit ........................... 64
7.3.6.2. Besetzungswahrscheinlichkeiten im reduzierten Modell .......... 64
7.3.7. Auswirkungen des schnellen Schaltens auf die
Reduzierung des Einzelkanalstroms .......................................... 67
7.3.8. Die Anwendbarkeit des Mittelungsmodells ........................................... 68
7.3.9. Untersuchung der Offenwahrscheinlichkeiten ....................................... 71
7.3.10. Kontrolle der Ratenkonstanten der Zeitreihe aus
dem Target-Fit mit der Methode des direkten Fits der Zeitreihe
mit einem Hidden-Markov-Modell (HMM-Fit) .............................................. 75
8. Fazit und Ausblick ....................................................................................................... 77
9. Zusammmenfassung .................................................................................................... 79
Literaturverzeichnis ......................................................................................................... 81
Danksagung ....................................................................................................................... 86
Erklärung .......................................................................................................................... 87
ii

1 Einleitung
Der Transport von Ionen in pflanzlichen und tierischen Zellen ist ein interessanter und
wichtiger Bestandteil des Stoffwechsels. Unterschiedliche physikalische Mechanismen und
Modelle sind entwickelt worden, um den Transport durch Ionenkanäle zu erklären. Zur
Überprüfung der Modelle können unterschiedliche Effekte, Phänomene und Eigenschaften des
Kanalverhaltens benutzt werden. Die Leistungsfähigkeit eines Modells zeigt sich darin,
inwieweit es die beobachteten Effekte erklären kann.
Der anomale Molfraktionseffekt (AMFE) ist einer dieser Effekte: In einer Mischung von
unterschiedlichen Ionen (z.B. K + und Tl + ) ist die Leitfähigkeit in der Mischlösung kleiner als
in den reinen Lösungen. Der anomale Molfraktionseffekt wurde für K + - und Tl + -Ionen zum
ersten Mal von Hagiwara et al. 1977 an den Eizellen eines Fisches entdeckt. Dieser Effekt
konnte durch das Multi-Ion-Single-File-Pore-Modell (Hille und Schwarz, 1978) quantitativ
beschrieben werden. Der Kanal hat in diesem Modell in seinem Inneren mehrere
Bindungsstellen. Die Ionen können durch Platzwechsel durch den Kanal springen, aber sich
nicht aneinander vorbeibewegen. Das Modell sagt bei einem bestimmten Mischungsbereich
zweier permeierender Ionensorten ein Minimum der Leitfähigkeit, d.h. den anomalen
Molfraktionseffekt, voraus.
Schultze (1990) fand heraus, daß das Hille-Schwarz-Modell den anomalen
Molfraktionseffekt nur in einem Spannungsbereich von ca. 30 mV erklären kann. Dies steht
im Gegensatz zu den experimentellen Daten von Draber (1990; Draber et al., 1991). Sie stellte
fest, daß der Effekt für alle Spannungen beobachtet werden kann. Als Konkurrenz zum Hille-
Schwarz-Modell schlugen Draber et al. (1991) ein enzymkinetisches Modell mit „lazy-state“
vor. Damit wurde der AMFE durch ein Gating-Modell erklärt, bei dem schnelles Schalten
(Gating, Wechseln von aktiven zu inaktiven Zuständen) den Stromfluß unterbricht und die
Mittelung im Filter der Aufzeichnungsanlage zu einem reduzierten scheinbaren
Einzelkanalstrom führt.
Draber (1990) konnte mit der damaligen Technologie dieses hypothetische schnelle
Schalten bei einer Abtastrate von 5 kHz nicht nachweisen. Albertsen (1992) baute eine sehr
viel schnellere Datenerfassungsanlage, die Aufnahmeraten von 200 kHz ermöglichte. Die
hiermit aufgenommenen Daten zeigen ein sehr hohes Rauschen. Die Analyse dieser Daten
erforderte neue Methoden. Durch die Entwicklung eines neuen Sprungdetektors (Hinkley-
Detektor 8.Ordnung, Schultze und Draber, 1993) war man in der Lage, auch bei schlechtem
Signal/Rauschverhältnis die rauschfreie Originalzeitreihe des Kanals zu rekonstruieren. Mit
diesen neuen Werkzeugen zeigte Draber (1994, Draber und Hansen 1994), daß der Block
durch Cs + auf das Gating und nicht auf den Einzelkanalstrom wirkt.
Stimuliert durch diesen Erfolg griffen Albertsen (1994) und später Keunecke (1995) die
Suche nach dem schnellen Schalten beim AMFE wieder auf. Sie fanden aber nur indirekte
Hinweise auf das hypothetische schnelle Schalten im AMFE.
Keunecke (1995) versuchte deshalb als Alternative noch einmal eine Erklärung mit einem
Permeationsmodell, das direkt auf den Einzelkanalstrom wirkt. Sie wandte das Wu-Modell

Kapitel 1: Einleitung
(1991, 1992) auf ihre Daten von Chara an, um den anomalen Molfraktionseffekt zu erklären.
Ähnlich wie das Hille-Schwarz-Modell (1978) war die Ion-Ion Ion-Wasser Wechselwirkung
von Wu (1991, 1992) nur in der Lage, für einen begrenzten Spannungsbereich den Effekt zu
erzeugen.
Inzwischen entwickelte Blunck (1996) zwei neue Zugänge zur Untersuchung schneller
Schaltvorgänge. Er benutzte die Abkühlung auf 7°C als eine Möglichkeit, das Schalten des
durch Na + blockierten K + -Kanals zu verlangsamen. Dabei entdeckte er, daß der Unterschied
zwischen den Einzelkanalströmen des blockierten und unblockierten Kanals verschwand und
führte das darauf zurück, daß jetzt die zeitliche Auflösung reichen würde. Außerdem arbeitete
er das Analyse-Programm von Kijima und Kijima (1987b) so um, daß mit einem Target-Fit
die Ratenkonstanten des zugehörigen Markov-Modells auch aus Mehrkanalaufzeichnungen
gewonnen werden konnten. Kirst (1997) schuf dann eine sehr bequem zu handhabende
Windows-Version dieses Verfahrens und erweiterte die Anzahl der zulässigen Markov-
Zustände des Einzelkanals auf 5.
Nachdem diese neuen Werkzeuge bereitgestellt worden waren, schien es sinnvoll, das alte
Problem des AMFE wieder aufzugreifen. Das Ziel dieser Arbeit ist, durch hohe Abtastraten und
Temperaturreduzierungen den Nachweis des schnellen Schaltens beim anomalen
Molfraktionseffekt mit Tl + -Ionen zu erbringen. Es soll gezeigt werden, daß der Tl + -Block nur
eine scheinbare Reduzierung des Stroms des Kaliumkanals verursacht. Es werden die
Experimente, Methoden und die unterschiedlichen Analyseverfahren beschrieben, mit deren
Hilfe das schnelle Schalten aufgelöst werden soll.
Hinter dieser Arbeit steht auch der Wunsch, die Hypothese zu stützen, daß die
unterschiedlichen Metallionen alle über denselben Mechanismus wirken (an der gleichen
Bindungsstelle angreifen), aber aufgrund ihrer unterschiedlichen chemischen Natur verschiedene
Effekte verursachen. Für den Cs + - und Na + -Block wurde diskutiert, ob beide Ionen an der
Bindungsstelle für Ca 2+ angreifen. Wenn jetzt für Tl + auch der Nachweis gelänge, daß der
AMFE auf schnellem Schalten beruht, wäre das dritte Ion in diese Hypothese eingereiht.
2

2 Biologische Grundlagen und Patch-Clamp-
Technik
2.1 Biologische Grundlagen
2.1.1 Biologische Membran
Die Zelle ist die kleinste noch selbständig lebensfähige Einheit. Alle Organismen
bestehen entweder aus einer einzigen, mehreren oder vielen Zellen. Die eukaryotische Zelle
beinhaltet unterschiedliche Zellorganellen. Zu den Zellorganellen gehören der Zellkern, die
Chloroplasten, Vakuolen und u.a. auch die Mitochondrien. Sie alle sind in das Cytoplasma
eingebettet. Wichtigstes Strukturelement sind Membranen aus Lipiden, die nicht nur
Protoplasten nach außen abgrenzen, sondern auch die Zellorganellen im Protoplasten
umschließen. Zellkern, Plastiden und Mitochondrien sind vom Cytoplasma durch eine
Doppelmembran abgegrenzt, die aus zwei Elementarmembranen besteht. Damit wird die
Regel erfüllt, daß auf der einen Seite der Membran eine cytoplasmatische, auf der anderen
eine lumenale (nicht lebende) Phase ist. Bei pflanzlichen Zellen nennt man die äußere
Zellwand Plasmalemma. Die innere Membran, die die zentrale Vakuole vom Cytoplasma
abgrenzt, Tonoplast. Bei tierischen Zellen fehlt im Gegensatz zu den pflanzlichen Zellen eine
Zellulose-Zellwand und die Vakuole.
Transportstudien finden fast ausschließlich am Plasmalemma und am Tonoplasten statt. Diese
bestehen wie alle Membranen aus einer Doppellipidschicht. Zwischen die Lipidmolekülen
sind verschiedene Transportmoleküle eingelagert, mit deren Hilfe der Stoffaustausch über die
Membran stattfindet (Fig. 2.1).
Fig. 2.1: Schema einer biologischen Membran.

Kapitel 2: Biologische Grundlagen und Patch-Clamp-Technik
2.1.2 Membran-Transport-Klassifizierung
Ionentransportprozesse können in verschiedene Gruppen eingeteilt werden, die sich durch die
Energiequellen für den Transport unterscheiden.
a) Passiver Transporter: Er ermöglicht den Transport von Ionen entlang eines Gradienten.
Die Triebkraft ist die Potentialdifferenz plus der Nernstspannung des Ions.
b) Pumpen: Sie können unter Aufwendung chemisch gespeicherter Energie Ionen gegen
Konzentrations- oder Potentialgradienten transportieren. Bei der Hydrolyse von ATP in ADP
wird eine Energie pro Molekül von ca. 450 meV frei, die für den Transport durch die
Membran benutzt wird (Hansen et al., 1981; Bowman und Bowman, 1986; Serranno, 1988).
c) Cotransporter: Sie transportieren eine Ionenart passiv durch die Membran, und die
gewonnene Energie wird für den Transport anderer Ionen verwendet. Der Transport beider
Ionenarten in die gleiche Richtung wird als Symport bezeichnet, in entgegengesetzter
Richtung als Antiport (Sanders et al., 1984). Der Gradient für das antreibende Ion wird
meistens durch Pumpen erzeugt.
2.1.3 Kanäle und Carrier
Neben der Klassifizierung nach der Energieversorgung gibt es eine nach dem
Mechanismus. Hier gibt es zwei Modelle für die Beschreibung der Transportmoleküle: Kanal
und Carrier.
Kanäle können als wassergefüllte Poren betrachtet werden, die die Lipiddoppelschicht
überbrücken (Fig. 2.1). Ihre Transportrate beträgt etwa 10 7 (Moleküle oder Ionen) pro
Sekunde (Läuger, 1980). Der Kanal kann sich öffnen und schließen, was mit Hilfe der Patch-
Clamp-Technik beobachtet werden kann (Abschnitt 2.2).
Carrier sind lipidlösliche Moleküle, die sich innerhalb der Membran frei bewegen und die
Ionen im Huckepackprinzip von einer Seite der Membran auf die andere schleusen. Sie
erreichen Transportraten von 10 2 bis 10 4 Molekülen oder Ionen pro Sekunde (Läuger, 1980).
Carrier sind auf molekularer Ebene noch nicht als intrinsische Membranproteine
gefunden worden. Deshalb werden viele Transporter, die früher als Carrier bezeichnet
wurden, heutzutage als Kanäle betrachtet. Carrier sind bisher nur bei biologischen
Kampfstoffen wie Valinomycin, die Pilze gegen Bakterien verwenden, nachgewiesen worden
(Mueller und Rudin, 1967).
2.1.4 Chara corallina
Chara corallina ist eine Süßwasseralge aus der
Familie der Characeen. Sie besteht aus Axialzellen
und Internodialzellen (Fig. 2.2). Die
Internodialzellen, die eine Länge bis zu 10 cm und
einen Durchmesser bis zu 1.2 mm haben, sind für
die elektrophysiologische Untersuchung von
Bedeutung. Die Internodialzelle besteht
hauptsächtlich aus der Vakuole, die vom
Tonoplasten begrenzt ist.
Aus Chara lassen sich sehr leicht
Protoplasmatropfen isolieren. Sie bilden sich am
4
Fig.2.2: Chara corallina.

Kapitel 2: Biologische Grundlagen und Patch-Clamp-Technik
Boden einer Petrischale, wenn man eine Charazelle mit der Schere aufschneidet und das
Cytoplasma ausströmen läßt. Die sich hierbei bildenden Tropfen sind von einer
Tonoplastenmembran umgeben (Lühring, 1986).
2.1.5 Aufbau eines Membranproteins
Membrankanäle bestehen aus vier bis sechs Makromolekülen. Sie bilden die Pore in der
Membran und lagern sich so zusammen, daß in der Mitte der Durchgang entsteht (Fig. 2.3b).
Bei spannungsgesteuerten Kaliumkanälen vom „Shaker-Typ“ sind es vier (Mac Kinnon,
1991). Die Makromoleküle bestehen aus sechs Segmenten (α Helices S1-S6), die die
Membran durchsetzen. Die Segmente werden durch lineare Aminosäuresequenzen
miteinander verbunden (Fig. 2.4a). Am bekanntesten sind zwei Funktionseinheiten, der
Selektivitätsfilter und der Spannungssensor.
Für die Selektivität des Kanals sind die entscheidenen Segmente die zwei β-sheet (ploops,
pore-loops), die die S5- und S6-Segmente brückenartig miteinander verbinden (Miller,
1991; Catterall, 1992) und in die Pore hineinragen. Die vier P-Loops der Makromoleküle
bilden in der Pore einen Ring mit ihren Bindestellen (Fig.2.3b). Die Unterscheidung zwischen
permeierenden und nicht permeierenden Ionen wird durch diese Bindungsstellen getroffen.
Sie können sehr deutlich unterscheiden zwischen ähnlichen Ionen wie Na + , K + , Tl + und Cs + .
Damit funktioniert der P-Loop als Selektivitätsfilter (Miller, 1991; Jan und Jan, 1992).
Die S4-Helix trägt positive Ladungen und ist für die Spannungsabhängigkeit des
Transportes zuständig. Die S4-Helix kann sich in der Membran im elektrischen Feld
verschieben. Dadurch wird der Kanal geöffnet oder geschlossen (Miller, 1991; Jan und Jan;
1992).
5

Kapitel 2: Biologische Grundlagen und Patch-Clamp-Technik
2.2 Die Patch-Clamp-Technik
6
Fig. 2.3a: Prinzipieller Aufbau eines
Kanalproteins (nach Pongs, 1992).
b: Bildung der Pore aus S5- und S6-
Segmenten. Im Zentrum der Pore liegen
die P-Loops, die die selektive Öffnung
bilden.
Die Technik der Patch-Clamp-Messungen wurde von Sakman und Neher entwickelt
(Neher und Sakman, 1976). Dabei wird der Strom durch eine sehr kleine, wenige µm 2 große
Fläche (patch) der Membran mit nur wenigen Kanälen gemessen, an die eine vorgegebene
Spannung (clamp) angelegt wird. Der gemessene Strom liegt in der Größenordnung einiger
Picoampere (pA). Um einen sehr kleinen Abschnitt der Zellmembran (patch) elektrisch von
seiner Umgebung zu isolieren, muß man eine sehr dichte Verbindung zwischen der
Zellmembran und dem Rand einer Glaspipette schaffen. Die Pipette als Meßelektrode wird
auf die Zelloberfläche aufgesetzt und ein leichter Unterdruck erzeugt, so daß die Membran
etwas in die Pipette hineingezogen wird. Der Abstand zwischen den Lipiden der Membran
und dem Glas ist weniger als 1 nm (Corey und Stevens, 1983). Die Wasserstoffbrücken,
Salzbrücken, Ca + -Brücken und Van der Waals-Kräfte sind verantwortlich für die Dichte des
Seals (Corey und Stevens, 1983; Ophasi und Webb, 1994). Liegt der Kriechwiderstand
zwischen Glas und Membran im Bereich einiger Gigaohm (um die 10 GΩ), wird diese
Versiegelung als Gigaseal bezeichnet. Nachdem sich ein solches Gigaseal gebildet hat, kann
man für verschiedene Spannungen über der Membran den Strom mit einem Patch-Clamp-
Verstärker messen (siehe Abschnitt 6.5).
2.2.1 Patchkonfigurationen
Es gibt vier wichtige Konfigurationen der Patch-Clamp-Technik (Fig. 2.4):
a) Cell-Attached: Man setzt die Pipette auf die Membran, ohne daß die Verbindung zur
Gesamtzelle abreißt. Der große Vorteil ist, daß während der Messung die Zelle intakt bleibt,
so daß die Funktion des Ionenkanals unter physiologischen Bedingungen untersucht werden
kann. Der Nachteil dieser Konfiguration ist, daß die Membranspannung am Patch unbekannt
ist, da die Spannung zwischen Zellinnerem und Badlösung in Serie im Meßpfad liegt. Diese
Technik gibt auch keine genaueren Informationen über die Ionenzusammensetzung im Inneren
der intakten Zelle.
b) Excised / Inside-Out: Durch das ruckartige Wegbewegen der Pipette kann, ohne daß
hierdurch die hohe Abdichtung des Patches verloren geht, der Patch aus der Zelloberfläche
herausgerissen werden. Bei dieser Konfiguration liegt der Patch mit der cytosolischen Seite

Kapitel 2: Biologische Grundlagen und Patch-Clamp-Technik
der Membran (inside) in der Meßlösung (out). Dadurch ist es möglich, die Funktion des
Ionenkanals unter genau definierten Bedingungen zu untersuchen. Als weiteren Vorteil dieser
Konfiguration erhält man die genaue Kenntnis des Membranpotentials sowie die Wählbarkeit
der Lösungen auf beiden Seiten der Membran.
c) Whole-Cell: Bei dieser Konfiguration wird die Membran unter der Pipette entweder
durch mechanisches Saugen oder durch einen elektrischen Strom aufgerissen, so daß eine
direkte Verbindung zwischen Pipette und Cytosol geschaffen wird. Bei dieser Methode kann
man den Strom über die gesamten Membran messen. Dies ist der klassischen Technik mit
Einstichelektroden äquivalent und wird angewendet, wenn die Zelle zu klein für die
Einstichelektrodentechnik ist.
d) Excised / Outside-Out: Outside-out ist eine weitere seltene Art des excised-patches.
Die Vorgehensweise ist wie beim inside-out, es entsteht aber aus der whole-cell-
Konfiguration. Ob die inside-out- oder die outside-out-Konfiguration gewählt wird, ist
abhängig von dem Wunsch, welche Seite der Membran in Verbindung zur Badlösung
gebracht werden soll.
Fig. 2.4: Die vier unterschiedlichen Konfigurationen der Patch-Clamp-Technik (Hille, 1992).
7

3 Der anomale Molfraktionseffekt
Unter dem anomalen Molfraktionseffekt (AMFE) versteht man folgendes Phänomen: Die
Einzelkanalleitfähigkeit durchläuft als Funktion des Verhältnisses der Konzentration von zwei
Ionenarten ein Extremum, wobei die Gesamtkonzentration konstant gehalten wird (Hille,
1992).
3.1 Bisherige Meßergebnisse
Der anomale Molfraktionseffekt wurde sowohl bei tierischen als auch bei pflanzlichen
Membranen beobachtet. Im folgenden werden die Ergebnisse des AMFEs in erster Linie bei
pflanzlichen Zellen und bei einer Mischung von K + und Tl + vorgestellt.
3.1.1 Ergebnisse von Hagiwara
Hagiwara et al. (1977) beobachteten den AMFE an Eizellen des Fisches Mediastera
aequalis bei externem Lösungswechsel. Die Lösung bestand aus einer Mischung von K + und
Tl + mit einer Gesamtkonzentration von 25 mM. Das Minimum der Abhängigkeit der
Leitfähigkeit von der Konzentration, die sich bei verschiedenen Spannungen verschiebt, ist
bei der reinen K + -Konzentration dichter als bei der Tl + -Konzentration (Fig. 3.1).
Fig. 3.1: Membranleitfähigkeit an Eizellen des Fisches Mediastera aequalis in einer Mischlösung von
K + - und Tl + -Ionen. Der Tl + -Anteil im Verhältnis zur Gesamtkonzentration variiert zwischen 0 und 1. Die
Leitfähigkeit geht durch das Minimum (Hagiwara et al., 1977).

Kapitel 3: Der anomale Molfraktionseffekt
Hagiwara erklärte den AMFE mit Hilfe eines Modells mit zwei Bindestellen (Hille und
Schwarz, 1978). Somit wurde der AMFE als Beweis für das Multi-Ion-Porenmodell gesehen.
Die verschiedenen Modelle für die Ionenkanäle werden in Kapitel 4 erklärt.
3.1.2 Ergebnisse von Draber
Draber et al. (1991) untersuchten den AMFE an cytoplasmatischen Tropfen der Alge
Nitella. Draber (1990) arbeitete in der cell-attached Konfiguration und hatte eine Mischung
aus K + und Tl + im Bad und in der Pipette. Die Gesamtkonzentration betrug 150 mM.
Fig 3.2 zeigt die Abhängigkeit des Einzelkanalstroms vom Tl + /(Tl + +K + )-Verhältnis.
Draber versuchte zu entscheiden, ob der AMFE auf schnelles Schalten (Gating) oder auf einen
Multi-Ion-Poren-Mechanismus zurückzuführen sei. Ersteres würde für das enzymkinetische
Modell mit „lazy-state“ sprechen und einen Effekt der Öffnungswahrscheinlichkeiten
beinhalten. Bei der von Draber (1990) benutzten Filterfrequenz von 1 kHz konnte das jedoch
nicht entschieden werden.
Fig. 3.2: Der anomale Molfraktionseffekt an den Grünalge Nitella fexilis bei Draber (1990).
Dennoch ergaben sich Hinweise auf einen Gating-Mechanismus:
Die Strom-Spannungskurven (Fig. 3.3) zeigen ein „Drehverhalten“. Der Strom der
gemischten Lösung ist in allen Spannungsbereichen unter dem der reinen Lösungen. Dieser
Effekt konnte nicht mit dem Multi-Ion-Porenmodell erklärt werden, weil es den AMFE nur
innerhalb eines begrenzten Spannungsbereiches erklären konnte (Schultze, 1990; Draber et
al., 1991). Draber et al. (1991) versuchte, das Drehverhalten mit Hilfe des enzymkinetischen
Modells mit „lazy-state“ (Hansen et al., 1981, 1983) zu beschreiben. Die Hypothese war, daß
der Detektor dem Einzelereignis nicht mehr folgen kann, und die Verminderung der
Leitfähigkeit in der gemischten Lösung auf das Mitteln über unentdecktes schnelles Schalten
zurückzuführen sei. Es ist möglich, daß bei einer Filterfrequenz von 1 kHz dieses
hypothetische Schalten nicht beobachtet werden kann.
9

Kapitel 3: Der anomale Molfraktionseffekt
Fig. 3.3: Effekt von Tl + auf die Strom-Spannungskurven (Draber et al., 1991). Die Kreise stellen die
Spannungsabhängigkeit des Kaliumkanalstroms ohne Thallium in der Lösung dar. Die Dreiecke zeigen die
Strom-Spannungskurve bei einer Tl + -Konzentration von 75 mM. Die Quadrate zeigen die Strom-Spannungskurve
bei reiner Tl + -Konzentration. Der Strom der gemischten Lösung ist in allen Spannungsbereichen unter dem der
einzelnen Lösungen.
3.1.3 Ergebnisse von Albertsen
Albertsen (1994) versuchte, das hypothetische schnelle Schalten mit einem höheren
zeitlichen Auflösungsvermögen zu finden. Er führte Untersuchungen an Chara corallina mit
K + /Tl + -Lösungen durch. Die Gesamtkonzentration war wieder 150 mM. Albertsen (1994) maß
an excised-patches und führte einen einseitigen Lösungsaustausch im Bad durch. Die
Filterfrequenz betrug 20 kHz bei einer Abtastfrequenz von 100 kHz.
Es trat noch immer eine Reduzierung des scheinbaren Einzelkanalsstromes auf. Die
Ergebnisse sind in Fig 3.4 dargestellt. Es wurde für negative Spannung ein Maximum im
Betrag des Einzelkanalstoms beobachtet, welches in den anderen Untersuchungen (z.B.
Keunecke, 1995) nicht bestätigt werden konnte.
Albertsen beobachtete zusätzlich noch Sublevel. Sublevel sind Unterleitfähigkeitsstufen,
d.h. der Kanal leitet, ohne das volle Stromniveau zu erreichen. Er konnte mit Hilfe des
Sublevel-Hinkley-Detektors (Draber und Schultze, 1994b) nachweisen, daß es sich nicht um
Einzelkanäle mit unterschiedlichen Leitfähigkeiten, sondern um Sublevel eines Kanals
handelt. Bei Albertsen (1994) stand jedoch nicht der AMFE im Vordergrund, sondern die
Entwicklung eines Verfahrens des direkten Fits der Zeitreihe aufgrund von Hidden-Markov-
Modellen (Albertsen und Hansen, 1994). Deshalb sind nur wenige Messungen zum AMFE
durchgeführt worden. Das führte dazu, daß Keunecke (1995) die Untersuchung mit hohem
Zeitauflösungsvermögen wiederholte.
10

Kapitel 3: Der anomale Molfraktionseffekt
Fig. 3.4: AMFE gemessen von Albertsen (1994) an Chara corallina.
3.1.4 Ergebnisse von Keunecke
Keuneckes (1995) Versuchsbedingungen waren denen von Albertsen (1994) ähnlich. Es
wurden an Chara corallina Messungen mit einem einseitigen Lösungsaustausch im Bad
durchgeführt. Dieser Lösungsaustausch wurde mit einer Spülung durchgeführt. Dadurch sind
an einem Patch alle Konzentrationen einer Meßreihe durchgemessen worden. Die
Gesamtkonzentration ist wie bei Draber (1990) und Albertsen (1994) 150 mM. Die
Filterfrequenz war mit 50 kHz bei einer Abtastrate von 200 kHz größer als bei Draber (1990)
und Albertsen (1994). Sie wurde so hoch gewählt, um das hypothetische schnelle Schalten zu
erkennen.
Trotz der hohen Zeitauflösung wurde der AMFE wieder im scheinbaren Einzelkanalstrom
gemessen (Fig 3.5A). Das Minimum der Leitfähigkeit lag bei 5 bis 10 mM Tl + -Konzentration
und war bei höheren Spannungswerten stärker ausgeprägt. Keunecke (1995) fand den AMFE
für positive und negative Spannungen trotz einseitiger Tl + -Gabe. Die Lage der minimalen
Leitfähigkeit war spannungsunabhängig (Fig. 3.5A). Die Strom-Spannungskurve für das Tl + /
K + -Gemisch liegt betragsmäßig sowohl unterhalb der reinen Thallium-Kurve als auch unter
der reinen Kalium-Kurve (Fig. 3.5B). Das Auftreten bei positiver und negativer Spannung war
auch das Hauptargument bei Draber et al. (1991), um die Erklärung des AMFEs durch das
Hille-Schwarz-Modell (1978) zu widerlegen. Damit wurde ebenfalls das Hille-Schwarz-
Modell mit diesen genaueren Messungen widerlegt.
11

Kapitel 3: Der anomale Molfraktionseffekt
Fig 3.5A) Der anomale Molfraktionseffekt an der Grünalge Chara Corallina bei verschiedenen
Spannungen (Keunecke, 1995). Thallium wurde im Bereich von 0 bis 150 mM variiert. Die Messungen zeigen
eine Symmetrie bzgl. der Nullinie. Die Lage des Minimums bleibt im Bereich von 10 mM Thalliumkonzentration
für verschiedene Spannungen erhalten.
B) Strom-Spannungskurven für verschiedene Thallium-Konzentrationen (0 mM Tl + , 10 mM Tl + , 150
mM Tl + ) (Keunecke, 1995). Der Strom der gemischten Lösung ist in allen Spannungsbereichen unter den
einzelnen Lösungen.
Keunecke (1995) versuchte, für die Klärung des AMFEs den Ansatz des Wu-Modells zu
verwenden (Abschnitt 4.4). Doch das Wu-Modell konnte die Konzentrationsabhängigkeit nur
für positive Spannungen fitten (Fig. 3.6). Bei positiver Spannung und geringer
Thalliumkonzentration fiel der Einzelkanalstrom und lag wie bei den Messungen (Keunecke,
1995) sehr dicht an der reinen Kaliumkonzentration. Das bedeutet, daß bei Zugabe von
geringeren Mengen des blockierten Ions der Effekt der Stromreduzierung am größten ist. Bei
negativer Spannung stimmten die Fitergebnisse nicht mit den Meßwerten überein (Fig. 3.6).
Beim Cs + -Block (Draber und Hansen, 1994) und beim Na + -Block (Blunck, 1996) konnte
unentdecktes schnelles Schalten als Ursache für die scheinbare Reduktion des
Einzelkanalstromes nachgewiesen werden.
12

Kapitel 3: Der anomale Molfraktionseffekt
Der Hinweis in den Daten von Keunecke (1995) gab den Ausschlag, die Suche zu
intensivieren, ob nicht etwas ähnliches beim AMFE vorliegt.
Fig. 3.6: Kurvenverlauf des Wu-Modells für unterschiedliche Spannungen. Für negative Spannungen zeigen
die berechneten Kurven keinen AMFE mehr (Keunecke, 1995).
13

4 Modelle für die Beschreibung der Transportvorgänge
in Membrankanälen
Für die Beschreibung der Funktionsweise von Kanälen werden mathematische und
physikalische Modelle angewendet, die den Mechanismus des Transportes der Ionen durch
den Kanal erklären. Eine grundsätzliche Unterscheidung ist die in Gating- und Permeationsmodelle
(Hansen et al., 1997). Permeationsmodelle beschreiben den Transport eines einzelnen
Ions durch den Kanal. Gating-Modelle beschäftigen sich mit der Unterbrechung des Stroms
permeierender Ionen durch Übergänge zwischen aktiven und inaktiven Zuständen des Kanals.
Hier gilt das besondere Interesse den Modellen, die die mechanische Erklärung des AMFEs
zum Ziel haben.
4.1 Markov-Modelle
Markov-Modelle sind formale Gating-Modelle, die das Schaltverhalten der Kanäle durch
Übergänge zwischen diskreten offenen und geschlossenen Zuständen beschreiben. Ziel der
Analyse ist die Ermittlung der Anzahl von „open“ und „closed“ Zuständen, ihre Anordnung
zueinander und der Ratenkonstanten kij (Übergangswahrscheinlichkeit von Zustand i in
Zustand j).
Für eine stochastische Betrachtung der Schaltvorgänge der Kanäle auf der Grundlage
eines Markov-Modells gibt es zwei einfache Voraussetzungen. Eine der Voraussetzungen ist,
daß das System kein Gedächtnis hat. Das bedeutet, daß ein Übergang von einem Zustand in
einen anderen nicht von vorherigen Übergängen abhängt. Die andere Voraussetzung ist, daß
die kij nicht von der Besetzung der Zustände abhängig ist (Linearität des Systems, Colquhoun
und Hawkes, 1977).
Das Verhalten dieses Modells wird durch ein System von Differentialgleichungen erster
Ordnung beschrieben, das durch eine Exponentialfunktion gelöst wird.
dP(
t)
= P(
t)
⋅K
dt
P =
(4.1)
Kt
( t)
e
(4.2)
Die Elemente des Vektors P(t) sind die Besetzungswahrscheinlichkeiten jedes einzelnen
Zustandes, und die Matrix K bildet sich aus den Ratenkonstanten kij.
Für die Beschreibung der Aufenthaltszeiten in einem Zustand des Markov-Modells wird
meistens eine Summe von Exponentialfunktionen benötigt (Colquhoun und Hawkes, 1977).
Wenn mehrere Zeitkonstanten vorkommen, existieren mehrere Zustände, die voneinander
unabhängig sind.

Kapitel 4: Modelle für die Beschreibung der Transportvorgänge in Membrankanälen
Mit Hilfe dieses Markov-Modells können stochastische Betrachtungen über das
Schaltverhalten der Kanäle gemacht werden.
4.2 Multi-Ion-Single-File-Modell
Bei diesem Permeationsmodell wird der Kanal als Pore betrachtet. In dem
Vorläufermodell von Hille (1975) wird von einem Ion ausgegangen, das die Pore durchqueren
darf. Das bedeutet, daß sich nicht mehr als ein Ion im Kanal aufhält. Weil dieses einfache
Modell für die Beschreibung der Eigenarten einiger Messungen nicht ausreichte, wurde das
Multi-Ion-Single-File-Modell von Hille und Schwarz (1978) vorgeschlagen und von anderen
weiter modifiziert (siehe Urban und Hladky, 1979).
Als erstes wird angenommen, daß mehrere Energiebarrieren im Kanal existieren (Fig.
4.1), so daß zwei Ionen sich gleichzeitig im Kanal befinden dürfen (Multi-Ion), aber nicht
einander passieren können (Single-File). Dieses bedeutet, daß die Wahrscheinlichkeit groß ist
daß mehrere Zustände gleichzeitig besetzt sein können. Die Energiebarriere für den Wechsel
von Bindungstelle zu angrenzendem Außenmedium ist höher als die zwischen den beiden
Bindungstellen (Fig. 4.1). Die Ionen innerhalb des Kanals zeigen eine gegenseitige
Abstoßung.
Fig. 4.1: Energieprofil eines Kaliumkanals im Multi-Ion-Single-File-Modell (Hille und Schwarz, 1978).
Es gibt mehrere Bindungsstellen (in der oberen Fig. 2 bzw. 3 Bindungsstellen), die jeweils von einem Ion besetzt
werden können.
Der AMFE entsteht durch Wechselwirkungen zwischen den besetzten Zuständen.
Wichtig ist, daß das Tl + -Ion für das Eintreten in den Kanal eine kleinere Barriere überwinden
muß. Es wird zum Beispiel angenommen, daß ein K + -Ion eine Bindungsstelle im Kanal
besetzt. Dieses K + -Ion kann für eine längere Zeit dort verweilen, weil die Energiebarriere nach
außen hoch ist. Es bewegt sich erst dann nach außen, wenn ein weiteres Ion in den Kanal
springt und mit dem ersten in eine elektrische Wechselwirkung tritt. Wenn das zweite Ion ein
Tl + -Ion ist, ist es wahrscheinlicher, aus dem Kanal herausgeworfen zu werden, anstatt das K +
nach außen zu drücken. Es gibt einen Transport mit einer Wahrscheinlichkeit unter 50%.
Wenn das zweite Ion ein K + ist, wird die Wahrscheinlichkeit für das erste K + , den Kanal zu
15

Kapitel 4: Modelle für die Beschreibung der Transportvorgänge in Membrankanälen
verlassen, unter symmetrischen Bedingungen 50% sein. Somit tritt mit 50%
Wahrscheinlichkeit Transport auf.
Wenn nur Tl + vorhanden ist, liegt wieder ein symmetrischer Fall wie beim reinen K + vor.
Der Strom kann sogar etwas höher sein, weil die niedrigeren Energiebarrieren eine höhere
Einsprungrate ermöglichen.
Einfach ausgedrückt besagt das Hille-Schwarz-Modell, daß bei einer gleichen
Bindungsenergie sich die Ionen leichter verdrängen als bei unterschiedlichen
Bindungsenergien. Das ist die Ursache, weshalb bei einer Mischung von Ionen in der Lösung
der Strom des Kanals abnimmt.
Für das Austreiben eines Ions durch ein zweites gibt es ein bemerkenswertes Experiment
von Baukrowitz und Yellen (1996): Bei Abwesenheit eines zweiten kommt das letzte Ion mit
großer zeitlicher Verzögerung aus dem Kanal.
Ein wichtiges Argument gegen das Multi-Ion-Single-File-Modell brachten Draber et al.
(1991). Sie beobachteten eine symmetrische Drehung der Stromspannungskurven in
Abhängigkeit von der Tl + /K + -Mischung und zeigten, daß das Hille-Schwarz-Modell (1978)
einen verminderten Strom in Mischlösungen nur für einen begrenzten Spannungsbereich
darstellen kann. Draber et al. (1991) schlugen ein enzymkinetisches Gating-Modell (Hansen et
al. 1981, 1983) mit nur einer Energiebarriere, aber einem lazy-state vor.
Fig. 4.2: Das Zustandsmodell des Multi-Ion-Single-File-Modells (Draber et al. 1991). Es existieren bei
dem oberen Modell zwei Bindungsstellen, die jeweils von einem Ion (K + oder Tl + ) besetzt werden. Bei einem
Transportzyklus werden entweder ein (5-4-2-5) oder zwei Ionen (5-4-1-2-5) durch den Kanal transportiert.
16

Kapitel 4: Modelle für die Beschreibung der Transportvorgänge in Membrankanälen
4.3 Das enzymkinetische lazy-state-Modell
In diesem Gating-Modell wird der Kanal als ein großes Molekül, das wie ein Enzym mit
den Ionen reagiert, betrachtet (Läuger, 1980, 1985, Hansen et al., 1981, Eisenberg 1990).
Gating, also Ein- und Ausschalten des Transportes, wird durch einen sogenannten lazy-state
(Hansen et al., 1983) eingeführt.
Der lazy-state, den Draber et al. (1991) für den K + -Kanal in Nitella flexilis eingeführt
haben, wird durch eine weitere Bindungsstelle für das Kaliumion kontrolliert (rechte Delle am
Kanalsymbol, z.B. beim Zustand "4" in Fig. 4.3). Wenn das Kaliumion an diese Bindungstelle
bindet (Übergang 4 - 5 in Fig. 4.3), erhöht sich die Selektivität in K + . K + wird weiterhin
transportiert (Zyklus 3 - 8 - 9 - 3 in Fig. 4.3), doch Tl + überführt den Kanal in den lazy-state 7.
Wenn der Kontroll-Zustand nicht besetzt ist (Zustände 1 bis 6 in Fig. 4.3), können Tl + und K +
gleichermaßen transportiert werden.
Nach diesem Modell wird erwartet, daß die Wahrscheinlichkeit für den Durchgang der
Ionen durch den Kanal abnimmt, wenn die Offenwahrscheinlichkeit des Kanals in einer
Mischlösung aus K + und Tl + im Verhältnis zu einer reinen Lösung aus K + untersucht wird.
Der Einzelkanalstrom sollte dann unabhängig von der K + /Tl + -Mischung sein. Diese
Eigenschaft des Modells wurde jedoch durch die Messungen von Draber et al. (1991) nicht
bestätigt. Zunächst scheint, daß deshalb dieses Modell nicht richtig sein kann. Doch es besteht
die Möglichkeit, daß die Übergänge 3-7 in Fig. 4.3 so schnell sind, daß sie aufgrund einer
beschränkten zeitlichen Auflösung nicht erkannt werden, was auch Inhalt der vorliegenden
Arbeit ist. Dann wäre die gemessene Reduzierung des Einzelkanalstromes nur eine
scheinbare, da sie durch die Mittelung im Detektorfilter über einen konstanten, aber schnell
schaltenden Einzelkanal entstanden sein könnte. Dann würde das Modell mit den gemessenen
Daten übereinstimmen.
Fig 4.3: Das enzymkinetische lazy-state-Modell für den AMFE mit den von Draber et al. (1991) ermittelten
Ratenkonstanten für den Transport von K + oder Tl + . Es gibt eine allosterische Bindestelle für das K + (Delle am
Kanalschema von Zustand 4). Ist diese Bindestelle nicht besetzt, kann sowohl K + als auch Tl + transportiert
werden (4-1-2 bzw. 4-5-6). Bei einer Besetzung der allosterischen Bindestelle mit K + und der
Transportbindungstelle mit Tl + geht der Kanal in den Zustand 7 (lazy-state). Tl + kann nicht transportiert werden.
Der K + -Transport geht dagegen im Zyklus 3 - 9 - 8 weiter. Die Ratenkonstanten sind in Einheiten von 10 7 s -1
gegeben.
17

Kapitel 4: Modelle für die Beschreibung der Transportvorgänge in Membrankanälen
4.4 Wechselwirkungsmodell von Wu
Das Wechselwirkungsmodell von Wu (1991, 1992) ist ein Permeationsmodell und geht
von einem Selektivitätsfilter aus, das mit verschiedenen Ionen unterschiedlich wechselwirkt.
Dabei gelten für das Modell folgende Voraussetzungen:
Der Selektivitätsfilter liegt in der Pore mit nur einer Bindestelle, die aus symmetrisch
geordneten Carbonylgruppen (C und O) besteht (Fig. 4.4). Ein Teil der Wassermoleküle wird
von den Ionen während des Eintritts in den Kanal getrennt. Es kann ein weiteres Ion (B) in
den Kanal eintreten, wenn ein Ion (A) an der Bindestelle des Selektivitätsfilters gebunden ist
(Fig.4.4). Es treten dann zwischen den Ionen die Coulombwechselwirkungen auf. Das zweite
Ion überträgt die kinetische Energie im Stoß auf das gebundene Ion. Nach den Stoßgesetzen
erhält man den Energieübertrag zwischen den Ionen:
m m
= (4.3)
A B
EB c E 2 0 A
( mA
+ mB
)
mA und mB: Massen von Ion (A) und Ion (B)
c = Konstante
EB = Übertragungsenergie zwischen Ion (A) und Ion (B)
E0A = Anfangsenergie von Ion (A)
Bei gleicher Masse ist die übertragene Energie am größten, womit auch die
Wahrscheinlichkeit, daß EB größer als die Bindungsenergie ist, zunimmt. Das gebundene Ion
kann somit aus dem Selektivfilter herausgeschlagen werden. Bei einer großen Abweichung
des Verhältnisses der Massen von eins nimmt die Wahrscheinlichkeit zu, daß die
Energiebarriere nicht mehr überwunden werden kann und ein Block entsteht. Das bedeutet,
daß der Stromfluß sehr stark abhängig von den Ionen ist, die miteinander in Wechselwirkung
treten. Bei unterschiedlichen Ionen nimmt somit die Wahrscheinlichkeit des Stromflusses ab
im Vergleich zu dem bei gleicher Ionenart.
Fig. 4.4: Wechselwirkungsmodell von Wu (nach Wu, 1991)
C: Kohlenstoff der Carbonylgruppe
O: Sauerstoff der Carbonylgruppe
A: Ion, gebunden an den Selektivfilter
B: Ein weiteres Ion gelangt in den Kanal, welches mit Ion A in Wechselwirkung tritt
W: Wassermoleküle, die mit Ion A in Wechselwirkung treten
18

Kapitel 4: Modelle für die Beschreibung der Transportvorgänge in Membrankanälen
Dieser Wirkungsmechanismus ist dem des Hille-Schwarz-Modells nicht unähnlich. Auch
dort ist die Verdrängung durch ein zweites Ion für den Transport notwendig. Hier ist es die
Übertragung kinetischer Energie, dort die elektrostatische Abstoßung im Kanal mit zwei
Bindungstellen. Der AMFE entsteht in beiden Fällen aus der größen
Verdrängungswahrscheinlichkeit bei gleichen Ionen.
Der von Wu (1992) betrachtete Mechanismus ist noch etwas komplizierter als hier dargestellt,
weil die Wechselwirkungen zwischen dem Ion und den Wasserdipolen im Kanal sowie dem
Ion mit dem extern angelegten elektrischen Feld berücksichtigt werden.
Wie gut dieses Modell ist, wurde in der Arbeit von Keunecke (1995) für den anomalen
Molfraktionseffekt untersucht (siehe Abschnitt 3.1.4).
19

5 Veränderung des Schaltverhaltens beim Block
durch Metallionen
Bei einer Reduzierung des Gesamtstroms unter physiologischen Ruhebedingungen spricht
man vom Blockieren eines Kanals. Es wird zwischen Blockieren von Kanälen durch Kationen
(H + , Alkali und Erdalkali) und durch Proteine (z.B. Kaliotoxin, Margatoxin) (Aiyar et al.,
1995) unterschieden. Die Kationen halten sich zumeist in der cytosolischen und vacuolären
Lösung auf und stehen mit dem transportierten Ion in Konkurrenz. Die blockierten Proteine
binden sich an ein bestimmtes Kanalprotein und blockieren den Kanal. In dieser
Arbeitsgruppe sind bislang die Blockierungen durch die Kationen Cs + , Na + und Tl + untersucht
worden. Hansen et al. (1997) vermuten, daß die unterschiedlichen Effekte durch die
Metallionen alle auf demselben Mechanismus beruhen. Dies ist die Bindung an die gleiche
Stelle im Kanal, wobei die beobachteten Phänomene von der Art des blockierenden Ions
abhängen. In allen Fällen wird angenommen, daß dieser Block zu dem im folgenden
beschriebenen schnellen Schalten führt.
5.1 Veränderung der Leitfähigkeit durch schnelles Schalten
Fig. 5.1: Darstellung des Blocks bei unterschiedlichen Blockgeschwindigkeiten (Blunck, 1996).
Permeations- und Gating-Modelle (Hansen et al., 1997) behandeln ganz unterschiedliche
Phänomene. Die Entscheidung, welche Art der Modelle angewendet werden muß, kann
schwierig werden, wenn in der Untersuchung „schnelles Schalten“ (Flickern) auftritt.
Unzureichendes Auflösungsvermögen führt zu Informationsverlust.
In Fig. 5.1 werden Daten mit unterschiedlichen Blockierungsdauern gezeigt. Beim
langsamen Block gibt es keine Änderung des Stromniveaus, sondern nur eine Veränderung
der Offenwahrscheinlichkeit im Vergleich zum unblockierten Kanalzustand. Der Verlauf des
Blocks (Geschlossenzeiten) ist gut erkennbar.

Kapitel 5: Veränderung des Schaltverhaltens beim Block durch Metallionen
Beim mittleren Block kann das Auftreten von Bursts erkannt werden. Diese sind kurze
Schließungen (Gaps) innerhalb einer Offenperiode. Es kann zu einer Reduzierung des
gemessenen (scheinbaren) Stromniveaus durch Mittelung im Tiefpaß des Meßsystems führen.
Solange das Auflösungsvermögen des Aufnahmesystems noch ausreicht, hat das
Burstverhalten keine Auswirkungen auf die gemessene Größe der Leitfähigkeit des
Einzelkanals. Es verändert sich nur das Schaltverhalten. Bei Messungen am whole-cell-Patch
führen die Effekte von Fig. 5.1a und b auf eine flachere Kennlinie und einen geringeren
Sättigungsstrom. Dies wird durch die Ensemblemittelung über die vielen verschiedenen
Kanäle verursacht. Je weniger Kanäle pro Zeiteinheit geöffnet sind, desto weniger Ionen
kommen durch und der resultierende Gesamtstrom pro Zeiteinheit nimmt ab.
In Fig. 5.1c schließlich ist das Schalten so schnell, daß auch in der Einzelkanalmessung
eine Stromreduzierung durch zeitliche Mittelung auftritt. Der Effekt in Fig. 5.1c wird durch
Betrachtung der Antwort des Verstärkers bei Kanalöffnungen mit unterschiedlichen Längen
(Fig. 5.2) illustriert. Die Daten werden in äquidistanten Zeiten abgetastet. Bei langsamen
Ereignissen (links in Fig. 5.2) erreicht der Großteil der Abtastpunkte den korrekten Wert des
Einzelkanalstroms. Es werden auch die Dauer und die Anzahl der Ereignisse richtig erkannt.
Wenn die Länge eines Ereignisses kürzer wird, nehmen mehr und mehr Abtastpunkte Werte
an, welche tiefer liegen. Bei der Konstruktion des Amplitudenhistogramms dieser Daten
werden die Peaks breiter. Man erhält ein sehr viel stärkeres Rauschen. Die
Amplitudenverteilung wird zur Betaverteilung. Es ist möglich, die schnellen Ratenkonstanten
aus diesen Betaverteilungen zu bestimmen (Rießner, 1994; FitzHugh, 1983; Yellen, 1984).
Im Falle des schnellen Flickerns (rechts in Fig. 5.2) genügt die Auflösung des Detektors
nicht mehr, um das volle Stromniveau zu erreichen. Es erscheint ein scheinbarer
Unterniveaustrom mit einem Wert, der vom Verhältnis der Offen- und Geschlossenzeiten
abhängig ist. Es wird ein scheinbarer Einzelkanalstrom mit einer kleineren Amplitude
erhalten. Permeations- und Gating-Modelle können bei dieser Auflösung nicht mehr
unterschieden werden. Bei einer nicht ausreichenden Auflösung können beide Modelle zu
einer Reduzierung des Einzelkanalstroms führen. In dieser Arbeit soll untersucht werden, ob
eine nicht ausreichende Auflösung ein Permeationsmechanismus (Wirkung auf den
Einzelkanalstrom) beim AMFE vortäuscht.
Fig. 5.2: Darstellung der Reduzierung des Einzelkanalstroms verursacht durch schnelles Schalten. Die
Kreuze sind die Abtastwerte. „f“ kennzeichnet das volle Niveau und „s“ die scheinbare niedere Leitfähigkeit
(Hansen et al., 1997).
21

Kapitel 5: Veränderung des Schaltverhaltens beim Block durch Metallionen
5.2 Reduzierte scheinbare Leitfähigkeit bei der Cs + -Blockade des
K + -Kanals
Es gab bis zu den Messungen von Draber (1994) keine Möglichkeit, den schnellen
Übergang zwischen den leitfähigen und den durch Cs + blockierten Zuständen des Kanals
aufzulösen. Ältere Untersuchungen des Cs + -Blocks maßen die Cs + -bewirkte Reduzierung nur
an gemittelten Strömen (whole-cell-Messungen) und konnten deshalb die Funktion des
Blockes nicht darstellen (Tester, 1988). Klieber und Gradmann (1993) benutzten die Theorie
der Betaverteilung (Rießner, 1994; FitzHugh, 1983; Yellen, 1984), um aus der Verzerrung der
Amplitudenhistogramme die nicht aufgelösten kurzen Blockereignisse als Ursache für die
Abnahme des Einzelkanalstroms nachzuweisen. Alle diese Untersuchungen konnten die
Reduktion des Einzelkanalstroms durch schnelles Schalten zwischen dem blockierten und
unblockierten Zustand nicht abschließend beweisen.
Erst bei den Messungen von Draber und Hansen (1994) an Chara corallina in der
excised-patch Konfiguration (Abschnitt 2.2.1) wurde der Blockierungseffekt von Cs + im
Einzelkanalstrom von Kalium-Kanälen, welcher zu einer Abnahme des Einzelkanalstroms bei
einer Abtastrate von 5 kHz im negativen Membranspannungsbereich führte, mit einer
Abtastrate von 100 kHz nicht mehr beobachtet (Fig. 5.3). Der Anti-Aliasingfilter wurde auf 20
kHz erhöht, und es wurde auch ein Higher-Order-Hinkley-Detektor (HOHD) als
Sprungdetektor benutzt (Abschnitt 6.9.2, Schultze und Draber, 1993). Weiterhin wurde noch
eine neue missed-events Korrektur eingeführt (Draber und Schultze, 1994a).
Durch die bessere zeitliche Auflösung wurde beobachtet, daß der Einzelkanalstrom beim
Cs + -Block nicht abnimmt, sondern bei den niederfrequenten Messungen eine scheinbare
Einzelkanalstromreduktion nur durch einen Tiefpaßeffekt des Meßsystems vorgetäuscht
wurde. Bei schnellem Abtasten wurde bei dem Einzelkanalstrom kein Unterschied zwischen
dem blockierten und unblockierten Kanalzustand beobachtet (Fig. 5.3). Stattdessen zeigte sich
die Blockierung in einer Veränderung der meßbaren Ratenkonstanten.
Fig. 5.3: Strom-Spannungskurven erhalten vom K + -Kanal in Chara in Anwesenheit von Cs + . Es wurde
mit Abtastraten von 5 kHz oder 100 kHz gemessen (Draber und Hansen, 1994, Hansen et al. 1997).
Die Spannungsabhängigkeit der Übergangsratenkonstanten in und aus dem blockierten
Zustand konnte mit den folgenden Gleichungen genähert werden.
22

Kapitel 5: Veränderung des Schaltverhaltens beim Block durch Metallionen
k
k
gap−open
open−
gap
= 68.
6s
=
−1
[ Cs
−
43900s 1
⎛
] exp ⎜
⎜−
0.
92
⎝
+
[ Cs
+
eV ⎞
⎟
k BT
⎠
⎛ eV ⎞
] exp ⎜
⎜−
0.
17 ⎟
⎝ k BT
⎠
23
(5.1.a)
(5.1.b)
Hierbei haben e, V, T und kB ihre normale Bedeutung.
Die Spannungsabhängigkeit eines Blocks wird häufig mit dem Woodhull-Modell (1973)
beschrieben. Die Ionen diffundieren nach diesem Modell in eine wassergefüllte Pore (Kanal),
in der eine Bindungsstelle existiert. Das blockierende Ion springt über eine Energiebarriere in
diese Bindungsstelle hinein. Die Ratenkonstanten für den Bindungsschritt des blockierenden
Ions haben eine Spannungsabhängigkeit entsprechend der Boltzmann Statistik. Für das
Verhältnis der Ratenkonstanten für die Hin- und Rückreaktion gilt die folgende Relation:
k ⎛ ⎞
1 eV
∝exp
⎜
⎜−
d ⎟
k2
⎝ kBT
⎠
(5.2)
Dabei ist d der Hin- und Rückweg im elektrischen Feld, den das blockierende Ion in der
Pore durchqueren muß. Das Woodhull-Modell (1973) war nicht in der Lage, die starke
Spannungsabhängigkeit für die Ratenkonstanten (d = 0.92 +0.17 > 1) (Formel 5.2) zu
erklären.
Das Multi-Ion-Single-File-Pore Modell von Hille und Schwarz (1978) wäre theoretisch in
der Lage, durch die zwei Bindestellen in der Membran eine höhere Spannungsabhängigkeit zu
erklären, da die Exponenten der Spannungsabhängigkeit gekoppelter Ionen sich addieren.
Draber und Hansen (1994) argumentieren, daß molekulare Daten (De Biasi et al., 1993) eine
maximale Eindringtiefe des blockierenden Ions von maximal 20 % zu lassen. Damit fällt die
Voraussetzung für das Woodhull-Modell (1973) und auch die Ergänzung durch das Hille-
Schwarz-Modell (1978) fort.
Weiterhin spricht gegen das Hille-Schwarz-Modell, daß es die von Draber et al. (1991)
gemessene Wirkung des AMFEs nicht erklären kann (Abschnitt 3.1.2).
5.3 Der Na + -Effekt beim K + -Kanal und der Nachweis des
schnellen Schaltens in Chara
Bertl (1989) untersuchte den Einfluß des Natriums auf den Block des Kaliumkanals im
Tonoplasten von Chara corallina. Dort betrug die Abtastrate 5 kHz gekoppelt mit einem
Anti-Aliasingfilter von 1 kHz. Wie bei Cs + -Ionen tritt bei Na + -Ionen in der Lösung bei
Raumtemperatur eine Reduktion der scheinbaren Einzelkanalleitfähigkeit auf. Die Idee ist wie
bei Cs + , daß das unzureichende Auflösungsvermögen für die scheinbare Reduktion des
Einzelkanalstroms verantwortlich ist. Der Nachweis im Falle des Na + gestaltete sich aber
schwieriger, da trotz der schnellen Abtastraten von 200 kHz und einem Anti-Aliasingfilter
von 50 kHz bei Blunck (1996) die Reduktion des Einzelkanalstroms beobachtet werden
konnte. Weil das Öffnen und Schließen der Kanäle auf einer Konformationsänderung im
Protein beruht, kann man durch Temperatursenkung die Geschwindigkeit der Übergänge
verringern. Dadurch reicht die Auflösung aus, und man ist in der Lage, die unterschiedlichen
Zustände miteinander zu vergleichen.

Kapitel 5: Veränderung des Schaltverhaltens beim Block durch Metallionen
Blunck (1996) reduzierte die Temperatur im blockierten und unblockierten Zustand und
bestimmte den Einzelkanalstrom. Bei Temperaturverringerung sank der Einzelkanalstrom des
unblockierten Kanals. Dies war nicht unerwartet, denn es gab schon entsprechende
Messungen von Zanello und Barrantes (1994).
Das Besondere lag im Verhalten der Blockierung des Kanals mit Natrium bei
Temperaturreduzierung. Der Einzelkanalstrom nahm teilweise zu oder veränderte sich sehr
wenig. Bei einer Temperatur von 8 °C konvergierten die Werte der Einzelkanalströme
(Blunck, 1996) des blockierten und unblockierten Kanals (Fig. 5.4).
Fig. 5.4: Temperaturabhängigkeit des Einzelkanalstroms im blockierten (Quadrate) und unblockierten
(Kreise) Zustand (Blunck, 1996).
Die Konvergenz des Einzelkanalstroms bei 8 °C war eine Unterstützung für die
Hypothese des schnellen Schaltens. Die Auflösung wird durch die Verlangsamung des
Schaltens bei tieferer Temperatur besser und der Detektor erreicht das volle Niveau (Fig. 5.2).
Die scheinbare Konstanz des Einzelkanalstroms des blockierten Kanals entsteht aus der
gegenseitigen Kompensation von besserer Detektierbarkeit und normaler
Leitfähigkeitsabnahme mit der Temperatur.
Blunck (1996) verglich drei unterschiedliche Markov-Modelle, um die Vorgänge in dem
Kanal zu betrachten. Dies geschah mit dem Target-Fit (Abschnitt 7.3.1 und 7.3.2). Die
gewählten Modelle waren:
C⇔O⇔ G
C⇔G⇔ O
O⇔C⇔S Hierbei bedeutet: O: langer Offenzustand, S: kurzer Offenzustand C: langer
Geschlossenzustand, G: kurzer Geschlossenzustand.
Bluncks-Hauptinteresse (1996) war das COG-Markov-Modell, da dies in den
früheren Modellierungen (Draber und Hansen, 1994; Bertl et al. 1992a, 1993) der
24

Kapitel 5: Veränderung des Schaltverhaltens beim Block durch Metallionen
experimentellen Daten benutzt worden war. Blunck (1996) betrachtete die Ratenkonstanten
des gewählten COG-Markov-Modells. In der Tabelle 5.1 wurden diese
Ratenkonstanten bei 20 °C und 10 °C miteinander verglichen. Die schnelle Ratenkonstante in
diesem Zustandmodell war kGO.
K + + Na +
K + + Na +
K +
K +
T / °C kCO / Hz kOC / Hz kOG / Hz kGO / Hz
10 50 25 100 1300
20 150 150 370 3300
10 50 15 60 850
20 150 75 100 1350
Tabelle 5.1: Vergleich der Ratenkonstanten des COG-Modells für den blockierten und
unblockierten Zustand bei 20 °C und 10 °C (Blunck, 1996).
Blunck (1996) konzentrierte sich nur auf die schnelle Ratenkonstante kGO und ist davon
ausgegangen, daß die anderen Übergangskonstanten (kCO, kOC und kOG) keinen Unterschied im
blockierten und unblockierten Zustand zeigen. Die kGO Ratenkonstante bei 20 °C
unterscheidet sich sehr deutlich beim blockierten und beim unblockierten Zustand. Diese
Ratenkonstante wird geringer durch Temperatursenkung, und bei 10 °C gleichen die Werte
sich für den blockierten und unblockierten Zustand an. Blunck (1996) ging davon aus, daß die
Ratenkonstante kGO im blockierten Zustand verantwortlich für das schnelle Schalten und
somit auch verantwortlich für die nicht ausreichende Auflösung der schnellen Übergänge bei
Raumtemperatur ist.
Blunck (1996) benutzte auch ein weiteres Markov-Modell und fand, daß das
OCS-Modell eine bessere Anpassung für die offen Dwell-Time-Histogramme zeigte.
Das Modell COG war außerdem nicht in der Lage, in langsamen Bereichen die
experimentiellen Daten des Open-Dwell-Time-Histogramms zu beschreiben. Blunck (1996)
ist davon ausgegangen, daß das COG-Modell die beiden Offenzustände mit einer
kleinen Abweichungen zusammenfassen kann. Es deutet sich an, daß im wahren Modell die
beiden Offenzustände zwei benachbarte Zustände sind. Die Existenz zweier Offenzustände
stimmten mit den Beobachtungen der Ergebnisse von Tyerman (1992), Laver und Walker
(1991), Laver (1992) und Albertsen (1994) überein. Tyerman (1992) hatte schon das Modell
COOC vorgeschlagen. Albertsen (1994) meinte, daß einer der beiden
Offenzustände in einen Sublevel übergeht. Beim schnellen Schalten kann durch Summierung
über die schnellen Schaltvorgänge bei nicht ausreichendem zeitlichen Auflösungsvermögen
(Fig. 5.2) ein Offenzustand in einen Sublevel übergehen. So kann der Kanal zwischen einem
schnellen (GS) und einem langsameren Schaltvorgang (CO) wechseln. Blunck (1996)
hat das folgende Modell vorgeschlagen:
G⇔S
⇔O⇔C
!
C
2
Das OGC-Modell, das von Zanello und Barrantes (1994) vorgeschlagen wurde,
hat bei Blunck (1996) zu keinen zufriedenstellenden Ergebnissen geführt. Die theoretische
Kurve hat sich nicht den Meßdaten angepaßt. Es traten negative Ratenkonstanten auf. In den
25
1

Kapitel 5: Veränderung des Schaltverhaltens beim Block durch Metallionen
wenigen Fällen, bei denen gute Anpassung erfolgte, war der kurze Geschlossenzustand am
Ende der Kette (GCO).
Der Grund für die obigen widersprüchlichen Ergebnisse wird in dem folgenden Kapitel 7
deutlich: Es ist mindestens ein 5-Zustandsmodell notwendig, um den K + -Kanal in Chara zu
beschreiben. Die oben genannten Autoren verfügten aber noch nicht über geeignete Software
um 5-Zustandsmodelle an die Daten zu fitten und mußten deshalb die genannten
Kompromisse eingehen.
26

6 Experimenteller Aufbau und Methoden
6.1 Der Aufbau
Der Versuchsaufbau wurde bereits von Albertsen (1992), Draber (1994), Blunck (1996)
und Sutter (1996) benutzt. Er steht in einem Faraday-Käfig, da die Messungen sehr
empfindlich gegenüber Störsignalen sind (Fig. 6.1). Ein Charakteristikum der Patch-Clamp-
Technik ist die extreme Empfindlichkeit des Strom-Spannungswandlers, mit dessen Hilfe
kleine elektrische Ströme gemessen werden können.
Diese kleinen Signale werden leicht vom elektrischen Hintergrundrauschen überlagert. Es
wird versucht, das Signal-Rausch-Verhältnis zu optimieren. Eine der wesentlichen Störquellen
ist die Einstreuung des elektromagnetischen Wechselfeldes (öffentliches Spannungsnetz).
Diese Störung wird durch den Faraday-Käfig stark reduziert (Fig. 6.1). Die Geräte innerhalb
des Käfigs werden mit Gleichstrom (±15 V) betrieben. Die Netzgeräte dafür stehen außerhalb
des Käfigs (links in Fig. 6.1). Jedes einzelne Gerät sowie der gesamte Meßaufbau werden an
einem zentralen Punkt geerdet. Alle Leitungen, die eine Verbindung vom Innenraum zum
Außenraum des Faraday-Käfigs haben, werden abgeschirmt, und die dazugehörigen Geräte
geerdet.
Das inverse Mikroskop und der Meßaufbau stehen auf einem luftgelagerten Tisch (Mitte
in Fig. 6.1), um mechanische Erschütterungen von außen (z.B. Schritte oder Schließen von
Türen) abzuschirmen. Sehr niederfrequente Schwingungen dämpft zusätzlich eine extrem
schwere Tischplatte.
Die Meßkammer liegt auf einem Objekttisch, in die gekühlte Flüssigkeit mit Hilfe einer
Pumpe (unten rechts in Fig. 6.1) hineinfließt. Der Objekttisch kann mit einem
Mikromanipulator (Fig. 6.1, Micro Control, Frankreich) in zwei Richtungen (vorwärtsrückwärts,
rechts-links) bewegt werden. Der Pipettenhalter (Fig. 6.1) ist auf einem dreidimensionalen
Manipulator befestigt. Für die grobe Positionierung des Pipettenmanipulators
steht noch ein zweidimensionaler Mikromanipulator zur Verfügung, weil für das Aufsetzen
der Pipette auf die Membran der dreidimensionale Manipulator aufgrund seiner hohen
Genauigkeit einen zu engen Einstellbereich hat.
Das Licht zur Kontrolle des Patchvorgangs wurde von einer Halogenlampe HLX 64634
(Osram) von oben eingestrahlt (oben in Fig. 6.1).

Kapitel 6: Experimenteller Aufbau und Methoden
Fig. 6.1: Meßaufbau.
6.2 Meßkammer
Die Meßkammer besteht aus einem Plexiglasblock (Fig. 6.2) mit einer schmalen Rinne
(Länge 25 mm, Breite 4 mm, Tiefe 3 mm). In der Rinne befinden sich die Lösung und die
Vesikel, die gepatcht werden sollen. Der Boden besteht aus Glas, da die Vesikel an Glas
haften. Durch die Haftung rollen sie beim Andocken der Patchelektrode nicht weg. Auf
beiden Seiten der Meßkammer gibt es Schlauchanschlüsse, durch die die Lösung hinein- und
hinaus-fließen kann. Die Lösung in der Rinne wird mit einer seitlichen Kammer (GND)
elektrolytisch verbunden. In diese Seitenkammer taucht die Erdelektrode.
Fig. 6.2: Meßkammer.
28

Kapitel 6: Experimenteller Aufbau und Methoden
6.3 Bearbeiten und Ziehen der Pipetten
Die Patchpipette ist bereits in Fig. 2.4 vorgestellt worden. Für die Durchführung der
Versuche werden als erstes die Pipetten bereitgestellt. Von den 1 m langen Glasröhrchen
(Firma Hilgenberg, Malsfeld) werden ca. 7 cm abgesägt und mit Sigmacot (Sigma,
Deisenhofen) von innen mit einer Spritze beschichtet. Diese Behandlung schirmt die
Oberflächenladung ab. Hierdurch wird auch das Rauschen vermindert (Keunecke, 1995) und
die sogenannte Ω-Bildung (Einkriechen des Patches in die Pipette) verhindert, welche die
Lebensdauer eines Patches verringert. Anschließend werden die Glasröhrchen zwei Tage lang
unter dem Abzug getrocknet, damit das nicht gebundene Sigmacot verdampft. Es wird wegen
der Giftigkeit des Sigmacots unter dem Abzug mit Handschuhen gearbeitet.
Die Pipetten werden am Tag der Versuchsdurchführung mit einem speziellen
Mikroelektrodenziehgerät L/M-3P-A (List, Darmstadt) ausgezogen. Das Glasröhrchen wird in
die Ziehvorrichtung eingespannt und mit einem Gewicht belastet. Die Mitte des Röhrchens
umgibt eine Heizspule mit einstellbarem Heizstrom. Durch die Hitze schmilzt das
Glasröhrchen und wird in die Länge gezogen. Der Pipettenziehvorgang besteht aus zwei
Stufen. In der zweiten Stufe wird das Glasröhrchen abgerissen und es entstehen zwei Pipetten
mit einem Öffnungsdurchmesser von etwa 1 µm.
Die Pipetten verschmutzen sehr schnell an der Spitze. An einer verschmutzten Pipette
bilden sich keine Seals. Deshalb wurden sie abgedeckt und in einem staubfreien Gehäuse
aufbewahrt.
Die Pipetten werden anschließend poliert, um durch die dadurch entstandene glattere
Oberfläche eine bessere Haftung zwischen Pipettenspitze und Membran zu erreichen. Dazu
wird die Pipettenspitze vor einem glühenden Draht unter einem Mikroskop angeschmolzen.
Der Draht ist mit Glas beschichtet, damit keine Ionen emittiert werden, die die Pipettenspitze
verschmutzen könnten.
6.4 Erd- und Pipettenelektrode
Für die Herstellung der Erdelektrode (Fig. 6.2) wird zuerst eine Lösung aus 250 mM
KNO3 , 5 mM Ca(NO3)2 und 3% Agar-Agar aufgekocht. Die Elektrodenlösung darf keinen
großen Einfluß auf die Lösung in der Meßkammer haben. Das Agar-Agar unterbindet deshalb
den Ausfluß der Lösung aus der Erdelektrode. Die gekochte Lösung wird in eine
Pasteurpipette gegeben und abgekühlt. Er wird darauf geachtet, daß sich keine Luftbläschen
bilden, damit durchgehende Leitung gewährleistet ist. Sie wird über Nacht gekühlt, und am
nächsten Tag wird ein chlorierter Silberdraht (Ag/AgCl; ∅=1mm) bis zur Hälfte in die
Pasteurpipette gesetzt. Die Chlorierung führt dazu, daß der Draht nicht polarisierbar wird. Die
Patchpipette muß eine elektrische Verbindung von der Membran zum
Stromspannungswandler bilden. Dazu wird sie in der vorderen Hälfte mit einer Salzlösung
(250 mM KCl + 5 mM Ca(Cl)2) gefüllt. In die Salzlösung taucht ein chlorierter Silberdraht als
nicht polarisierbare Elektrode, der mit einem Ende an einen BNC-Stecker gelötet ist. Dieser
kann direkt auf den Patchverstärker aufgesteckt werden.
29

Kapitel 6: Experimenteller Aufbau und Methoden
6.5 Der Patch-Clamp Verstärker
Der Patch-Clamp-Verstärker besteht aus einem Strom-Spannungswandler, der das
Stromsignal der Pipette mißt und als Spannung ausgibt, und dem Nachverstärker, der das
Signal verstärkt und filtert. Der Strom-Spannungswandler steht stabil und erschütterungsfrei
auf dem Pipettenmanipulator nahe der Meßkammer.
Die Ströme, die die Membran durchfließen, liegen im Bereich einiger Picoampere.
Deshalb muß ein sehr empfindlicher Strom-Spannungskonverter mit hoher Bandbreite benutzt
werden. Eines der Standardgeräte ist der L/M-EPC7 (List, Darmstadt) mit einer Bandbreite
von 100 kHz und bei einem Rückkopplungswiderstand Rf von 10 GΩ.
In Fig. 6.3 ist ein vereinfachtes Schaltbild des Patchverstärkers dargestellt. Der OP regelt
den Unterschied zwischen Upip und Usoll auf Null. Das geschieht so, daß die Differenz der
Eingangsspannungen extrem verstärkt wird. Es entsteht zwischen Punkt 1 und Punkt 2 ein
Spannungsunterschied, so daß durch Rf ein Strom mit einer Spannung von Uf = Rf I fließt.
Dieser Strom fließt in der Pipette und nicht in den OPA (OPA hat einen unendlich hohen
Eingangswiderstand). Der Strom ändert das Potential an Punkt 1 (Upip), bis die
Eingangsspannungen gleich sind. Die Spannung am Punkt 1 ist gleich der Pipetten- bzw.
Membranspannung, da der Spannungsabfall über der Pipette vernachlässigt wird. Die
Abweichung zwischen der Pipettenspannung und der Sollspannung wird ausgeglichen. Die
Spannung über Rf ist proportional zum Strom in der Pipette. Usoll wird vom zweiten
Operationsverstärker abgezogen. Das Signal geht von dort zum Nachverstärker.
Der Stromspannungswandler verursacht Rauschen, das im Allgemeinen aber keine Rolle
spielt, da der entscheidene Beitrag des Rauschens durch die Pipette (Keunecke, 1995)
entsteht.
Fig. 6.3: Vereinfachtes Schaltbild eines Patch-Clamp-Verstärkers.
Das Signal wird vom Verstärker zu einem 8-poliges Besselfilter außerhalb des Faraday-
Käfigs weitergeleitet. Es dient als Anti-Aliasingfilter für die Datenerfassung. Der digitale
Besselfilter wird mit einer ±5 V Rechteckspannung getaktet (Albertsen, 1992). Die
Abknickfrequenz ist 1/65 der Taktfrequenz. Sie betrug bei dieser Messung 25 kHz. Das
30

Kapitel 6: Experimenteller Aufbau und Methoden
Ausgangssignal des Besselfilters wird dann an einen digitalen Signal-Prozessor weitergeleitet
(Dalanco Spry). Dieses Board kann das Signal bis zu 200 kHz abtasten. Es war bei den in
dieser Arbeit durchgeführten Messungen auf 100 kHz eingestellt. Durch das 25-kHz Filter
kam es nicht zu einem Verstoß gegen das Abtasttheorem.
Die Daten werden per Knopfdruck durch das Aufnahmeprogramm „Sample“ auf die
Festplatte eines PC’s (486DX66) gespeichert. Es werden bei verschiedenen Spannungen
Aufnahmen gemacht. Die Dauer jeder Aufnahme betrug 20 Sekunden. Je länger die Meßzeit
ist, desto kleiner ist die Streuung der Dwell-Time Histogramme, aber desto kleiner wird die
Wahrscheinlichkeit, daß das Gigaseal überlebt, besonders bei hoher Haltespannung. In dem
Aufnahmeprogramm werden die Samplefrequenz, der Dateiname und die Länge des Meßfiles
dokumentiert. Nach der Auswertung werden die Files auf eine CD gebrannt.
6.6 Das Patchen
Aus einem Anzuchtbecken werden die Algen Chara corallina entnommen, und die
Radialzellen werden von den Internodialzellen entfernt. Die Internodialzellen der Alge werden
dann für die Vorbereitung des Versuchs, nachdem sie 10 Minuten getrocknet worden sind,
aufgeschnitten, und der Zellinhalt wird vorsichtig mit zwei Fingern in der Lösung der
Meßkammer ausgedrückt. Es bilden sich Vesikel (Tröpfchen), die am Boden der Rinne der
Meßkammer haften. Je kleiner die Krümmung der Vesikeloberfläche, desto größer ist die
Wahrscheinlichkeit einer Bildung des Gigaseals. Da die Vesikel einen Durchmesser um die 50
µm haben, wird ein invertierendes Mikroskop (Zeiss ID02) mit einem Objektiv von 5×, 10×
und 20× benutzt.
Danach wird die Pipette auf den Halter gesteckt und in die Lösung getaucht. Mit dem
Mund wird über einen seitlich angebrachten Schlauch ein Überdruck erzeugt. Durch diesen
Überdruck wird der Schmutz an der Oberfläche weggeblasen, so daß die Pipettenspitze beim
Durchfahren der Lösung nicht durch herumschwimmende Tropfentrümmer verunreinigt wird.
Bei eingetauchter Pipette wird der Offsetstrom im EPC7-Verstärker (Abschnitt 6.5) auf Null
kompensiert. Dann folgt das Anlegen einer Rechteckspannung für die Kontrolle des
Sealvorganges. Der von ihr erzeugte Strom wird kleiner, wenn das Seal die Pipette
verschließt. Die Pipette wird mit Hilfe des Mikromanipulators in die Nähe des Vesikels
gebracht. Die Pipette wird schräg bis senkrecht von oben auf das Vesikel zu bewegt. Es wird
kurz vor Berührung der Membran ein leichter Unterdruck erzeugt, so daß das Vesikel an die
Pipette herangezogen wird. Am Oszillographen wird beobachtet, daß bei Sealbildung der
rechteckige Pipettenstrom zusammenschrumpft. Bei einem hieraus ermittelten Widerstand im
Giga-Ohm-Bereich ist die Verbindung zwischen dem Glasrand der Pipettenöffnung und der
Membran fest. Man spricht von einem Gigaseal. Die Pipette wird dann ruckartig
zurückbewegt und es bildet sich ein „excised Patch“. Das am Pipettenmund klebende
Membranstück (Patch) wird aus der Zelle herausgerissen (Abschnitt 2.2.1). Danach wird der
Patch dicht unter die Oberfläche gebracht und somit das Rauschen reduziert (Keunecke,
1995). Der kapazitive Rauschstrom fließt hauptsächlich durch die Kapazität der benutzten
Pipettenwand. Somit ist das Rauschen sehr stark von der Eintauchtiefe des Patches abhängig.
Das Rauschen nimmt bei einer Eintauchtiefe von 20 µm um den Faktor 2.2 ± 0.5 ab
(Keunecke, 1995). Dann wird die Aufnahme durch den Rechner außerhalb des Faraday-Käfigs
über eine Fernbedienung von innen gestartet. Vorher wird noch die Empfindlichkeit des
Verstärkers auf 100 mV/pA erhöht.
31

Kapitel 6: Experimenteller Aufbau und Methoden
Die Abfolge der Messung war meist so, daß zuerst die Messung bei Raumtemperatur
durchgeführt, dann die Platte gekühlt und schließlich nach zwanzig Minuten die Messung bei
7°C durchgeführt wurde.
6.7 Die Kühlung
Die Kühlung spielt eine tragende Rolle in dieser Arbeit, da versucht werden soll, bei
tiefen Temperaturen die hypothetischen Schaltprozesse so weit zu verlangsamen, daß sie einer
direkten Beobachtung zugänglich werden.
Der Tauchkühler und die Pumpe für den Kühlkreislauf (Fig. 6.1) wird während der
Messung nicht in Betrieb genommen und führt dadurch nicht zu Störungen. Um die Messung
auch bei tieferer Temperatur durchzuführen, wird vorausgesetzt, daß die Badlösung schnell
abgekühlt wird, die Temperaturschwankung gering gehalten wird und keine zusätzlichen
Störungen entstehen. Diese Voraussetzungen lassen sich am einfachsten durch die direkte
Abkühlung des Objekttisches erfüllen. Die Kühldauer betrug 20 min. Dadurch wurde der
Wunsch nach einer schnellen Kühlung nicht ganz erfüllt, aber die meisten Seals hatten eine
Lebensdauer von mehr als 30 min. Der entscheidende Vorteil war jedoch, daß der Seal nicht
unter mechanischer Belastung stand. Die Methode des Lösungsaustauschkreislaufs mit der
Mikropumpe zur Kühlung der Lösung (Blunck, 1996) hatte den großen Nachteil, daß der Seal
sehr häufig durch die mechanische Belastung beim Lösungsaustausch zusammenbrach. Im
Gegensatz zu Bluncks Kühlplatte war die Meßkammer (Abschnitt 6.2) nicht nur auf der Platte
montiert, sondern wurde von der Platte auf allen Seiten eingeschlossen Der Objekttisch war
während der gesamten Meßdauer auf die tiefe Temperatur gekühlt. So war die Meßtemperatur
während der gesamten Aufnahme einer Zeitreihe konstant.
6.8 Temperaturmessung und Probleme durch die Kühlung
Die Temperatur wurde mit einem NTC-Thermometer gemessen. Der größte Vorteil
dieses Thermometers war, daß es eine kleine Spitze hatte und somit in die schmale Rinne der
Meßkammer paßte. Es zeigte die Temperatur mit einer Abweichung von ±0.5 °C.
Da sich nur der Objekttisch abkühlte und die Umgebung des Meßaufbaus sich weiterhin
in Raumtemperatur befand, traten folgende Probleme auf: An Teilen der Meßapparatur,
besonders der Meßkammer und an der Erdelektrode kondensierte Wasser. Es entstanden
dadurch Kriechströme an der Meßkammer und Erdelektrode zu den Metallteilen des Aufbaus
oder des Drahtanschlusses. Die Offsetspannung änderte sich und konnte nicht mehr
kompensiert werden. Durch das Kondenswasser am Objektiv konnte weder die Spitze der
Pipette beobachtet werden, noch konnte man die Bewegung der Pipette an die Oberfläche der
Lösung kontrollieren.
Die Meßkammer und ein Teil des Objekttisches wurden deshalb mit Siliconöl
eingerieben. Dies ergab eine sehr gute Isolation der Meßkammer. Außerdem wurden
Exsikkationsperlen in Teebeuteln rund um die Meßkammer gelegt, damit nur getrocknete Luft
die Meßkammer erreicht. Diese Trockenperlen wurden ein- bis zweimal am Tag ausgetauscht
und verloren ihre Feuchtigkeit in einem Trockenofen (100 °C, 6 h) wieder.
32

Kapitel 6: Experimenteller Aufbau und Methoden
6.9 Auswerteprogramm
In Fig. 6.4 ist eine Zeitreihe der Grünalge Chara corallina mit Tl + -haltiger Lösung bei
Raumtemperatur dargestellt. Die Zeitreihe ist bei einer Haltespannung von -80 mV
aufgenommen worden. Es werden drei unterschiedliche Niveaus erkannt. Das obere Niveau
ist das Nullniveau, bei dem alle Kanäle geschlossen sind. Diese Zeitreihe besteht aus zwei
gleichartigen Kanälen mit je einem Einzelkanalstrom von -3.3 pA. Das Rauschen beträgt ± 1.2
pA. Auf der linken Seite von Fig. 6.4 ist das Schalten der beiden Kanäle deutlich erkennbar,
und auf der rechten Seite von Fig. 6.4 wird festgestellt, daß die Kanäle für eine längere Zeit
geschlossen bleiben. Diese Phasen, in denen der Kanal hauptsächlich geschlossen ist, werden
in vielen Zeitreihen beobachtet. Diese langen geschlossenen Zustände werden dann durch
kurze Offenereignisse unterbrochen (die ersten beiden Offenereignisse von der rechten Seite
der Fig. 6.4).
Die schnellen Ereignisse (Bursts) werden besonders deutlich, wenn beide Kanäle offen
sind. Es wird sichtbar, daß besonders bei zwei offenen Kanälen der Offenzustand durch
schnelle Folgen von sehr kurzen Geschlossenzustände (Gaps) des einen Kanals unterbrochen
werden. Einige Burst sind teilweise nicht gut erkennbar und die Gaps erreichen die Nullinie
nicht mehr. Dies wird in gewissen Bereichen von Fig. 6.4 erkannt. Dieses Verhalten deutet auf
ein schnelles Schalten hin, in dem die Offenereignisse nur für eine kurze Zeit existieren.
Wie man solche Zeitreihen behandelt und weiter auswertet, wird im folgenden Abschnitt
und im Kapitel 7 erläutert.
Fig. 6.4: Ein typischer Zeitverlauf des Einzelkanalstromes in einer gemischten Lösung aus K + - und Tl + -
Ionen bei Raumtemperatur und Vhold = -80 mV. Die Gesamtkonzentration ist 250 mM (230 mM KNO3 +20 mM
TlNO3). Der Einzelkanalstrom ist mit 100 kHz abgetastet und mit 25 kHz gefiltert. Die hellen Linien sind
Cursoreinstellungen.
6.9.1 Bestimmung von Kanalzahl, Niveaus und Standardabweichung
Für die Auswertung der Zeitreihe (Fig. 6.4) wird das Programm „day“ (Kirst, 1996)
benutzt. Es werden zuerst die Stromniveaus und das Rauschen bestimmt. Das Programm
bietet zwei Möglichkeiten, die Einzelkanalstromniveaus zu ermitteln. Erstens besteht die
Möglichkeit, daß die gesamte oder nur ein Abschnitt der Zeitreihe betrachtet wird. Es wird ein
Abschnitt gewählt, in dem das Schalten gut erkennbar ist (Fig. 6.4). Die Niveaus werden nun
mit dem Cursor von Hand eingestellt. Danach wird die Zeitreihe als Amplitudenhistogramm
dargestellt und das Rauschen bestimmt (Fig 7.3). Im Amplitudenhistogramm können die
33

Kapitel 6: Experimenteller Aufbau und Methoden
Niveaus auch mit einem Simplex nachgefittet werden. Hierzu muß die Anzahl der Kanäle
bekannt sein, und es besteht die Möglichkeit, daß sich der Fit bei schlechten Startwerten
verläuft. Daher wird die erste Methode (Fit-by-eye) vorgezogen, und dann im
Amplitudenhistogramm mit diesen Startwerten und mit dem Simplex (entwickelt von Nedler
und Mead, 1965; als Programm dargestellt von Caceci und Cacheris, 1984) verifiziert. Die
Nachkorrektur durch das Fitten ist zumeist sehr gering. Nachdem die Niveaus, ihre Anzahl
und die Standardabweichung bestimmt worden sind, wird die Zeitreihe durch den Hinkley-
Detektor ausgewertet (Abschnitt 6.9.2). Das ergibt die idealisierte Zeitreihe, die für die
Erstellung der Verweildauerhistogramme benötigt wird (Fig. 7.6, 7.7 und 7.8).
6.9.2 Die Rekonstruktion der Zeitreihe mit dem Hinkley-Detektor
Um die biophysikalischen Mechanismen des Schaltverhaltens eines Kanals mit Markov-
Modellen (Abschnitt 4.1) beschreiben zu können, muß mit Hilfe eines Algorithmus aus der
verrauschten Zeitreihe des Stroms durch die Membran (Fig. 6.4) eine ideale Zeitreihe (ohne
Rauschen) möglichst fehlerfrei rekonstruiert werden.
Der am häufigsten verwendete Algorithmus ist ein Tiefpaßfilter mit nachfolgendem
Schwellenwertdetektor, der für die Detektion eines Sprunges auf die halbe Sprunghöhe
eingestellt ist. Schultze und Draber (1993) führten den Hinkley-Detektor erster und höherer
Ordnung mit einem besseren Auflösungsvermögen in die Patch-Clamp-Analyse ein. Dies ist
für diese Arbeit eine entscheidende Voraussetzung, um den Nachweis der schnellen
Schaltvorgänge beim anomalen Molfraktionseffekt (Kapitel 3) mit Thallium im Kaliumkanal
zu erbringen. Somit wird der Hinkley-Detektor für diese Arbeit benutzt (Fig. 6.4).
Der Hinkley-Detektor benötigt wie alle anderen Detektoren für die Detektion eines
Sprunges zwischen zwei Niveaus die Anzahl und die Lage der Stromniveaus. Diese werden
mit Hilfe des Programms „day“ entweder aus dem Amplitudenhistogramm oder direkt durch
die visuelle Inspektion der Zeitreihe (Abschnitt 6.9.1) festgelegt. Der Algorithmus des
Hinkley-Detektors funktioniert so, daß aus den Meßpunkten der Zeitreihe zt ein Testwert gt
berechnet wird, der aus der Summe der vorherigen Testwerte g(t-1) und der Differenz des
Meßwertes vom Absprungsniveau et sowie dem Mittelwert p der Niveaus i und j entsteht und
schließlich diesen Testwert mit einer Schranke λ vergleicht (Schwellenwertdetektor) (Fig.
6.4). Bei negativen Testwerten wird er gleich Null gesetzt. Dadurch werden alle
vorhergehenden Werte nicht mehr berücksichtigt. Der Detektor bleibt immer „wach“ und es
treten keine unnötigen Verzögerungen der Sprungdetektion auf.
± ⎧ ± gt
−1
+ ( ± et
− p)
gt
= max⎨
⎩0
mit
g0 = 0
p = (µ1 - µ0) / 2
µ0: Absprungsniveau
µ1: Zielniveau
et = zt - µ0
± Sprung nach oben (+) bzw nach unten (-)
34
(6.1)

Kapitel 6: Experimenteller Aufbau und Methoden
Ohne Rauschen gilt vor dem Sprung zt = µ0 (et = 0). Daraus folgt, daß gt = 0. Nach einem
Sprung ist z1 = µ1 , und gt steigt linear mit einer Steigung von (µ1 - µ0) / 2 an. Die Schranke λ
wird bei einer Zeitauflösung tres erreicht, und es gilt dann:
µ 1 −µ
0 λ=
tres
(6.2)
2
λ bestimmt die Empfindlichkeit des Detektors, und alle Ereignisse, die länger als tres sind,
werden detektiert.
Fig. 6.4: Erkennung eines Sprunges aus einer verrauschten Zeitreihe zt (+) mit Hilfe des
Hinkley- Detektors. Wenn der Testwert die Schwelle λ erreicht (2), wird ein Sprung detektiert. Nach
dem Sprung wird die Sprungzeit auf den letzten Wert, an dem der Testwert Null betrug, festgelegt. Die
gestrichelte Linie ist die ideale Zeitreihe. Die Wahl µ0 + µ1 = 0 ist keine Voraussetzung des
Algorithmus.
Bei falscher Wahl der Auflösung kann der Detektor die Änderung des Testwertes, die
durch das Rauschen verursacht wurde, fälschlich als ein Ereignis interpretieren (false alarms).
Bei einer Anpassung von λ an das Signal-Rausch-Verhältnis (SNR) wurde gezeigt, daß der
Fehler (false alarms) für
T
tres = colorconst
(6.3)
SNR
colorconst: Eine Konstante, die von der Farbe des Rauschens abhängig ist (weiß: 22,
blau: 32).
unter der Schranke 1:10 -4 bleibt (Schultze und Draber, 1993).
Der Sprungzeitpunkt ist der letzte Zeitpunkt, an dem gt = 0 ist. Nach dem Sprung wird der
Testwert wieder auf Null gesetzt und der Detektor wird für die nächsten Sprünge eingestellt.
35

Kapitel 6: Experimenteller Aufbau und Methoden
Bei einem Niveau, in dem Sprünge nach oben und nach unten möglich sind, werden zwei
parallel laufende Detektoren, die gleichzeitig nach oben und nach unten schauen, benötigt.
Beim Higher-Order-Hinkley-Detektor wird anstelle der einfachen Ordnung des
Algorithmus eine höhere Ordnung benutzt. Diese unterdrückt die hochfrequenten
Rauschanteile stärker als bei der ersten Ordnung des Algorithmus. Der Testwert der höheren
Ordnung läßt sich berechnen als:
g
( i)
t
( i)
( i−1)
( 1)
⎧gt −1+
Tgt
fürg
t ≥0
= ⎨
⎩0
sonst
36
(6.4)
g t
i :: Der Testwert i-ter Ordnung.
Bei einer Überschreitung des Testwertes g i über die Schranke λ wird ein Sprung erkannt.
Die Testwerte werden alle wie beim Hinkley-Detektor erster Ordnung gleich Null gesetzt,
wenn g i < 0 ist. Das Prinzip des Higher-Order-Hinkley-Detektors entspricht dem des
ursprünglichen Hinkley-Detektors.
Diese Auswertung wird für alle Membranspannungsbereiche ausgeführt. Nur die
Spannungswerte von ±20 mV wurden wegen des schlechten Signal-Rausch-Verhältnisses
nicht für die Verweildauerhistogramme benutzt. Für die Strom-Spannungskurven sind aber
alle Daten verwendet worden. Die genauere Auswertung der Stromniveaus und die Dwell-
Time-Histogramme werden in dem folgenden Kapitel beschrieben.

7 Meßergebnisse
7.1 Strom-Spannungskurven
7.1.1 Bestimmung der Einzelkanalströme
Die Untersuchungen wurden am Plasmatropfen der Süßwasseralge Chara corallina
(Abschnitt 2.1.4) unter ähnlichen Bedingungen durchgeführt wie in den Untersuchungen von
Keunecke (1995) und Albertsen (1994). Dies bezieht sich insbesondere auf den
Lösungsaustausch auf nur einer Seite der Membran.
Die Messungen fanden bei Raumtemperatur oder bei 7°C statt, wie im folgenden
angegeben. Für die Lösungen im Bad und in der Pipette wurde eine Gesamtkonzentration von
250 mM statt 150 mM wie bei Albertsen (1994) und Keunecke (1995) benutzt. Die höheren
Salzkonzentrationen führten auf höhere Einzelkanalströme und damit auf ein besseres Signal-
Rauschverhältnis.
Die Zusammensetzung der Tl + -freien Lösung war bei den folgenden Messungen
250 mM KNO3 + 5 mM Ca(NO3 )2 .
In der Tl + -haltigen Lösung war die Zusammensetzung so, daß das Verhältnis von
Thallium zu Kalium dem Minimum der Leitfähigkeit in den Messungen von Keunecke (1995)
entsprach. Das ergab eine Zusammensetzung von
230 mM KNO3 + 20 mM TlNO3 + 5 mM Ca(NO3 )2 .
Ein Unterschied gegenüber den Messungen von Keunecke (1995) bestand darin, daß für
den Lösungsaustausch nicht gespült wurde. Der Seal brach sehr häufig durch die mechanische
Belastung beim Lösungsaustausch. Das setzte voraus, daß Messungen mit verschiedenen
Badlösungen an verschiedenen Seals durchgeführt werden mußten. Dies erhöht die statistische
Schwankung allerdings nicht allzu sehr, weil die Einzelkanalströme sehr reproduzierbar sind.
Die Aufnahme der Daten und die Durchführung der Versuche folgte dem in Abschnitt 6.5
und 6.9 dargestellten Protokoll. Die Abknickfrequenz des Anti-Aliasingfilters lag bei 25 kHz.
Sie war um den Faktor zwei kleiner als bei Keunecke (1995).
Fig.7.1 stellt gemessene Zeitreihen für je eine Aufzeichnung in reiner K + -Lösung
(Fig.7.1.A) und in K + /Tl + -Mischung dar (Fig.7.1.B). Es handelt sich um einen Patch mit zwei
Kanälen. Gut zu erkennen ist die Höhe der Sprünge von einem Niveau zum anderen. Die
Sprunghöhe ergibt den Einzelkanalstrom.

Kapitel 7: Meßergebnisse
[A]
[B]
Fig.7.1.A-B:. Direktaufzeichnung des Zeitverlaufes des Stromes durch den Patch. Der Vergleich der
Meßreihen in (A) 250 mM K + und (B) 230 mM K + / 20 mM Tl + zeigt einen niedrigeren Einzelkanalstrom bei
Raumtemperatur und Vhold = -80 mV in der gemischten Lösung (Gesamtlänge ca. 2.5 s).
Zur exakteren Bestimmung der Einzelkanalströme wird die gemessene Zeitreihe mit dem
Auswertungsprogramm „day“ betrachtet. Das Programm bietet zwei Möglichkeiten, die Größe
des Einzelkanalstroms zu bestimmen: Zum einen, in dem interaktive Hilfslinien durch die
Stufen in der Originalzeitreihe gelegt werden (Fit-by-Eye, Fig. 7.2) und zum anderen durch
Anfitten der Amplitudenhistogramme (Fig. 7.3, Abschnitt 6.7).
Bei den vorliegenden Messungen wird der Einzelkanalstrom hauptsächlich direkt aus der
Zeitreihe bestimmt, weil die optische Kontrolle bei diesem Verfahren eine bessere Schätzung
des Einzelkanalstromes ermöglicht, denn es können mit dem Cursor Bereiche ausgewählt
werden, in denen die Nullinie und die einzelnen Stromniveaus gut erkennbar sind (Fig.7.2).
Fig.7.2: Hilfslinien in der Zeitreihe zur Bestimmung der Einzelkanalströme. Es ist ein Abschnitt einer
Zeitreihe von Chara im blockierten Kanalzustand mit einer Länge von 1 s. Das Nullniveau ist die obere Linie bei
einem Abstand der Hilfslinien von 3.2 pA, mit einem Rauschen von 1.5 pA.
Doch auch das Amplitudenhistogramm (Abschnitt 7.6) wird betrachtet. Zum einen zur
Kontrolle der nach Fig. 7.2 bestimmten Einzelkanalströme, zum anderen insbesondere, um die
Standardabweichung des Stromes (Breite der Linien in Fig. 7.2) zu bestimmen. Sie wird für
die spätere Auswertung der kinetischen Eigenschaften benötigt (Hinkley-Detektor, Abschnitt
2.2.2). Zur Ermittlung von Einzelkanalstrom und Standardabweichung kann das
Amplitudenhistogramm mit einer Summe von Gaußhügeln interaktiv oder mit Hilfe eines
Simplexalgorithmus (Nedler und Mead, 1965; Caceci und Cacheris, 1984) genähert werden.
38

Kapitel 7: Meßergebnisse
Fig.7.3: Gefittetes Amplitudenhistogramm für die Zeitreihe in Fig.7.2.
7.1.2 Aufstellung von Strom-Spannungskurven
Die obige Auswertung wird für Messungen bei verschiedenen Spannungen durchgeführt
und liefert damit die Spannungsabhängkeit der Einzelkanalströme zum Aufstellen einer
Strom-Spannungskurve (Fig.7.4). Die in Fig.7.4 dargestellten Einzelkanalströme werden aus
jeweils drei bis zehn Meßreihen gemittelt. Das Vorzeichen des elektrischen Stroms wird wie
folgt definiert (Bertl et al., 1992b): Ein positiver Strom fließt von Cytoplasma zur Vakuolen-
Seite des Tonoplasten.
7.1.3 Der anomale Molfraktionseffekt im scheinbaren Einzelkanalstrom
Fig. 7.4.A zeigt den anomalen Molfraktionseffekt bei negativen Membranspannungen:
Bei Raumtemperatur nimmt durch die Hinzugabe von Thallium der gemessene (scheinbare)
Einzelkanalstrom ab.
I / pA
8
6
4
2
0
-2
-4
[A]
K + Raumtemperatur
K + +Tl + Raumtemperatur
-6
-120 -80 -40 0 40 80 120
U / mV
39

Kapitel 7: Meßergebnisse
I / pA
6
4
2
0
-2
[B]
K + +TL + tiefe Temp eratur
K + tiefe Temp eratur
-4
-120 -80 -40 0 40 80 120
U / mV
Fig 7.4. A: Effekt von Tl + auf die IV-Kurven bei Raumtemperatur. Die Quadrate stellen die
Spannungsabhängigkeit des Kaliumkanalstroms ohne Thallium (250 mM KNO3) in der Lösung dar.
Die Kreise zeigen die Strom-Spannungskurve bei einer Tl + -Konzentration von 20 mM (230 mM
KNO3 und 20 mM TlNO3).
B: Konvergenz der Strom-Spannungskurven der beiden Lösungen mit und ohne Tl + -
Konzentration bei einer Temperatur von 7 °C.
Das Ergebnis von Fig. 7.4A war bereits aus den Vorläuferarbeiten Draber et al. (1991),
Albertsen (1994) und Keunecke (1995) bekannt, wobei allerdings unterschiedliche Ergebnisse
im positiven Spannungsbereich auftraten. Dies wird am Ende dieses Abschnitts besprochen.
Diese Arbeiten endeten damit, daß nicht eindeutig nachgewiesen werden konnte, ob der
anomale Molfraktionseffekt nun auf den Permeationschritt für das einzelne Ion entsprechend
den Modellen von Hille-Schwarz (1978) oder Wu (1992) wirkt, oder über schnelles Schalten.
Wie im Kapitel 3 besprochen ist das Problem hierbei, daß ein Nichtnachweis des schnellen
Schaltens nicht den Schluß auf die Nichtexistenz zuläßt, weil das Schalten schneller als die
Nachweisgrenze der jeweiligen Messung sein könnte.
Die Meßergebnisse von Draber et al. (1991) wurden so interpretiert, daß die Abtastrate
von 5 kHz nicht groß genug war, um das schnelle Schalten auflösen zu können. Es folgten die
Messungen von Albertsen (1994) und Keunecke (1995) mit einer größeren Abtastrate von 200
kHz. Aber auch bei diesen Messungen trat der AMFE im scheinbaren (gemessenen)
Einzelkanalstrom auf.
Eine Möglichkeit, Schaltprozesse zu verlangsamen, besteht in einer Verringerung der
Temperatur. So wurde versucht, mit Hilfe der Abkühlung den Nachweis für die Beteiligung
unentdeckten schnellen Schaltens zu erbringen. Diese Methode hatte bereits Erfolg beim
Nachweis des schnellen Schaltens beim Na + -Block des K + -Kanals in Chara (Blunck, 1996;
Hansen et al., 1997). Aus diesem Grund wurden Messungen bei 7 °C durchgeführt.
Fig. 7.4B zeigt, daß durch Temperatursenkung der Einzelkanalstrom bei reinem Kalium
sowohl für positive als auch für negative Spannungen sinkt. Dieses stimmt mit den
Messungen von Blunck (1996) sowie von Zanello und Barrantes (1994) überein und
entspricht der Erwartung, daß alle Prozesse mit höherer Temperatur schneller verlaufen.
Bei den Messungen in der Lösung mit Tl + verringert sich der Strom auch mit der
Temperatursenkung - nur mit dem Unterschied, daß die Stromänderung kleiner ist als bei
reinem Kalium. Fig. 7.4.B zeigt, daß die Strom-Spannungskurven mit und ohne Tl + bei
geringer Temperatur zusammenfallen.
40

Kapitel 7: Meßergebnisse
Dieses Verhalten würde bei Blunck (1996) als ein Hinweis auf die Mitwirkung schnellen
Schaltens bei der Entstehung des AMFE betrachtet. Wie in Kapitel 5 erklärt wurde, ist die
Argumentation dort, daß die Wirkung des Anti-Aliasingfilters zu einem kleineren gemessenen
Stromniveaus führt, wenn der Kanal schnell öffnet und schließt. Dem Ausgang des Filters
gelingt es nicht, das volle Niveau zu erreichen, bevor der Kanal seinen Zustand ändert. Diese
so gemessene Reduzierung des Einzelkanalstroms ist dadurch nur eine scheinbare und ihr
Auftreten ist eine Frage der zeitlichen Auflösung.
Die Temperaturabhängigkeit des gemessenen (scheinbaren) Einzelkanalstromes in
Gegenwart von Tl + wird somit durch zwei gegenläufige Effekte bestimmt: Die bessere
Auflösung bei Temperaturreduzierung kann dazu führen, daß die schaltbedingte Reduzierung
des Einzelkanalstroms zum Teil aufgehoben wird, während die Temperatur selbst wie in den
Messungen mit reinem K + den wahren Einzelkanalstrom senkt. So kann es vorkommen, daß
sich der scheinbare Einzelkanalstrom mit der Temperatursenkung weniger ändert. Es folgt,
daß sich die Strom-Spannungskurven mit und ohne Tl + bei tiefen Temperaturen nicht mehr
unterscheiden, wie Fig. 7.4.B zeigt. Ob diese Erklärung zutrifft, wird in den folgenden
kinetischen Analysen überprüft.
Die Ergebnisse bei Raumtemperatur stimmen mit den Messungen von Keunecke (1995)
nur zum Teil überein. Im Gegensatz zu Fig. 7.4.A beobachtete Keunecke (1995) eine
symmetrische Änderung des Einzelkanalstroms für positive und negative
Membranspannungen. Dies wurde auch in den Messungen von Draber et al. (1991)
beobachtet.
Der symmetrische Effekt trat in den Meßreihen dieser Arbeit nur auf, wenn ein
Lösungsaustausch mit Thallium und Kalium auf beiden Seiten der Membran vorgenommen
wird. Dann wurde eine Reduzierung der Einzelkanalleitfähigkeit auch für positive Spannung
gemessen (eine einzelne Messung, Fig. 7.5).
Die AMFE-Kurven sind bei einseitiger Tl + -Zugabe somit antisymmetrisch bezüglich der
angelegten Spannung. Der Effekt tritt dann auf, wenn der Strom das Tl + -Ion in den Kanal
zieht.
I / pA
8
6
4
2
0
-2
-4
K + sym m etrische Lösung
K + +Tl + in der Badlösung
K + +Tl + sym m etrische Lösung
a le drei bei Raum tem peratur
-6
-120 -80 -40 0 40 80 120
U / mV
Fig 7.5: Effekt von Tl + auf die IV-Kurven bei Raumtemperatur in einer symmetrischen 230 mM KNO3 +
20 mM TlNO3 + 5 mM Ca(NO3 )2 Lösung. Symmetrische Tl + -Gabe (x) bewirkt, daß die Stromwerte auch für
positive Spannung abnehmen, im Gegensatz zum einseitigen Lösungsaustausch (Kreise).
41

Kapitel 7: Meßergebnisse
7.2 Motivation zur Untersuchung des Zusammenhangs zwischen
schnellem Schalten und scheinbarem Einzelkanalstrom
Fig. 7.4B enthält einen Hinweis, daß normalerweise (bei Raumtemperatur) schnelles
Schalten Ursache für die scheinbare Reduktion des Einzelkanalstromes ist. Im folgenden soll
untersucht werden, ob diese Aussage durch eine Analyse der schnellen Übergangsraten des
zum Kanal gehörenden Markovmodells bestätigt werden kann.
Im Falle des Cs + -Blockes haben Draber und Hansen (1994) gezeigt, daß die Reduktion
der scheinbaren Einzelkanalströme, die bei 5 kHz-Abtastrrate gemessen wurden, einen
Mittelungseffekt im Anti-Aliasing Filter über schnelles Schalten zurückgeführt werden konnte
(Fig. 5.2, rechte Seite).
Bevor die Frage aufgegriffen wird, ob hier im Falle des AMFEs ein ähnlicher Effekt
vorliegt, soll der Zusammenhang zwischen Übergangsraten und scheinbarem
Einzelkanalstrom anhand eines einfachen Markovmodells OC (Abschnitt 4.1) und eines
einzelnen Kanals dargestellt werden. Dies ermöglicht eine bessere Veranschaulichung der
wesentlichen Mechanismen als die später folgende Analyse für das erheblich kompliziertere
Modell des vorliegenden Kanals.
Sei pj( ∞ ) die Wahrscheinlichkeit, daß sich der Kanal im Zustand j im Steady-State
aufhält, und kij sei die Übergangsrate zwischen dem i-ten und j-ten Zustand. Als Steady-State
wird der Zustand bezeichnet, in dem der Kanal sich in einem stationären Zustand befindet.
Das bedeutet, daß der Kanalstrom im zeitlichen Mittel konstant ist. Das Prinzip der
Mikroreversibilität besagt, daß jeder Reaktionsschritt im zeitlichen Mittel in beide Richtungen
gleich häufig durchlaufen wird (Hinfluß = Rückfluß). So gilt für das Modell OC im
Steady-State die folgende Gleichung:
C
p ( ∞ ) k = p ( ∞)
k
(7.1)
O
O
OC
C
CO
42
CO
pO( ∞)
kCO
⇒
=
p ( ∞)
+ p ( ∞)
k + k
OC
(7.2)
Der scheinbare Einzelkanalstrom ergibt sich durch den Mittelungsprozeß des Meßfilters
über die schnell umschaltenden Offen- und Geschlossenzeiten (Zustand O und C) des Kanals.
Damit ist der Strom proportional zur relativen Offenwahrscheinlichkeit:
pO( ∞)
⇒i
∝
(7.3)
p ( ∞)
+ p ( ∞)
C
O
Die Gleichungen (7.2) und (7.3) liefern die Beziehung zwischen den Übergangsraten und
dem mittleren Strom. Sie lautet:
k
CO ⇒ i∝
(7.4)
kCO
+ kOC
Formel (7.4) stellt einen direkten Zusammenhang zwischen den Übergangsraten und dem
Stromniveau bei dem Zustandsmodell OC und einem Einzelkanal im Falle unentdeckten
schnellen Schaltens her.

Kapitel 7: Meßergebnisse
Reale Messungen haben aber mehr als einen Kanal und meistens mehr Zustände als das
OC Modell. Dies gestaltet die kinetische Untersuchung eines realen Kanals sehr
schwierig.
Um zu überprüfen, ob der Mechanismus von Draber und Hansen (1994) auch hier zutrifft,
wird zuerst versucht, mit Hilfe der Dwell-Time-Histogramme (Abschnitt 7.3) das richtige
Markov-Modell zu finden. Prinzipiell ist dieses Problem nicht eindeutig (Kienker, 1989).
Allerdings genügt es für die Fragestellung hier, eine korrekte kinetische Beschreibung zu
gewinnen. Es ist für die Berechnung des mittleren Stromes nicht notwendig, das "wahre"
Modell aus einer Klasse kinetisch äquivalenter Modelle zu bestimmen.
Die erste Information über die Anzahl der Zustände des Modells gewinnt man aus der
Anzahl der Zeitkonstanten, die notwendig für den Fit der Dwell-Time-Histogramme sind. Die
entsprechenden Diagramme ergeben so die Anzahl der Offen- und Geschlossenzustände.
Danach werden die Ratenkonstanten ermittelt und die in verschiedenen Badlösungen
erhaltenen Werte miteinander verglichen. Daraus gewinnt man die in obigen Gleichungen
wichtigen Besetzungswahrscheinlichkeiten jedes einzelnen Zustands. Ausgehend von der
Betrachtung der Übergangsraten und Besetzungswahrscheinlichkeiten wird ein Teilsystem des
Markov-Modells ausgewählt, das verantwortlich für das schnelle Schalten ist. Für dieses
Teilmodell werden wieder die Besetzungswahrscheinlichkeiten bestimmt. Mit Hilfe einer
ähnlichen Beziehung kann dann wie in Formel 7.3 der scheinbare (gemittelte)
Einzelkanalstrom abgeschätzt werden. Mit dieser Abschätzung wird versucht, die Hypothese
des schnellen Schaltens für die scheinbaren Stromreduzierungen zu untermauern.
7.3 Verweildauerhistogramme
7.3.1 Analyseprogramme
Im obigen Abschnitt wurde der Weg skizziert, um aus der kinetischen Analyse die
Hypothese der Einzelkanalstromreduzierung durch schnelles Schalten zu verifizieren. Hierzu
muß das Zeitverhalten des Kanals mathematisch beschrieben werden. Im Abschnitt 4.1 sind
die für diesen Zweck benutzten Markov-Prozesse dargestellt.
Das Schaltverhalten wird mit Hilfe der Ratenkonstanten der Übergänge zwischen den
Zuständen des Kanals direkt beschrieben. Im Rahmen dieser Arbeit interessiert die Änderung
der Ratenkonstanten bei den unterschiedlichen Lösungen und Temperaturen.
Es gibt zwei Möglichkeiten, die Ratenkonstanten zu bestimmen. Die erste Methode ist
der direkte Fit der Zeitreihe mit einem Hidden-Markov-Modell (HMM-Fit). Das Attribut
„Hidden“ bekommt ein Markov-Modell, wenn mehrere kinetisch verschiedene Zustände zur
gleichen elektrischen Leitfähigkeit führen (mehrere O- oder C-Zustände) und/oder das
Ausgangssignal durch Rauschen gestört ist. Beides trifft hier zu.
Beim direkten Zeitreihenfit wird ausgehend vom Zustand des Kanals zum Zeitpunkt nT
die Wahrscheinlichkeit des Zustandes zum Zeitpunkt (n+1)T mit einem 1-Schritt
Prädiktionsalgorithmus geschätzt und mit dem gemessenen Strom verglichen (Horn und
Lange 1983; Fredkin und Rice, 1992; Albertsen und Hansen, 1994; Klein et al., 1997). Die
Ratenkonstanten des verwendeten Modells werden so lange mit einem Simplex Algorithmus
(Nedler und Mead, 1965; Caceci und Cacheris, 1984) variiert, bis das Maximum der
Likelihood für die gemessene Zeitreihe erreicht ist.
Der Nachteil dieser Analyse ist wie bei allen Verfahren, daß das Modell bekannt sein
muß, so daß verschiedene Modelle sequentiell getestet werden müssen, um das mit der
maximalen Maximum-Likelihood auszuwählen. Daraus ergibt sich das Hauptproblem: der
43

Kapitel 7: Meßergebnisse
Zeitbedarf, der zwischen 30 min bis 100h pro 10-s Meßreihe liegen kann (Albertsen, 1994;
Albertsen und Hansen, 1994). Der Vorteil ist, daß zur Berechnung der Maximum-Likelihood-
Funktion die Originalstromwerte aus der gemessenen Zeitreihe entnommen werden. Dadurch
können die schnellen Ratenkonstanten genauer bestimmt werden, weil die Fehler eines
Sprungdetektors (Hinkley-Detektor, Abschnitt 6.9.2) umgangen werden. Dies löst das
Problem der missed-events (Draber und Schulze, 1994) weit besser. Doch wegen des hohen
Zeitaufwands beim Fitten wurde dieses Analyseverfahren nur zu Kontrollzwecken
angewendet.
Der Vorteil der Vermeidung eines Sprungdetektors geht bei der zweiten Methode, der
Auswertung von Dwell-Time-Histogrammen mit dem Target-Fit (Kijima und Kijima, 1987b;
Blunck, 1996; Kirst, 1997), verloren. Die Dwell-Time-Histogramme geben die
Wahrscheinlichkeitsverteilungen der Aufenthaltszeiten in den verschiedenen Stromniveaus
wieder. Um diese Dwell-Time-Histogramme zu erhalten, muß die gemessene Zeitreihe einen
Sprungdetektor (Hinkley-Detektor achter Ordnung, Abschnitt 6.9.2, Schultze und Draber,
1993) durchlaufen. Der Sprungdetektor stellt die rauschfreie, rekonstruierte Zeitreihe her. Ein
Buchhalterprogramm des Hinkley-Detektors stellt die Anzahl der gefundenen Verweildauern
pro Stromniveau zu Histogrammen zusammen.
Das Dwell-Time-Histogramm gibt an, wie häufig die Verweilzeit zwischen t und t+ ∆t
auftrat. Die Dwell-Time-Histogramme, die der Sprungdetektor ausgibt, sind in 500 “bins“
(Abszissenbereiche ∆ t ) eingeteilt. Die Größe eines Bins ist 40 µs. Um die statistischen
Abweichungen im Bereich der längeren Meßereignisse zu reduzieren, werden die Daten in
exponentiell wachsenden Zeitintervallen gemittelt. Die Anzahl der Bins reduziert sich auf 50.
Die Bin-Weite, die der Hinkley-Detektor benutzt, um die Dewll-Time-Histogramme zu
erstellen, war wie oben erwähnt 40 µs. Dies ist aber nicht der kleinste Abszissenwert im
Histogramm. Nach Colquhoun et al. (1996) bewirken die missed-events, daß die Dwell-Time-
Histogramme mit einer Funktion t n exp(-t / τ) gefittet werden müssen. Dadurch erhält man
einen ansteigenden Teil in den Dwell-Time-Histogrammen. Colqhoun et al. (1996) haben
gezeigt, daß man das τ gut bestimmen kann, wenn man die ersten 2-3 Werte am ansteigenden
Ast fortläßt. Deshalb beginnen die Dwell-Time-Histogramme bei 80 oder 120 µs. Dies gibt
einen groben Anhaltspunkt für den Bereich, in dem die Zeitkonstanten noch einigermaßen gut
bestimmt werden können.
Der Sprungdetektor ist das kritische Element in dieser Analyse. Allerdings steht mit dem
von Schultze und Draber (1993) entwickelten Hinkley-Detektor höherer Ordnung im
Programm „day“ der zur Zeit beste Detektor zur Verfügung. Sein Vorteil ist die Anpassung
der Detektorschwelle an das Rauschen. Hierzu bestimmt man durch den bereits erwähnten Fit
(Abschnitt 7.1.1) der Amplitudenhistogramme die Streuung der Stromwerte pro Niveau. Die
Analyse der Histogramme wird ungenau, wenn nicht genügend Daten zur Verfügung stehen.
Einige der Meßreihen werden zum Schluß mit dem direkten Zeitreihen-Fit (HMM-Fit)
analysiert. Die Übergangsratenkonstanten werden somit mit zwei unterschiedlichen Methoden
bestimmt. Zur Analyse der großen Datenmengen kommt eine relativ schnelle, aber nicht sehr
genaue Methode zum Einsatz, und dann eine langsame, aber genauere Methode für bestimmte
ausgewählte Daten. Die langsame Methode liefert damit eine Abschätzung für die
Genauigkeit der mit der schnellen Methode bestimmten Ratenkonstanten.
44

Kapitel 7: Meßergebnisse
7.3.2 Auswahl eines geeigneten Markov-Modells für den K + -Kanal in
Chara
Beide oben beschriebenen Auswertungsverfahren richten sich direkt auf die
Übergangsraten kij im Markov-Modell des Kanals. Die wichtigste Frage ist dabei die Auswahl
des „richtigen“ Modells. Um zu sehen, welche vorgegebenen Markov-Modelle mit den
gemessenen Daten übereinstimmen, wird der Menüpunkt „5-state-model“ im
Auswerteprogramm „day“ (Kirst, 1996) aufgerufen. Dieses ermöglicht die Wahl von
Modellen mit maximal 5 Zuständen und den anschließenden Fit der Dwell-Time-
Histogramme auf der Basis dieses Modells. Folgende Modelle wurden auf ihre Eignung
untersucht (Figur. 7.6):
C1 ⇔ O ⇔ C2
O ⇔ C1 ⇔ C2 ⇔ C3
O1 ⇔ O2 ⇔ C1 ⇔ C2 ⇔ C3
O1 ⇔ O2 ⇔ C1 ⇔ C2
O1 ⇔ C1 ⇔ C2 ⇔ C3
!
O2
C1 ⇔ O1 ⇔ C2 ⇔ O2 ⇔ C3
Fig. 7.6: Mögliche Modelle für den Kalium-Kanal in Chara corallina. O bezeichnet einen Zustand, bei
dem der Ionenkanal offen ist. C sind die Geschlossenzustände. Die Pfeile repräsentieren die Übergänge zwischen
zwei Zuständen. Jedem Übergang wird eine Übergangsrate für die Hin- und Rückreaktion zugeordnet.
Das Modell, welches die experimentellen Daten am besten annäherte und somit genauer
betrachtet wurde, ist das Modell OOCCC. Dieses Ergebnis ergab sich aus den
folgenden Untersuchungen:
Die Modelltestung geschah sowohl an K + -Daten als auch an K + /Tl + -Daten. Hierfür
wurden aus den Zeitreihen nach Fig. 7.1 die Dwell-Time-Histogramme erstellt. Dies
geschieht, wie in Abschnitt 7.3.2 beschrieben, dadurch, daß mit einem Sprungdetektor (siehe
Abschnitt 6.9.2) die Verweilzeiten in den einzelnen Stromniveaus bestimmt und von einem
Buchhalterprogramm in Dwell-Time-Histogrammen zusammengestellt werden.
Blunck (1996) modifizierte die Theorie der Auswertung von Dwell-Time-Histogrammen
von Kijima und Kijima (1987a,b) derart, daß eine Mehrkanalanalyse einfach wurde. Hierbei
werden die Dwell-Time-Histogramme mit Summen von e-Funktionen gefittet, wie es aus der
Theorie der Markov-Prozesse folgt (Abschnitt 4.1).
∑
y ( t)
a exp( −t
/ τ )
(7.5)
= i
i
45
i

Kapitel 7: Meßergebnisse
Während in der Literatur allgemein die Zeitkonstanten i τ und die Amplitudenfaktoren ai das
Ende der Analyse darstellen, geht der Target-Fit weiter. Das Ziel der Analysen sind die
Ratenkonstanten kij. Deshalb läuft das Fitprogramm so ab, daß für ein festes Modell die kij
unter der Lenkung eines Simplexalgorithmus (Nedler und Mead, 1965; Caceci und Cacheris,
1984) geraten und ai und i τ daraus berechnet werden. Die ai und τ i werden im Fitprogramm
mit den folgenden Gleichungen aus den Ratenkonstanten berechnet.
( m)
i
( , ) ( , ) ( )
( ) ( ) . m
mi
T mi
T
v = v K
τ (7.6.a)
a
( m)
i
=
( m)
( m,
i)
∑Rr( ∞)
vr
. ( ∑∑
2Sm 2 ( m)
κ rs)
/ ftr
(7.6.b)
r∈Lr∈L s∉L
m m m
( m)
∑Rr( ∞)
. ∑
( m)
f = 2
κ κ
tr
r∈LS∉L m m
rs
sr
46
(7.6.c)
m Die Anzahl der offenen Kanäle.
Rr
Aufenthaltswahrscheinlichkeiten für den Makrokanal. Ein Makrokanal ist ein
Ensemble von Einzelkanälen, die dann wie ein einziger Kanal mit vielen
Zuständen behandelt wird.
( m )
Rr Zustände Rr von einem Zustand Ym .
Ym Alle kinetisch unterschiedlichen Zustände Rr mit derselben Leitfähigkeit
(gleiche Anzahl von offenen Kanälen) werden in einem Zustand Ym
zusammengefaßt.
Lm Die Menge der Indizes r, die zum Zustand Ym gehören.
Rr( ∞ ) Besetzungswahrscheinlichkeit im stationären Zustand.
κ rs Ratenkonstanten des Makrokanals. Sie stehen mit den Ratenkonstanten des
Einzelkanals wie folgt im Beziehung:
K (m)
v (i)
κ = b . k
(7.7.a)
B
∑
s=
1
s≠r
rs
( r )
i
Q
ij
Q
∑∑
( r )
−κ
= κ = b . k
(7.7.b)
rr
rs
i=
1 j=
1
j≠i
Die Matrix der Ratenkonstanten des Makrokanals.
v (i) sind die Eigenvektoren zur reduzierten Ratenmatrix des absorbierenden
Makrokanalmodells zum Stromniveau m (Gleichung 7.6.a). Der hochgestellte
Index (i) numeriert die verschiedenen Eigenvektoren durch.
Sm Normierungsfaktor.
( m )
f tr Die mittlere Übergangswahrscheinlichkeit für den Makrokanal. Sie wird aus
der Gleichung 7.6.c erhalten.
b (r) ( r ) ( r ) ( r)
( r )
=( b1 ,..., b , b + 1 ,..., b ) Vektor der Besetzungszahlen für die Zustände im
L
L
i
ij
Q
Makrozustand mit b r ( ) ( r ) ( r)
( r )
1 , ... , bL Offenzustände, bL
+1 , ... , bQ Geschlossenzustände.

Kapitel 7: Meßergebnisse
Die Eigenwertgleichung 7.6.a wurde aus einer Differentialgleichung für einen
Makrokanal (eine ähnliche Formel wie die Gleichung 4.1) erhalten.
Der Target-Fit hat mehrere Vorteile gegenüber dem allgemeinen Zeitkonstantenfit. Die
Berechnung der Ratenkonstanten aus den Zeitkonstanten und Amplitudenfaktoren ist sehr
kompliziert und mitunter ungenau, auch wenn neuerdings Jackson (1997) einen neuen
Algorithmus dafür vorgeschlagen hat. Noch wichtiger ist, daß die Dwell-Time-Verteilung für
alle Niveaus in einer Mehrkanalaufzeichnung gleichzeitig gefittet werden müssen. Besonders
wichtig für die Genauigkeit ist dies, wenn der vermutete Effekt des schnellen Schaltens durch
eine einzelne Ratenkonstante verursacht wird.
Die zugehörigen Fitroutinen sind im Programm „Day“ eingebaut (Kirst, 1997).
7.3.3 Der Vergleich von COC- und OOCCC-
Modell
Das erste Modell hat historische Gründe. Eigentlich könnte das COC-Modell von
vornherein ausgeschlossen werden. Doch das Modell COC wurde von Blunck (1996)
zum Nachweis des schnellen Schaltens beim Na + -Block des K + -Kanals in Chara gewählt.
Hierbei wurde von nur einem offenen Zustand ausgegangen. Die Verweilzeit in ihm wird
durch Übergänge in zwei geschlossene Zustände unterbrochen. Nach den Ergebnissen von
Blunck (1996) ist der Kanal in dem einen Zustand über einen längeren Zeitraum geschlossen,
während die Geschlossen-Erreignisse des zweiten Zustandes durch sehr kurze Öffnungen
unterbrochen werden.
Der Ausschluß dieses Modells ergibt sich aus der Regel, daß die Anzahl der Offenzustände
gleich der Anzahl der τ ’s in dem Offen-Dwell-Time-Histogramm und die Anzahl der
Geschlossen-Zustände gleich der τ ’s in dem Geschlossen-Dwell-Time-Histogramm ist. Da
bei dem Offen-Dwell-Time-Histogramm der Fit der Exponentialfunktion zwei Zeitkonstanten
benötigt, sollte ein Modell mit zwei Geschlossenzuständen ausgewählt werden.
Die Folge der zu geringen Zustandszahl ist, daß die theoretischen Kurven nicht
ausreichend an die Meßdaten angepaßt werden konnten (Fig 7.7A-B-C). Die Ergebnisse
weichen besonders bei Fits mit einem Offenzustand und Fits mit zwei Offenzuständen sehr
stark von den Meßdaten ab.
Bei dem OOCCC-Modell sind die Zustände ebenfalls in einer Reihe. Der
Unterschied ist, daß es insgesamt fünf statt der vorherigen drei Zustände gibt (zwei offene und
drei geschlossene Zustände) und die Übergänge auch innerhalb der offenen und der
geschlossenen Zustände liegen können. Der Übergang zwischen geschlossenem und offenem
Zustand ist sehr schnell, was eine Grundvoraussetzung für das schnelle Schalten ist (die
Ratenkonstanten werden im Abschnitt 7.3.5 noch genauer betrachtet).
Das entscheidende Argument ist aber, daß die theoretische Kurve am besten an die
Meßdaten angepaßt werden konnte (Fig 7.8A-B-C). Es wird beobachtet, daß die Meßdaten
von der Fitfunktion eine deutlich geringere Abweichung haben als bei dem COC-
Modell. Deshalb kommt das Modell COC für die weitere Untersuchung der
Ratenkonstanten nicht mehr in Frage.
47

Kapitel 7: Meßergebnisse
Number of events
60
30
Level 0 sublevel 0 jump up + down
0
10 100 1000 10000
Time / µs
Fig. 7.7A:
Level 1 sublevel 0 jump up + down
Number of events
40
20
48
Dwell- time histogram
Fit
Dwell- time histogram
Fit
0
10 100 1000 10000
Time / µs
Fig. 7.7B:
Level 2 sublevel 0 jump up + down
Number of events
6
3
Dwell- time histogram
Fit
0
10 100 1000 10000
Time / µs
Fig 7.7C:
Fig 7.7A-B-C: Ergebnisse des Targets-Fits für das Modell COC. Es sind die Dwell-Time-
Histogramme aus einer Messung mit zwei Einzelkanälen dargestellt. Die Messungen wurden in reinem Kalium
bei Raumtemperatur und Vhold =-60 mV durchgeführt.

Kapitel 7: Meßergebnisse
Number of events
60
30
Level 0 sublevel 0 jump up + down
0
10 100 1000 10000
Time / µs
Fig. 7.8.A:
Level 1 sublevel 0 jump up + down
Number of events
40
20
49
Dwell- time histogram
Fit
Dwell- time histogram
Fit
0
10 100 1000 10000
Time / µs
Fig.7.8B:
Number of events
6
3
Level 2 sublevel 0 jump up + down
Dwell- time histogram
Fit
0
10 100 1000 10000
Time / µs
Fig.7.8C:
Fig. 7.8A-B-C: Ergebnisse des Targets-Fits für das Modell OOCCC. Es sind die Dwell-
Time-Histogramme mit zwei Einzelkanälen dargestellt. Die Messungen wurden für reines Kalium bei
Raumtemperatur und Vhold =-60 mV durchgeführt (Gleiche Daten wie in Fig. 7.7).

Kapitel 7: Meßergebnisse
7.3.4 Betrachtung der Fitergebnisse bei den verschiedenen Modellen
Für die weitere Untersuchung werden Modelle mit zwei offenen und mindestens zwei
geschlossenen Zuständen gewählt, denn die Anzahl der zur Anpassung notwendigen
Zeitkonstanten läßt Rückschlüsse auf die Anzahl der offenen und geschlossenen Zustände zu.
Für den offenen Zustand werden zwei Zeitkonstanten benötigt. Daraus folgt, daß es zwei
offene Zustände gibt. Der geschlossene Zustand verlangt für das Fitten eine Summe von drei
Exponentialfunktionen. Dies ergibt schließlich die Existenz von drei geschlossenen Zuständen
für den Kanal. Das kleinste Modell würde laut dieser Beobachtung ein 5-Zustandsmodell sein.
Zum Test verschiedener Modelle mit 2 Offen- und 3 Geschlossenzuständen werden die
Fits der gemessenen Dwell-Time-Histogramme miteinander verglichen. Es wird beobachtet,
daß sich das OOCCC-Modell am besten an die Meßdaten anpassen läßt
(Fig.7.8). Alle anderen Modelle haben besonders große Abweichungen bei mehreren
Offenzuständen (Fig.7.9A-B-C). Allgemein werden die unteren Niveaus, bei denen wenige
offene Zustände der Kanäle auftreten, besonders gut angepaßt. Der Fehler macht sich
hingegen in den Diagrammen mit mehreren offenen Kanalzuständen besonders bemerkbar, da
hier weniger Daten zur Verfügung stehen und modellbedingte Abweichungen dort nicht sehr
ins statistische Gewicht fallen. Da die Abweichung der Fitergebnisse bei den Meßdaten für
den Zustand mit allen offenen Kanälen am größten ist, werden in Fig. 7.9 nur diese Zustände
gezeigt. Das „richtige“ OOCCC-Modell konnte auch diese Histogramme gut
anpassen (Fig.7.8C). Deshalb sind die weiteren Untersuchungen auf das Modell
OOCCC beschränkt worden.
Number of events
6
3
Level 2 sublevel 0 jump up + down
0
10 100 1000 10000
Time / µs
Fig. 7.9A:
Level 2 sublevel 0 jump up + down
9
Dwell- time histogram
6
Fit
Number of events
3
50
Dwell- time histogram
Fit
0
10 100 1000 10000
Time / µs
Fig 7.9B:

Kapitel 7: Meßergebnisse
Number of events
6
3
Level 2 sublevel 0 jump up + down
51
Dwell- time histogram
Fit
0
10 100 1000 10000
Time / µs
Fig 7.9C:
Fig 7.9A-B-C: Vergleich der Target-Fits für das Modell (A) O ⇔ O ⇔ C ⇔ C, (B)
C ⇔ O ⇔ C ⇔ O ⇔ C und (C) O ⇔ C ⇔ C ⇔ C.
! O
Es sind nur die Dwell-Time-Histogramme mit zwei Einzelkanälen dargestellt. Die Messungen wurden für
reines Kalium bei Raumtemperatur und Vhold =-60 mV durchgeführt (Gleiche Daten wie in Fig. 7.7).
Das OOCCC-Modell wurde auch für den Kalium-Kanal in der Roggen-
Wurzel angenommen (White, 1996). Allerdings haben die Autoren keine Target-Fits
durchgeführt. Die Anzahl der Offen- und Geschlossen-Zustände wurde aus dem
Zeitkonstantenfit ermittelt, die Anordnung geraten (persönliche Mitteilung) und die
Ratenkonstanten z. T. aus den Verhältnissen der Verweildauern in den Zuständen geschätzt.
7.3.5 Analyse auf der Basis des Modells SOGCZ
Hierbei bedeuten:
O, S zwei Offenzustände
C, G, Z drei Geschlossenzustände
7.3.5.1 Änderung der Ratenkonstanten bei unterschiedlichen Temperaturen
Nachdem sich erwiesen hatte, daß die Dwell-Time-Histogramme, die der Hinkley-
Detektor ausgibt, mit dem OOCCC-Modell am besten angefittet wurden,
diente es als Grundlage bei der Untersuchung der Rolle des schnellen Schaltens beim AMFE.
Bei der Auswertung wurden aber nur Datensätze verwendet, die nicht mehr als drei Kanäle
enthielten. Dies liegt daran, daß das Day-Programm in Pascal geschrieben worden war (Kirst,
1996) und daß auch nach Ausschöpfung aller Tricks die Arraygrößen bei 5-Zustandsmodellen
mit mehr als 3 Kanälen die Kapazität dieser Sprache überschritten.
In Figur 7.10 (K + ) und 7.11 (K + + Tl + ) sind die acht Ratenkonstanten aus dem Target-Fit
aller Messungen zum AMFE dargestellt. Die schnellsten ermittelten Ratenkonstanten liegen
bei ca. 15 000 s -1 . Dies entspricht einer Zeitkonstanten von 60 µs und liegt damit noch im
Bereich der Dwell-Time-Histogramme, die bei 80 bis 120 µs anfangen. Wie oben erwähnt,
werden aufgrund der missed-events Verfälschung die Datenpunkte auf dem ansteigenden Ast
fortgelassen. Doch da die Bestimmung einer Zeitkonstanten eine Systemidentifikation ist, gilt
für sie keine Einschränkung durch das Shannonsche Abtasttheorem: Man kann in

Kapitel 7: Meßergebnisse
Abhängigkeit vom Signal/Rauschverhältnis durchaus Zeitkonstanten bestimmen, die schneller
sind, als das Inverse der hochfrequente Grenze des Dwell-Time-Histogramms.
Als erstes ist festzustellen, daß diese Ratenkonstanten kein inverses Verhalten zeigen,
d.h. keine dieser Konstanten wächst mit der Temperatursenkung. Dies mag auf den ersten
Blick nicht erwähnenswert sein, doch Zanello and Barrantes (1994) haben für Messungen in
K + -Lösung inverses Verhalten bei den Ratenkonstanten gefunden. Inverses Verhalten wäre ein
Hinweis auf ein falsches Modell oder nicht ausreichende Zeitauflösung. Letzteres lag bei
Zanello und Barrantes (1994) vor.
a) Die Wahl eines falschen Modells enthält die implizierte "Umrechnung" des Richtigen
in das Falsche. Die Ratenkonstanten des falschen Modells enthalten dann algebraische
Kombinationen des richtigen Modells. So könnten z.B. solche Ratenkonstanten entstehen wie
kfalsch=k1 - k2. Wenn nun bei der Temperaturreduzierung k2 stärker abnimmt als k1, wird kfalsch
mit sinkender Temperatur größer.
b) Bei einer geringeren Auflösung kann die größere Ratenkonstante auch ein inverses
Verhalten zeigen. Es gibt folgende Erklärung: Bei unvollständiger Auflösung kommt es zu
einer Reihe von missed-events, d.h. Ereignissen (offen oder geschlossen), die der Hinkley-
Detektor nicht mehr auflösen kann. Wenn die kürzeren Ereignisse nicht erkennbar sind, kann
dieses zu einer langsameren Ratenkonstanten führen. Wie Draber und Schultze (1994a)
gezeigt haben, gibt es eine Inversion. Die Theorie liefert eine doppelte Lösung für die sich
daraus ergebende Zeitkonstante, wobei die eine Lösung sich in umgekehrter Richtung wie die
wahre bewegt. Wird also eine Zeitkonstante bei der Temperatursenkung langsamer, kann die
gemessene durch den missed-events-Effekt schneller werden.
Bei einem inversen Verhalten sollte deshalb eine missed-events-Korrektur (Draber und
Schultze, 1994a) angewandt werden. Bei Draber und Schultze (1994a) wird im Gegensatz zur
früheren Theorie (Crouzy und Sigworth, 1990) ein Gedächtnis (Filter) des Detektors
mitberücksichtigt.
Da bei der Untersuchung kein inverses Verhalten aufgetreten ist, spricht dieses für das
gewählte Modell und eine ausreichende Auflösung. Daher wird auf die missed-events-
Korrektur verzichtet. Sie ist im Falle der Mehr-Kanal-Mehr-Zustandsanalyse außerordentlich
kompliziert und würde die Rechenzeiten so stark verlängern, daß die Auswertung unmöglich
wird (Blunck et al., 1998).
kos / Hz
10000
1000
100
[ A ]
K tiefe Tem peratur
K R aum tem peratur
-80 -40 0 40 80
U / m V
52
10000
kso / Hz
1000
100
[ B ]
K tiefe Tem peratur
K R aum tem peratur
-80 -40 0 40 80
U / m V

Kapitel 7: Meßergebnisse
10000
kog / Hz
kgc / Hz
1000
100
[ C ]
K tiefe Tem peratur
K R aum tem peratur
-80 -40 0 40 80
U / m V
10000 [ E ]
1000
100
K tiefe Tem peratur
K Raum tem peratur
-80 -40 0 40 80
U / mV
kcg / Hz
kgo / Hz
53
10000
10000
1000
1000
100
100
[ D ]
K tiefe Tem peratur
K R aum tem peratur
-80 -40 0 40 80
U / m V
[ F ]
K tiefe Tem peratur
K Raum tem peratur
-80 -40 0 40 -80
U / mV

Kapitel 7: Meßergebnisse
kcz / Hz
10000
1000
10 0
[ G ]
K tiefe Temperatur
K Raumtemperatur
-80 -40 0 40 80
U / mV
kzc / Hz
10000
54
1000
10 0
[ H ]
K tiefe Temperatur
K Raumtemperatur
-80 -40 0 40 80
U / mV
Fig 7.10A-B-C-D-E-F-G-H: Zeitkonstanten aus dem Target-Fit für den Kanal in Tl + -freier Lösung in
Abhängigkeit von Vhold bei Raumtemperatur (22 °C) und tiefer Temperatur (7 °C).
kos / Hz
10000
1000
100
[A]
K+Tl tiefe Tem peratur
K+Tl Raum tem peratur
-100 -50 0 50 100
U / m V
10000
kso / Hz
1000
100
[B]
K+Tl tiefe Tem peratur
K+Tl Raum tem peratur
-100 -50 0 50 100
U / m V

Kapitel 7: Meßergebnisse
10000
kgo / Hz
1000
100
10000
kgc / Hz
1000
100
[C]
K+Tl tiefe Tem peratur
K+Tl Raum tem peratur
-100 -50 0 50 100
U / m V
[E]
K+Tl tiefe Temperatur
K+Tl Raumtemperatur
-100 -50 0 50 100
U / mV
10000
kog / Hz
1000
kcg / Hz
55
100
10000
1000
100
[D]
K+Tl tiefe Tem peratur
K+Tl Raum tem peratur
-100 -50 0 50 100
U / m V
[F]
K+Tl tiefe Temperatur
K+Tl Raumtemperatur
-100 -50 0 50 100
U / mV

Kapitel 7: Meßergebnisse
kcz / Hz
10000
1000
100
[G]
K+Tl tiefe Temperatur
K+Tl Raumtemperatur
-100 -50 0 50 100
U / mV
kzc / Hz
10000
1000
100
56
[H]
K+Tl tiefe Temperatur
K+Tl Raumtemperatur
-100 -50 0 50 100
U / mV
Fig. 7.11A-B-C-D-E-F-G-H: Zeitkonstanten aus dem Target-Fit für den Kanal bei Anwesenheit von
Tl + in Abhängigkeit von Vhold bei Raumtemperatur (22 °C) und tiefer Temperatur (7 °C).
Das Datenmaterial in Fig. 7.10 und Fig. 7.11 ist auf einen Blick schwer zu überschauen.
Deshalb wird eine zusammengefaßte Darstellung gegeben. In den folgenden vier
Kanalmodellen für Tl + -freie und Tl + -haltige Lösung sind die Mittelwerte der Ratenkonstanten
kij aus den Messungen mit negativen Spannungen eingetragen.
Der wichtigste Unterschied liegt bei kOG für K.22 (6000) gegenüber T.22 (7300) und bei
kGO für K.22 (9400) gegenüber T.22 (7000).
S
S
S
S
k
k
k
k
k
k
k
k
SO
OS
SO
OS
= 8400
k
OG
GC
CZ
⇔ O ⇔ G ⇔ C ⇔ Z [K.22]
= 10000
= 3400
k
k
Go
OG
= 6000
= 9400
k
k
Cg
GC
= 5200
= 2500
k
k
ZC
= 2200
= 500
⇔ O ⇔ G ⇔ C ⇔ Z [K.7]
SO
OS
SO
OS
= 8300
= 8400
k
GO
k
OG
= 2800
= 4100
k
k
CG
GC
= 3500
= 2300
k
k
CZ
ZC
= 2100
= 300
⇔ O ⇔ G ⇔ C ⇔ Z [T.22]
= 13000
= 4500
k
k
GO
OG
= 7300
= 7000
k
k
CG
GC
= 5700
= 2500
k
k
CZ
ZC
= 1700
= 600
⇔ O ⇔ G ⇔ C ⇔ Z [T.7]
= 8100
k
GO
= 2300
= 6600
k
k
CG
= 5500
= 2200
k
k
CZ
ZC
= 1700
= 500
Fig. 7.12: Kanalmodelle mit eingetragenen Ratenkonstanten aus den Mittelwerten bei negativen Spannungen
aus Fig. 7.10 und Fig. 7.11 für (K) Tl + -freie und (T) Tl + -haltige Lösungen. Die Indizes (22) bzw. (7) beschreiben
die Zustände bei Raumtemperatur (22 °C) bzw. bei tiefer Temperatur (7 °C).

Kapitel 7: Meßergebnisse
7.3.5.2 Änderung der Ratenkonstanten unter Einfluß von Tl +
7.3.5.2.1 Mittelung im Burstbereich
In den Vorläuferarbeiten (Draber et al., 1991; Draber und Hansen, 1994; Keunecke, 1995;
Blunck, 1996) stand die Hypothese im Vordergrund, daß schnelles Schalten im Burstbereich
eine scheinbare Reduzierung des Einzelkanalstromes erzeugt. Wie der Abschnitt 7.3.8 zeigt,
ist die Situation hier anders, weil die Bestimmung der Einzelkanalströme und der
Ratenkonstanten vom gleichen Datenmaterial ausgeht, daß der gleiche Filter durchlaufen hat.
Doch um die Ergebnisse hier einmal im Lichte der Hypothese der Vorläufermodelle zu
betrachten, soll so getan werden, als würde bei der Bestimmung des Einzelkanalstromes über
die Burstbereiche gemittelt. Diese Rechnungen haben neben dem genannten historischen
Grund auch eine praktische Aussage. Viele Patcher arbeiten mit geringerer Zeitauflösung als
die hier benutzte. Für diese Untersuchungen sind die folgenden Analysen von hoher Relevanz.
Es müssen also Bereiche herausgesucht werden, bei denen die Mittelung über viele
Schaltereignisse an einem zu niedrigeren geschätzten Einzelkanalstromwert führt. Fig. 7.1 und
7.2 zeigen das Problem der Stromwertschätzung. Einzelne kurze Öffnungen können nicht für
die Schätzung benutzt werden, wie z. B. die Werte bei mittleren Niveau bei 0.25 s in Fig. 7.2.
Man braucht eine etwas längere „Wolke“, von ca. 1 bis 2 ms bei einem
Signal/Rauschverhältnis von ca. 2 bis 3 um den Schwerpunkt für die Stromschätzung zu
treffen. Diese Mittelzeit ist abhängig vom Signal/Rauschverhältnis der gemessenen Zeitreihe.
Das Gleiche gilt für die Amplitudenhistogramme Fig. 7.3 Die Lage des Maximums ergibt sich
aus der Betrachtung der Kurvenform der Verteilung. Auch dies ist ein Mittelungsprozeß.
Zur Veranschaulichung der damit verbundenen Problematik gehen wir erst einmal davon
aus, daß ein Mittelungsprozeß wie in Fig. 5.2 vorläge. Die Richtigkeit dieser Annahme wird
im Licht der folgenden Ergebnisse dann noch einmal diskutiert.
Die Frage ist jetzt, welche Einheit für den Mittelungsprozeß betrachtet wird. So ein
Abschnitt schnellen Schaltens, wie er z. B. nach 0.25 s in Fig. 7.2 auf dem zweiten (untersten)
Niveau auftritt, wird Burst genannt. Es ist deshalb zu untersuchen, ob ein Teilbereich des
Modells isoliert werden kann, der für die Bursts verantwortlich ist. Bursts sind Perioden
schnellen Schaltens, die von etwas längeren Geschlossen-Zuständen unterbrochen werden. Im
Sinne des AMFEs ist dann zu untersuchen, ob eine Mittelung über die Offen- und
Geschlossenzeiten im Burst die Reduzierung des scheinbaren Einzelkanalstroms bei
Anwesenheit von Tl + widerspiegelt.
Eine Inspektion der Kanalmodelle in Fig. 7.12 zeigt folgendes: Die Ratenkonstanten des
Überganges zwischen den benachbarten Offen- und Geschlossenzuständen (O und G) sind
sehr hoch. Sie sind für das sogenannte Flickern im Burst verantwortlich. Die Frage ist, was
einen Burst beendet. Der Austausch O-S ist ebenfalls sehr schnell, so daß durch einen Sprung
in S kein "Einfrieren" im Offenzustand das Flickern beenden würde.
Die Übergangsrate kGC ist deutlich größer als die Übergangsrate kCG sowohl in Tl + -freier
wie in Tl + -haltiger Lösung bei Raumtemperatur (siehe Fig. 7.12.A und 7.12.B). Die
Ratenkonstante kCG ist für den unblockierten Kanal im Bereich 1000 bis 2500 Hz und kGC im
Bereich 3500 bis 6500 Hz. Für den blockierten Kanal liegt die Ratenkonstante kCG zwischen
1800 und 3600 Hz und kGC zwischen 3800 und 7800 Hz. Der Rücksprung von C nach G hat
damit eine Ratenkonstante, die um den Faktor drei kleiner ist als die des Flickerns zwischen
S, O und G und sie entspricht einer Zeitkonstante von ca. 3 ms, die zu den Lücken zwischen
den Bursts paßt. Außerdem kann der Kanal mit gleicher Wahrscheinlichkeit in den Zustand Z
springen. Wenn der Kanal sich im Zustand Z befindet, ist er damit aus den schnellen
57

Kapitel 7: Meßergebnisse
Schaltvorgängen ganz heraus (auf dem obersten Niveau (Grundniveau) von 0.5 s in Fig. 7.2
und die lange Stufe rechts in Fig. 6.4).
Die Ratenkonstante des Überganges von G nach C bestimmt die Länge des Bursts, die
Verweildauer in C oder Z die Pause zwischen den Bursts. Diese Verweildauer in C ist
bestimmt durch die Übergänge von Zustand C nach Zustand Z oder G. Beide Übergänge sind
deutlich langsamer als die schnellen Ratenkonstanten des Bursts. Deshalb wird für die
Untersuchung des Bursts nur das Teilmodell SOG vom Gesamtmodell
SOGCZ betrachtet.
Die Spannungsabhängigkeit der Ratenkonstanten steht nicht im Interesse dieser Arbeit.
Dennoch ist bei verschiedenen Spannungen gemessen worden. Die Fig. 7.10 bis 7.11 zeigen,
daß keine große Spannungsabhängigkeit im Bereich des AMFEs besteht. Durch die
Messungen bei unterschiedlichen Spannungen steht jedoch ein größeres Datenmaterial für den
Vergleich der Ratenkonstanten bei unterschiedlichen Temperaturen und für den blockierten
und unblockierten Fall zur Verfügung.
Für diesen Vergleich sind die Ratenkonstanten aus Fig. 7.10 und 7.11 noch einmal so
zusammengestellt worden, daß K + - und K + + Tl + -Werte direkt miteinander verglichen werden
können. Auf den ersten Blick werden keine großen Unterschiede zwischen den
Ratenkonstanten in den unterschiedlichen Lösungen beobachtet. Der größte Unterschied wird
bei der schnellsten Ratenkonstante kos gefunden. In Raumtemperatur und für negative
Spannungen liegt die Ratenkonstante kos der K + /Tl + -Gemischlösung zwischen 11000 und
15000 Hz. Bei reiner Kaliumlösung liegt sie zwischen 9000 und 11000 Hz. Bei einer
Temperatur von 7 °C nimmt die Ratenkonstante kos der K + /Tl + -Gemischlösung zwischen 6500
und 10000 Hz und der K + Lösung zwischen 6000 und 9500 Hz ab (Fig. 7.13.C-D). Somit
unterscheiden sich die Ratenkonstanten bei der Temperatur von 7 °C nicht mehr voneinander.
Dieser Unterschied der Ratenkonstanten der S - O Übergänge kann eigentlich nicht beobachtet
werden, da es sich um einen Übergang zwischen zwei offenen Zuständen handelt. Er hat aber
Auswirkung auf die Besetzungswahrscheinlichkeit der beiden offenen Zustände, worauf in
Abschnitt 7.3.6.2 noch genauer eingegangen wird.
Die interessanten Übergangsraten sind die zwischen dem offenen und geschlossenen
Zustand (kOG, kGO). Bei der Betrachtung jeder dieser einzelnen Ratenkonstanten wird bei
Raumtemperatur ein Unterschied zwischen dem blockierten und unblockierten Kanal
beobachtet, der im Mittelwert ca. 20 % ausmacht (Fig. 7.12). Dies wird noch deutlicher bei
der Betrachtung der Verhältnisse von kGO zu kOG (Fig. 7.14).
10000
kso / Hz
1000
10 0
[A ]
K +T l Raum tem p eratur
K Raum tem p eratur
-10 0 -5 0 0 5 0 10 0
U / mV
10000
kso / Hz
58
1000
10 0
[B ]
K +T l tiefe T em p eratur
K tiefe T em p eratur
-10 0 -5 0 0 5 0 10 0
U / mV

Kapitel 7: Meßergebnisse
10000
kos / Hz
1000
100
10000
kog / Hz
1000
100
[C]
K+Tl Raumtemperatur
K Raumtemperatur
-100 -50 0 50 100
U / mV
[E]
K+Tl Raumtemperatur
K Raumtemperatur
-100 -50 0 50 100
U / mV
10000
kos / Hz
59
1000
10000
kog / Hz
1000
100
100
[D]
K+Tl tiefe Temperatur
K tiefe Temperatur
-100 -50 0 50 100
U / mV
[F]
K+Tl tiefe Temperatur
K tiefe Temperatur
-100 -50 0 50 100
U / mV

Kapitel 7: Meßergebnisse
10000
kgo / Hz
1000
100
10000
kgc / Hz
1000
100
[G]
K+Tl Raumtemperatur
K Raumtemperatur
-100 -50 0 50 100
U / mV
[I]
K+Tl Raumtemperatur
K Raumtemperatur
-100 -50 0 50 100
U / mV
10000
kgo / Hz
60
1000
100
10000
kgc / Hz
1000
[H]
K+Tl tiefe Temperatur
K tiefe Temperatur
-100 -50 0 50 100
100
U / mV
[J]
K+Tl tiefe Temperatur
K tiefe Temperatur
-100 -50 0 50 100
U / mV

Kapitel 7: Meßergebnisse
10000
kcg / Hz
1000
100
10000
kcz / Hz
1000
100
[K]
K+Tl Raumtemperatur
K Raumtemperatur
-100 -50 0 50 100
U / mV
[M]
K+Tl Raumtemperatur
K Raumtemperatur
-100 -50 0 50 100
U / mV
kcg / Hz
61
10000
1000
100
10000
kcz / Hz
1000
100
[L]
K+Tl tiefe Temperatur
K tiefe Temperatur
-100 -50 0 50 100
U / mV
[N]
K+Tl tiefe Temperatur
K tiefe Temperatur
-100 -50 0 50 100
U / mV

Kapitel 7: Meßergebnisse
10000
kzc / Hz
1000
100
[O]
K+Tl Raumtemperatur
K Raumtemperatur
-100 -50 0 50 100
U / mV
10000
kzc / Hz
1000
62
100
[P]
K+Tl tiefe Temperatur
K tiefe Temperatur
-100 -50 0 50 100
U / mV
Fig. 7.13A-C-E-G-I-K-M-O: Vergleich der verschiedenen Ratenkonstanten aus dem Target-Fit für
den blockierten und unblockierten Kanal in Abhängigkeit von Vhold bei Raumtemperatur. Daten von Fig. 7.10 und
7.11 umsortiert.
B-D-F-H-J-L-N-P: Vergleich der verschiedenen Ratenkonstanten aus dem Target-Fit für den
blockierten und unblockierten Kanal in Abhängigkeit von Vhold bei 7 °C. Daten von Fig. 7.10 und 7.11
umsortiert.
Das Verhältnis von kGO zu kOG bei Raumtemperatur ist für den unblockierten
Kanalzustand bei negativer Spannung stets größer. Das bedeutet, daß der unblockierte Kanal
mehr im offenen Zustand verweilt als der blockierte. Für eine genauere Aussage muß
allerdings noch das Verhalten von S in die Untersuchung mit einbezogen werden, da zwischen
S und O ein schneller Austausch besteht. (Der Austausch zwischen G und C wird aus den im
folgenden Abschnitt besprochenen Gründen abgetrennt.)
Die in Fig. 7.14 dargestellten Verhältnisse können die gesuchte Ursache für die
Reduktion des scheinbaren Einzelkanalstroms sein. Je kleiner das Verhältnis von kGO zu kOG
wird, umso längerer werden die Geschlossenzeiten im Burst und um so kleiner erscheint der
gemittelte Einzelkanalstrom.
Für die Chance, den vollen Einzelkanalstrom zu detektieren, gilt folgendes: Je größer kOG
wird (z. B. 5000 bis 10000 Hz), umso kürzer ist die mittlere Aufenthaltszeit im offenen
Zustand (O + S) und umso kleiner die Wahrscheinlichkeit, daß der Ausgang des
Antialiasingfilters in dieser Zeit das volle Niveau erreicht. Die Mittelung zur
Niveaubestimmung in Fig. 7.2 kann dabei zur Reduzierung des Stromniveaus führen
(Abschnitt 5.1). Dies sieht man bei ca. 0.25 ms in Fig. 7.2. Bei einer Temperatur von 7 °C
ändert sich das kGO / kOG Verhältnis besonders im blockierten Kanal. Das Verhältnis nimmt
für den blockierten Kanal zu. Es heißt, daß die Rückreaktion abnimmt.
Der Geschlossen-Zustand in C und Z sollte hingegen gut detektiert werden. Bei
Ratenkonstanten zwischen 2000 und 6500 reicht die Auflösung des Meßsystems bei tres von
40 µs aus.

Kapitel 7: Meßergebnisse
Das Verhältnis von kOS zu kSO unterscheidet sich nicht viel von dem blockierten und
unblockierten Kanal bei Raumtemperatur. Außerdem ist es ein Übergang zwischen zwei
offenen Zuständen, der nicht beobachtet werden kann.
Die Auswirkung des Verhältnisses der Übergangsraten vom Zustand O in den Zustand G
auf die Dauer der Offenzeit des Kanals wird im folgenden genauer untersucht, indem die
Besetzungswahrscheinlichkeiten der Zustände betrachtet werden (siehe Abschnitt 7.3.6).
kos / kso
kgo / kog
6
4
2
0
6
4
2
0
K+Tl Raum tem peratur
K R aum tem peratur
[A]
-100 -50 0 50 100
U / m V
K+Tl R aum tem peratur
K R aum tem peratur
[C]
-100 -50 0 50 100
U / m V
kgo / kog
63
kos / kso
6
4
2
0
6
4
2
0
K+Tl tiefe Tem peratur
K tiefe Tem peratur
[B]
-100 -50 0 50 100
U / m V
K+Tl tiefe Tem peratur
K tiefe Tem peratur
[D]
-100 -50 0 50 100
U / m V
Fig. 7.14A-B: Vergleich des Verhältnisses der Ratenkonstanten von kOS zu kSO aus dem Target-Fit für
den blockierten und unblockierten Kanal in Abhängigkeit von Vhold bei Raumtemperatur und 7 °C.
C-D: Vergleich des Verhältnisses der Ratenkonstanten von kGO zu kOG aus dem Target-Fit für den
blockierten und unblockierten Kanal in Abhängigkeit von Vhold bei Raumtemperatur und 7 °C. Daten aus Fig.
7.10 und 7.11.

Kapitel 7: Meßergebnisse
7.3.6 Betrachtung der Besetzungswahrscheinlichkeiten der einzelnen
Zustände im blockierten und unblockierten Kanal
7.3.6.1 Definition der Besetzungswahrscheinlichkeit
Sei pi(t) der Besetzungszustand, der durch einen Vektor P(t) zusammengefaßt wird, und
die Übergangsratenkonstanten seien als Matrix K mit den Elementen kij dargestellt. So ergibt
sich aus dem Massenwirkungsgesetz für die Flüsse in und aus den Zuständen die folgende
Differentialgleichung:
dP(
t)
= P(
t)
⋅K
dt
64
(7.8)
Für die Berechnung der Steady-State-Verteilung pi(∞) im i-ten Zustand wird
vorausgesetzt, daß die Änderung der Besetzungswahrscheinlichkeiten Null ist. Aus der
Differentialgleichung (7.6) wird das folgende Bestimmungssystem mit dieser Voraussetzung
erhalten:
( ∞), p ( ∞),...
) ⋅ K = 0
p (7.9)
1 ( 2
Das Argument ∞ bedeutet stationäre Zustände. Außerdem gilt, daß die Summe über alle
Besetzungswahrscheinlichkeiten gleich eins sein muß:
∑
i
p ( ∞)
= 1
(7.10)
i
Mit Hilfe der Gleichungen (7.7 und 7.8) wird ein lineares Gleichungssystem erzeugt,
welches für die Bestimmungen der Besetzungswahrscheinlichkeiten angewendet wird.
7.3.6.2 Besetzungswahrscheinlichkeiten im reduzierten Modell
Nach den Überlegungen des vorherigen Abschnitts 7.3.5.2 und, um die Auswirkungen
des schnellen Schaltens auf die Reduzierung des Einzelkanalstroms zu untersuchen, wird ein
Teilbereich des Modells isoliert (siehe Abschnitt 7.3.5.2.1). Für die Betrachtung der Bursts
wird nur das reduzierte Markov-Modell SOG benutzt. Dies ist wie folgt begründet:
Die Ratenkonstanten zwischen den Zuständen SOG sind sehr schnell, und ein Hinund
Herspringen zwischen diesen Zuständen erzeugt das im Burst (Fig. 6.4) vorliegende
schnelle Schalten. Springt das System jetzt von G nach C ist, wie in Abschnitt 7.3.5.2.1
bereits erwähnt, der Burst beendet, denn der Rücksprung von C nach G ist langsamer und in
der Zeitreihe des Stromes kann man die Lücke erkennen (siehe Fig. 7.2). Das Teilsystem
SOG ist damit verlassen. Diese durch Lücken getrennten Bursts werden zur
Einzelkanalstrombestimmung benutzt.
Für das reduzierte 3-Zustandsmodell SOG werden dann die
Besetzungswahrscheinlichkeiten der drei Zustände nach den Gleichungen 7.7 und 7.8 für den
blockierten und unblockierten Kanal bestimmt und miteinander verglichen.

Kapitel 7: Meßergebnisse
Bei einem Vergleich der Besetzungswahrscheinlichkeiten bei Raumtemperatur im
negativen Spannungsbereich zwischen blockierten und unblockierten Kanälen (Fig. 7.15A, C,
E) wird beobachtet, daß die Besetzungswahrscheinlichkeit im Zustand G für den blockierten
Kanal und in den Zuständen O und S für den unblockierten Kanal größer ist. Relativ gesehen
bedeutet dieses, daß die Gaps bei der Lösung mit Kalium und Thallium länger sind als bei
einer Kaliumlösung. Durch die relativ langen Gaps werden die gemittelten Ströme für den
blockierten Zustand im Verhältnis zum unblockierten Zustand kleiner.
Es wird außerdem beobachtet, daß die Besetzungswahrscheinlichkeit des G-Zustands in
der gemischten Lösung bei tiefer Temperatur (Fig. 7.15F) im Verhältnis zur Raumtemperatur
(Fig. 7.15E) abnimmt. Dadurch steigt der mittlere Strom des blockierten Zustands bei
sinkender Temperatur.
Für die reine Kaliumlösung ändert sich das Verhältnis der Besetzung im G-Zustand durch
Temperaturreduzierung (Fig. 7.15E, F) nicht sehr stark. Das heißt, daß der gemittelte Strom
sich durch die Senkung der Temperatur bei reiner K + -Lösung nicht mehr ändert.
Da sich die Besetzungswahrscheinlichkeiten des Zustandes S des blockierten und
unblockierten Zustandes bei Raumtemperatur und tiefer Temperatur nicht sehr unterscheiden
(Fig. 7.15A, B), ändert sich die Besetzung der O-Zustände (Fig. 7.15C, D) in die
entgegengesetzte Richtung wie die der G-Zustände (Fig. 7.15E, F).
Die bisherigen Ergebnisse weisen alle auf die Beteiligung des schnellen Schaltens an der
Entstehung des AMFEs hin. Es soll versucht werden, diesen Effekt der Stromreduzierung mit
Hilfe der Gleichung 7.3 aus den Besetzungswahrscheinlichkeiten des reduzierten
Zustandsmodells zu erklären.
p s
0,6
0,4
[A]
K+Tl Raum tem peratur
K Raum tem peratur
0,2
-120 -80 -40
U / mV
65
p s
0,6
0,4
[B]
K+Tl tiefer Tem peratur
K tiefer Tem peratur
0,2
-120 -80 -40
U / mV

Kapitel 7: Meßergebnisse
p O
G
0,6 [C]
0,4
0,2
K+Tl Raum tem peratur
K Raum tem peratur
-120 -80 -40
U / mV
p O
66
0,6 [D]
0,4
0,2
K+Tl tiefer Tem peratur
K tiefer Tem peratur
-120 -80 -40
0,4
0,2
U / mV
0,6 0,6 [F]
0,4
0,2
[E]
K+Tl Raum tem peratur
K Raum tem peratur
-120 -80 -40
U / mV
p G
K+Tl tiefer Tem peratur
K tiefer Tem peratur
-120 -80 -40
U / mV
Fig. 7.15.A-B-C-D-E-F: Betrachtung der Besetzungswahrscheinlichkeit in den Zuständen S , O und G
für den blockierten und unblockierten Kanal bei Raumtemperatur (A, C, E) und 7 °C (B, D, F) im reduzierten
Markov-Modell SOG.

Kapitel 7: Meßergebnisse
7.3.7 Auswirkungen des schnellen Schaltens auf die Reduzierung des
Einzelkanalstroms
Wie oben ausgeführt sind die Besetzungswahrscheinlichkeiten der Offen- und
Geschlossen-Zustände des reduzierten Teilmodells SOG von Wichtigkeit für den
gemittelten Strom (Abschnitt 7.3.6.2).
Die Teilbehandlung der drei Zustände erfordert, daß die Summe der drei
Aufenthaltswahrscheinlichkeiten auf 1 normiert wird (verweilt im Burst Teilsystem oder
nicht). Die Offenwahrscheinlichkeit dieses reduzierten Zustandsmodells ist damit proportional
zum Strom:
* *
∝pO( ∞)
+ pS
( ∞)
i (7.11)
So werden die Besetzungswahrscheinlichkeiten des reduzierten Markov-Modells, die im
Abschnitt 7.3.6.2 bestimmt worden sind, entnommen, und daraus wird die
Offenwahrscheinlichkeit im Burstbereich bestimmt. Mit Hilfe der Beziehung (7.11) wird eine
dem Stromwert proportionale Größe erhalten. Es wird diese Größe für den blockierten und
unblockierten Kanal bei Raumtemperatur und 7 °C verglichen. Weiterhin werden die
ermittelten Werte aus der Beziehung 7.9 mit den gemessenen Stromwerten verglichen.
K +
K + + Tl +
K +
K + + Tl +
T / °C itheo σ SEW imess σ SEW
20 0.79 0.07 0.02 0.79 0.1 0.03
20 0.7 0.18 0.05 0.6 0.14 0.03
7 0.81 0.07 0.03 0.81 0.1 0.03
7 0.85 0.05 0.02 0.75 0.08 0.03
Tabelle 7.1: Vergleich der theoretischen (Gleichung 7.11) Stromwerte itheo mit den gemessenen imess
Sigma ist die Schwankung des Meßwertes, SEW ist die Schwankung des Erwartungswertes = σ / n . Bei der
Mittelung wurden die Daten von -60 mV, -80 mV und -100 mV zusammengefaßt, um die statistische Sicherheit
zu erhöhen. In der Zeile imess sind die gemessenen Stromwerte für die direkte Abschätzung der kinetischen
Effekte auf die jeweiligen itheor-Werte für K + normiert worden, um die nicht interessierende
Temperaturabhängigkeit des wahren Einzelkanalstromes zu eliminieren.
Die Ergebnisse in Tab. 7.1 zeigen den gewünschten Effekt in Aufzeichnungen, die über
die Burstbereiche mitteln. Bei Raumtemperatur liegt der nach Gleichung 7.11 berechnete
Strom für die K + / Tl + -Mischung um 10% unter dem in K + . Bei 7 °C ist der Strom der
Mischung leicht größer als der im reinen K + . Während der Wert bei Raumtemperatur
außerhalb des Fehlerbereichs liegt, liegt er bei 7 °C innerhalb.
Bei den gemessenen Werten liegt der Strom für die K + / Tl + -Mischlösung um mehr als
20% unter dem in K + -Lösung. Auch bei tieferer Temperatur ist der Strom in der K + / Tl + -
Mischlösung auch unter dem der reinen K + -Lösung, allerdings ist dieser Unterschied um den
Faktor 3 geschrumpft und kaum noch signifikant.
Die Frage, die sich in Anbetracht der großen Streuung der Ratenkonstanten (Fig. 7.13)
stellt, ist die nach der Signifikanz der Aussage. Die Streuungen σ sind im Verhältnis zum
Unterschied zwischen den itheo-Werten groß. Doch bei der Zuverlässigkeit eines Mittelwertes
interessiert die Schwankung des Erwartungswertes (SEW in Tab. 7.1). Betrachtet man den
SEW in Tab. 7.1, so sieht man, daß sich die Fehlerbereiche bei Raumtemperatur nicht mehr
67

Kapitel 7: Meßergebnisse
überlappen. Bei 7°C gibt es eine leichte Überlappung der beiden Fehlerbereiche des SEWs.
Die Signifikanz dieser Aussage wird im folgenden Abschnitt diskutiert.
7.3.8 Die Anwendbarkeit des Mittelungsmodells
Die obige Berechnung zu dem in Fig. 5.2 dargestellten Mittelungseffekt geschah
hauptsächlich aus historischen Gründen. Als Leitfaden stand am Anfang dieser Arbeit der
Erfolg von Draber und Hansen (1994), den Cs + -Block auf solch einen Mittelungseffekt
zurückzuführen. Deshalb war untersucht worden, welche Ergebnisse sich unter den
Voraussetzungen der Draberschen Untersuchungen ergeben hätten. Dieses Konzept wäre
übertragbar, wenn die Strombestimmung mit 5 kHz Filterung und die kinetische Analyse bei
100 kHz durchgeführt worden wäre. Doch das ist hier nicht der Fall. Die Analysen fanden am
gleichen, mit hoher Abtastrate aufgenommenen Datensatz statt.
Was hier vorliegen könnte, sei an Fig. 7.16 illustriert: Hier sind drei Fälle dargestellt.
Links und rechts die beiden Extremfälle von guter und sehr schlechter zeitlicher Auflösung,
die auch in Fig. 5.2 dargestellt sind. In der Mitte ist der Fall zu sehen, der jetzt für die
Interpretation der Daten der vorliegenden Arbeit benutzt werden soll. Das Schalten liegt an
der Grenze des Auflösungsvermögens der kinetischen Analyse. Man erkennt, daß der
Hinkley-Detektor das schnelle Schalten noch gut erkennen könnte (wie in Fig. 7.2), doch die
vollen Stromniveaus würden nicht erreicht.
Fig. 7.16: Effekt des Tiefpassses beim schnellen Schalten (Blunck, 1996). Die gegebene Punkte sind die
Abtastpunkte. Langsames Schalten (links), Schaltgeschwindigkeit an der Auflösungsgrenze (Mitte), Mittelung
über sehr schnelles Schalten (rechts). Zur Veranschaulichung sind die Öffnungszeiten jeweils gleich lang
gezeichnet. Eigentlich ist eine statistische Verteilung wie in Fig. 5.2 anzunehmen.
Die Stromreduzierung im mittleren Abschnitt von Fig. 7.16 hat eine andere Ursache als
die Mittelung über Offen- und Geschlossenzeiten wie bei Draber und Hansen (1994). Hier
liegt sie daran, daß zu viele Datenpunkte auf der Flanke der Filterantwort genommen werden,
bevor das volle Stromniveau erreicht wird.
Um zu überprüfen, ob so ein Effekt vorliegt, wird aus den gemittelten Daten T22 von Fig.
7.12 ein Amplitudenhistogramm hergestellt. Dazu werden die Ratenkonstanten in das
Simulationsprogramm von Rießner eingegeben und mit einem Signal/Rauschverhältnis von 4
verrauscht. Das Besselfilter ist wie im aktuellen Versuch auf 25 kHz eingestellt.
Diese simulierten Zeitreihen entsprechen den gemessenen. Der Unterschied ist, daß der
Einzelkanalstrom (6 pA) als bekannt in die Simulation hineingesteckt wird. Jetzt ist zu
68

Kapitel 7: Meßergebnisse
überprüfen, welch ein Einzelkanalstrom aus den simulierten Daten zurückgewonnen werden
kann.
Diese Rekonstruktion ist für 3 Modelle durchgeführt worden, und zwar für das volle
Modell und für die Teilmodelle SOGC und SOG, um zu sehen, welcher
Teil des Modells gegebenenfalls für einen Effekt auf den Einzelkanalstrom zuständig ist.
Fig. 7.17A: Amplitudenhistogramm aus simulierten Daten mit 10 6 Abtastpunkten und einer Abtastrate
von 100 kHz, 4-poliges Besselfilter von 25 kHz. Signal/Rauschverhältnis 4. Die zur Simulation des
SOGCZ-Modells benutzten Ratenkonstanten sind die Mittelwerte T22 aus Fig. 7.12 (N:
Häufigkeit).
Fig. 7.17A geht vom vollen Modell aus. Das Amplitudenhistogramm zeigt keine
Abweichung vom nominellen Strom von 6 pA. Dies liegt am hohen Anteil der langen
Verweildauern im geschlossenen Zustand, die das Nullniveau festhalten.
Fig. 7.17B: Amplitudenhistogramm aus simulierten Daten mit 10 6 Abtastpunkten und einer Abtastrate
von 100 kHz, 4-poliges Besselfilter von 25 kHz. Signal/Rauschverhältnis 4. Die zur Simulation des
SOGC-Modells benutzten Ratenkonstanten sind die Mittelwerte T22 aus Fig. 7.12 (N: Häufigkeit).
In Fig. 7.17B ist das 4-Zustandsmodell gezeigt. Hier ergab sich aus dem Fit des
Amplitudenhistogramms mit einer Summe von Gaußhügeln ein Einzelkanalstrom von 5.94
69

Kapitel 7: Meßergebnisse
pA. Da man diesen Unterschied gegenüber 6.00 pA nicht sehen würde, ist nicht der 5.94 pA
Fit gezeigt, sondern der Fit, der sich ergeben würde, wenn die Abstände 6 pA geblieben
wären. Man sieht jetzt die kleinen Abweichung auf den Flanken.
Fig. 7.17C: Amplitudenhistogramm aus simulierten Daten mit 10 6 Abtastpunkten und einer Abtastrate
von 100 kHz, 4-poliges Besselfilter von 25 kHz. Signal/Rauschverhältnis 4. Die zur Simulation des
SOG-Modells benutzten Ratenkonstanten sind die Mittelwerte T22 aus Fig. 7.12 (N: Häufigkeit).
Fig. 7.18: Die Zeitreihe aus den simulierten Daten von Fig.7.17C.
In Fig. 7.17C ist das C-Zustandsmodell gezeigt. Hier ergab sich aus dem Fit des
Amplitudenhistogramms mit einer Summe von Gaußhügeln ein Einzelkanalstrom von 5.88
pA. Da man diesen Unterschied gegenüber 6.00 pA nicht sehen würde, ist wie in Fig. 7.17B
nicht der 5.88 pA-Fit gezeigt, sondern der Fit, der sich ergeben würde, wenn die Abstände
6.00 pA geblieben wären. Die kleinen Abweichungen auf den Flanken sind etwas größer als in
Fig. 7.17B.
Die Ergebnisse aus Fig. 7.17 sind überraschend. Es ist keine nennenswerte
Verschiebung des Einzelkanalstroms aufgetreten. Fig. 7.18 gibt diesen Befund noch einmal
anschaulich an der Zeitreihe wieder. Die 6.00 pA-Niveaus liegen genau dort, wo man sie in
einer echten Auswertung auch hinlegen würde.
70

Kapitel 7: Meßergebnisse
Obiges Ergebnis ist unerwartet. Auf der Grundlage der vorliegenden Daten ist also
auszuschließen, daß schnelles Schalten den AMFE auf dem Einzelkanal vortäuscht. Die Frage
ist die nach der Zuverlässigkeit.
1. Wenn schnellere unentdeckte Ratenkonstanten vorliegen würden, müßte man einen
Hinweis auf ihre Existenz in den Amplitudenhistogrammen sehen. Aber die
Amplitudenhistogramme der echten Zeitreihen (Fig. 7.3) ließen sich sehr gut durch
Gaußhügel fitten. Es trat keine Schiefe auf, die durch schnelles Schalten erzeugt würde.
Die Gaußverteilungen werden dann zu Beta-Verteilungen (FitzHugh, 1983; Yellen, 1984).
2. Es könnte noch möglich sein, daß die Ratenkonstanten zu niedrig geschätzt wurden, weil
die Dwell-Time-Analyse ohne missed-events-Korrektur durchgeführt wurde. Doch gerade
die K + + Tl + -Daten bei 20°C (Tab. 7.2) weichen im schnellen Bereich kaum von den mit
dem HMM-Fit bestimmten ab, der weniger empfindlich gegenüber missed-events ist. Im
Falle schnellen Schaltens müßten die Amplitudenverteilungen pro Niveau aus einer
Zerlegung von Beta-Verteilungen erhalten werden. Doch da hier keine Beta-Verteilungen
vorliegen, erfüllt die im Programm implementierte Gaußzerlegung diese Aufgabe
zufriedenstellend.
3. Die Ratenkonstanten zeigen, wie schon oben erwähnt, kein inverses Verhalten (Zanello
und Barrantes, 1994) wie es bei Messungen, in denen die Ratenkonstanten zu dicht an der
Auflösungsgrenze liegen, vorkommt (Draber und Schultze, 1994a).
Nachdem die Amplitudenhistogramme in Fig. 7.17 die Hypothese der Reduzierung des
scheinbaren Einzelkanalstroms durch schnelles Schalten widerlegt haben, ist zu fragen, was
die Stromreduzierung in Tab. 7.1 bedeutet: Autoren, die mit langsameren
Aufzeichnungsanlagen arbeiten, würden über die Burstbereiche mitteln und die in Tab. 7.1
berechnete Reduzierung des Einzelkanalstromes zusätzlich zu den hier bei schnellen
Abtastraten gefundenen messen.
7.3.9 Untersuchung der Offenwahrscheinlichkeiten
Durch den Hinkley-Detektor werden nicht nur die Dwell-Time-Histogramme erhalten,
sondern auch die Mehrkanal-Offenwahrscheinlichkeiten. Sie entstehen aus der Summe der
Zeiten, in denen eine feste Anzahl von Kanälen gleichzeitig offen ist, und durch Division
durch die Gesamtzeit der analysierten Aufzeichnung.
Da die Wahrscheinlichkeitsverteilung der Anzahl der offenen Kanäle bei einem
Mehrkanal-Patch über die Binomialverteilung (Glasbey und Martin, 1988)
⎛N
⎞
N−k
k
p(
k)
= ⎜ ⎟(
1−
popen)
popen
(7.12)
⎝k
⎠
mit der Offenwahrscheinlichkeit des Einzelkanals popen zusammenhängt, ergibt sich hier eine
zweite Möglichkeit (neben der kinetischen Analyse), die popen zu berechnen.
Hierbei ist N die Anzahl der Kanäle, k die Anzahl der offenen Kanäle, popen die
Wahrscheinlichkeit, daß ein Kanal offen ist, und p(k) die Wahrscheinlichkeit, daß k-Kanäle
offen sind. Diese Gleichung wird dann mit Hilfe des Simplex-Algorithmus (Nedler und Mead,
1965; Caceci und Cacheris, 1984) nach popen aufgelöst.
71

Kapitel 7: Meßergebnisse
O fenwahrscheinlichkeit
0,5 K+Tl -80 mV
K -80 mV
0,4
0,3
0,2
0,1
0,0
5 10 15 20
72
T / °C
Fig. 7.19: Temperaturabhängigkeit der Offenwahrscheinlichkeit für den blockierten und unblockierten
Kanalzustand bei Vhold =-80 mV berechnet aus dem Hinkley-Detektor.
Die Offenwahrscheinlichkeit bei einer Haltespannung von -80 mV ist bei
Raumtemperatur für den blockierten und unblockierten Kanalzustand gleich. Dies stimmt mit
den Messungen von Draber (1990) überein. Bei Draber (1990) wurde nur mit einer Abtastrate
von 5 kHz und einer Filterfrequenz von 1 kHz gemessen. Trotz der Erhöhung der Abtastrate
hat sich bei Raumtemperatur der Wert für die Offenwahrscheinlichkeit für beide
Kanalzustände nicht geändert.
Bei einer Reduzierung der Temperatur wird die Offenwahrscheinlichkeit für den
blockierten Kanalzustand größer als für den unblockierten.
Die Offenwahrscheinlichkeit in reiner Kaliumlösung bei Raumtemperatur (20 °C) von
popen=0.25 reduziert sich bei einer Temperatur von 7 °C auf popen=0.165. Im Gegensatz dazu
erhöht sich in der gemischten Lösung aus Kalium und Thallium die Offenwahrscheinlichkeit
bei Raumtemperatur von popen=0.25 auf popen=0.3 bei Reduzierung der Temperatur. Die
Zunahme der Offenwahrscheinlichkeit in der gemischten Lösung kann so erklärt werden, daß
die Auflösung im Offenzustand des Kanals bei Raumtemperatur nicht ausreicht. Bei den
langsameren Schaltprozessen bei tieferer Temperatur reicht die Auflösung aus, und die
Offenwahrscheinlichkeit nimmt zu. Es muß erwähnt werden, daß die Streuung ziemlich groß
und deshalb die Aussagekraft der Ergebnisse eingeschränkt ist.
Die Ergebnisse für die reine Kaliumlösung stimmen nicht mit den Meßergebnissen von
Zanello und Barrantes (1994) überein. Bei diesen Untersuchungen nimmt die
Offenwahrscheinlichkeit mit abnehmender Temperatur im Gegensatz zu oberen Messung für
den unblockierten Kanalzustand zu. Deshalb werden die Werte kontrolliert.
Die Offenwahrscheinlichkeiten können auch aus den Besetzungswahrscheinlichkeiten der
Zustände O und S aus dem Zustandsmodell SOGCZ bestimmt werden, indem

Kapitel 7: Meßergebnisse
die Besetzungswahrscheinlichkeiten der beiden Zustände (Fig. 7.20) addiert werden (Fig.
7.21). Die Besetzungswahrscheinlichkeiten, die für die Bestimmung der
Offenwahrscheinlichkeiten verwendet wurden, erhält man aus den Ratenkonstanten der
Übergänge (Gleichung 7.7).
Besetzungswahrscheinlichkeit von S
Besetzungswahrscheinlichkeit von O
0,4
0,3
0,2
0,1
0,0
0,4
0,3
0,2
0,1
0,0
[A]
K+Tl Raum tem peratur
K Raum tem peratur
-80 -40 0 40 80
U / mV
[C]
K+Tl Raum tem peratur
K Raum tem peratur
-80 -40 0 40 80
U / mV
Besetzungswahrscheinlichkeit von S
73
Besetzungswahrscheinlichkeit von O
0,4
0,3
0,2
0,1
[B]
K+Tl tiefe Tem peratur
K tiefe Tem peratur
0,0
-120 -80 -40 0 40 80 120
0,4
0,3
0,2
0,1
U / mV
[D]
K+Tl tiefe Tem peratur
K tiefe Tem peratur
0,0
-120 -80 -40 0 40 80 120
U / mV

Kapitel 7: Meßergebnisse
Besetzungswahrscheinlichkeit von G
0,4
0,3
0,2
0,1
0,0
[E]
K+Tl Raum tem peratur
K Raum tem peratur
-80 -40 0 40 80
U / mV
Besetzungswahrscheinlichkeit von G
74
0,4
0,3
0,2
0,1
0,0
[F]
K+Tl tiefe Tem peratur
K tiefe Tem peratur
-80 -40 0 40 80
U / mV
Fig. 7.20.A-B-C-D-E-F: Betrachtung der Besetzungswahrscheinlichkeit in den Zuständen S , O und G
für den blockierten und unblockierten Kanal bei Raumtemperatur (A, C, E) und 7 °C (B, D, F) aus dem
SOGCZ-Modell.
O fenwahrscheinlichkeit
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0,0
K -80 mV
K+Tl -80 mV
6 8 10 12 14 16 18 20 22
T / °C
Fig. 7.21: Bestimmung der Offenwahrscheinlichkeit mit Hilfe der Werte aus der
Besetzungswahrscheinlichkeit der Zustände O und S.

Kapitel 7: Meßergebnisse
Außer bei dem Wert von Kalium bei Raumtemperatur zeigt Fig. 7.21, daß die
Offenwahrscheinlichkeiten aus den beiden unabhängigen Methoden übereinstimmen. Das
bedeutet, daß die Genauigkeit der bestimmten Ratenkonstanten recht gut ist.
7.3.10 Kontrolle der Ratenkonstanten der Zeitreihe aus dem Target-Fit mit
der Methode des direkten Fits der Zeitreihe mit einem Hidden-Markov-
Modell (HMM-Fit)
Eine weitere Kontrolle für die Ratenkonstanten aus dem Targetfit ist die Analyse der
Zeitreihen mit dem direkten Fit (HMM-Fit) (siehe Abschnitt 7.3.1). Wegen des hohen
Zeitbedarfs dieses Fitverfahrens wurden nur vier Zeitreihen für die Analyse entnommen. Es ist
zu bemerken, daß dies willkürlich herausgegriffene Einzelmessungen sind, die aufgrund der
höhen Streuung nicht mit den Werten in Fig. 7.12 verglichen werden dürfen. Es kommt nur
auf den Vergleich Dwell-Time-Fit und direkten Zeitreihenfit an. Es werden Zeitreihen mit
höchstens zwei Stromniveaus ausgewählt. Bei höherer Anzahl des Stromniveaus dauerte der
Fit einer Zeitreihe mehr als 3 Tage. Die Werte aus dem direkten Fit werden mit den
Ratenkonstanten aus dem Targetfit verglichen (Tabelle 7.2).
K+Tl 20 °C -60mV K+Tl 7 °C -80 mV K 20 °C -80 mV K 7 °C -80 mV
Targetfit HMM-Fit Targetfit HMM-Fit Targetfit HMM-Fit Targetfit HMM-Fit
kSO / Hz 7700 6600 1100 720 9800 6200 4500 4900
kOS / Hz 18500 19000 8000 7200 17500 14000 7500 7700
kOG / Hz 7100 11000 4800 17000 10200 16800 2300 2400
kGO / Hz 11500 15000 5300 7700 14500 24000 4300 4300
kGC / Hz 6200 10500 5500 7000 5200 5600 4200 3000
kCG / Hz 1500 1500 4300 600 7600 1500 3000 1000
kCZ / Hz 10 280 1100 2000 3150 4200 2200 2600
kZC / Hz 10 10 160 10 100 10 250 10
Tabelle 7.2: Vergleich der Ratenkonstanten aus dem Targetfit und dem direkten Fit mit einem Hidden-
Markov-Modell im blockierten und unblockierten Zustand und bei unterschiedlicher Temperatur (20°C oder
7°C).
Die meisten Ratenkonstanten aus dem HMM-Fit liegen in derselben Größenordnung wie
bei dem Targetfit. Besonders für die Ratenkonstanten bei tiefer Temperatur und im
unblockierten Zustand ist die Übereinstimmung erstaunlich hoch. Aber selbst bei
Raumtemperatur im blockierten Zustand liegen die schnellen Ratenkonstanten aus dem
HMM-Fit in derselben Größenordnung wie bei dem Targetfit. Dies zeigt, daß die Annahme,
daß die schnellen Ratenkonstanten aus dem „Schwanz“ der Verteilung bestimmt werden
können, zutreffen kann (siehe Abschnitt 7.3.7). Einer der schnellen Ratenkonstanten, bei der
es eine große Abweichung zwischen den beiden Fitergebnissen gibt, ist kOG in der K + / Tl + -
Mischlösung bei 7 °C. Das Ergebnis aus dem HMM-Fit (kOG = 17000) ist drei- bis viermal so
groß wie das Ergebnis aus dem Targetfit (kOG = 4800). Das zeigt eigentlich, daß selbst bei
tiefer Temperatur schnelle Ratenkonstanten existieren.
Allerdings werden die größten Abweichungen bei den langsamen Ratenkonstanten
beobachtet. Durch missed-events ändern sich die langsamen Ratenkonstanten am deutlichsten
(Blunck et al., 1998). Diese stehen aber nicht im Vordergrund des Interesses dieser Arbeit und
75

Kapitel 7: Meßergebnisse
das vorliegende Detektormaterial reicht auch nicht zur statistischen Sicherheit. Somit wird der
Effekt nicht weiter untersucht.
76

8 Fazit und Ausblick
Dies ist die vierte Arbeit, in der sich die Kieler Arbeitsgruppe mit dem Thema des
anomalen Molfraktionseffekts (aus K + - und Tl + -Mischung) beschäftigt. Das Ziel aller
Arbeiten war es, zu entscheiden, ob dem AMFE ein Permeations- oder Gatingmechanismus
zugrunde liegt (Kapitel 4). Während der Nachweis der entscheidenden Rolle des Gatings beim
Block durch Cs + (Draber und Hansen, 1994a) und Na + (Blunck, 1996) gelang, konnte eine
Entscheidung beim AMFE in den drei Vorgängerarbeiten noch nicht erreicht werden.
Nun ist eine Bilanz zu ziehen, wie der Stand am Ende dieser Arbeit ist. Ein Hinweis, daß
der anomale Molfraktionseffekt durch schnelles Schalten verursacht wird, ergab sich aus den
Strom-Spannungskurven bei tiefer Temperatur. Die Konvergenz der beiden Strom-
Spannungskurven bei 7 °C unterstützt diese Hypothese.
Das Endziel ist jedoch der direkte Nachweis des schnellen Schaltens in kinetischen
Untersuchungen. Im Gegensatz zu den Vorgängerarbeiten stand jetzt das neue Programm von
Blunck (1996) und Kirst (1997) zur Auswertung von Mehrkanal-Dwell-Time-Histogrammen
zur Verfügung.
Die Untersuchungen auf der Grundlage des Markov-Modells SOGCZ
erbrachte dann die Überraschung. Stellt man sich zuerst einmal dumm, indem man vergißt,
daß die Niveaubestimmung von der gleichen zeitlichen Auflösung wie die Bestimmung der
Ratenkonstanten ausgeht, so ergeben die gemessenen Ratenkonstanten bei Raumtemperatur in
Tl + -haltiger Lösung tatsächlich durch Mittelung über die Burstbereiche eine scheinbare
Stromreduzierung. Sie beträgt zwar nur 10% statt der gemessenen 25%, aber in Anbetracht
der Fehler konnte man erst einmal zufrieden sein.
Doch diese Betrachtung hat nur Bedeutung für Wissenschaftler, die mit niedrigeren
Abtastraten arbeiten. Ihnen könnte man aufgrund der Analyse hier sagen: 10% Eurer
gemessenen Stromreduzierung geht auf Kosten der Mittelung über schnelles Schalten.
Für die hier durchgeführte Analyse ist der in Abschnitt 7.3.8 beschrittene Weg der einzig
richtige. Man nimmt die Ratenkonstanten bei Tl + -Anwesenheit bei Raumtemperatur, steckt sie
in das Simulationsprogramm, überlagert die Zeitreihe mit dem angemessenen Rauschen und
filtert sie mit einem 4-poligen Besseltiefpaß wie im Versuch. Da wird untersucht, ob die
Analyse den bei der Simulation benutzten Einzelkanalstrom von 6 pA wiedergibt. Selbst bei
Beschränkung auf das kleine Burstmodell (SOG) verändert das schnelle Schalten den
aus den Amplitudenhistogrammen gefundenen Strom nur auf 5.88 pA. Dieser Effekt von 2%
liegt im Streubereich der Auswertung realer Daten. Er ist zu vernachlässigen gegenüber den
25%, die als Stromreduzierung beim AMFE gemessen werden.
Dieses Ergebnis ist ein Meilenstein in der Geschichte des AMFEs im Kieler Labor. Die
Suche nach schnellem Schalten begann mit der Diplomarbeit von Draber (1990), führte zu
gewaltigen Verbesserungen der Aufzeichnungsanlagen (Albertsen, 1992) und zur
Entwicklung neuer effektiver Auswertealgorithmen (Schultze und Draber, 1993; Draber und
Schultze, 1994a; Albertsen und Hansen, 1994; Blunck, 1996; Kirst, 1997) und nun ist auf
einen Schlag alles vorbei: Kein schnelles Schalten als Ursache.

Kapitel 8: Fazit und Ausblick
Die Frage ist, wie sicher obiges Ergebnis ist. Man könnte natürlich einwenden, es gäbe
noch ein schnelles Schalten, das hier nicht entdeckt worden ist. Die Transferrate des Kanals
bei 6 pA ist 10 8 Ionen/s. Die schnellen Ratenkonstanten liegen bei 15 000 Hz. In diesem
Bereich mit einem Faktor 6000 kann sich noch einiges verbergen. Doch zur Zeit besteht keine
Hoffnung, etwas zu finden. Die Amplitudenverteilung der gemessenen Daten (Fig. 7.3) läßt
sich gut mit Gaußhügeln nähern. Prozesse mit Zeitkonstanten, die um den Faktor 10 höher
liegen, würden bereits sehr deutliche Abweichungen erzeugen und zu Beta-Verteilungen
führen. Also muß ein hypothetisches Schalten schnellere Zeitkonstanten als ca. 5 µs,
wahrscheinlich sogar 1 µs besitzen.
Dieser Bereich ist aber nur durch einen Technologiesprung zu erreichen, der sich im
Moment nicht abzeichnet. Somit wird das Ergebnis dieser Arbeit für die nächste Zeit die letzte
Aussage zum schnellen Schalten beim AMFE sein.
In der Zukunft wird man sich also wieder stärker den Permeationsmodellen zuwenden.
Hierfür ist wichtig, daß die symmetrischen Effekte auf die Strom-Spannungskurven, die von
Draber et al. (1991) und Keunecke (1995) gemessen wurden, hier nicht auftraten. Die
Symmetrie der Wirkung des AMFEs auf die Strom-Spannungskurven im positiven und
negativen Spannungsbereich war das Hauptargument, das Permeationsmodell von Hille-
Schwarz (1978) und Wu (1991,1992) auszuschließen und nach Gating-Modellen zu suchen.
Albertsen (1994) und diese Arbeit fanden nur einen einseitigen Effekt.
Es ist nicht einsichtig, warum es zu diesen unterschiedlichen Ergebnissen kam.
Insbesondere die Messungen von Keunecke (1995) und die Messungen dieser Arbeit fanden
unter fast identischen Bedingungen statt. Die erkennbaren Unterschiede waren wie folgt:
Höhere Osmolarität in den Messungen hier (250 mM KNO3) im Gegensatz zu 150 mM KNO3
bei Keunecke (1995). Doch erste Messungen in dieser Arbeit mit 150 mM zeigten auch
keinen symmetrischen AMFE. Der einzige Unterschied ist, daß Keunecke einen
Lösungsaustausch durchführte und in der Kammer die Lösung wechselte, während hier für
jedes Mischungsverhältnis ein neuer Patch genommen wurde. Doch wie das den Unterschied
erklären sollte, ist unverständlich.
Diese Symmetriefrage hat nicht nur Bedeutung für eine mögliche Erklärung mit den oben
genannten Permeationsmodellen, sondern auch für die Art der Bindungsstelle. Die hier
gefundene Erklärung, daß die symmetrische Wirkung nur auftritt, wenn die Lösungen
symmetrisch sind, paßt gut zur Vorstellung, daß der Strom das Tl + -Ion in den Kanal zieht und
dort die wirksame Bindungsstelle trifft. Außerdem hatte sich bei anderen Ionenblocks (Na +
Blunck, 1996; Cs + , Draber, 1994) gezeigt, daß die Wirkung einseitig war.
Für die symmetrischen Wirkungen nahmen Draber et al. (1991) an, daß die
Bindungsstelle an der Außenmembran sitzt und das einmal gebundene Ion den Fluß in beide
Richtungen beeinflußt. Keunecke (1995) benutzte inside-out-patches und Tl + -Lösung. Dann
hätte die Bindungsstelle auf der cytosolischen Außenseite des Kanals liegen müssen, um den
symmetrischen Effekt zu erklären.
Aufgrund der vorliegenden Ergebnisse fallen Argumente gegen das Modell von Wu
(1991, 1992) und Hille-Schwarz (1978) fort. Die Modelle müßten überarbeitet werden, um
einige kleinere Widersprüche aufzulösen. Ein neuer Ansatz ist das Modell von Möller (1998),
der in seiner Diplomarbeit eine Kombination aus Hille-Schwarz und dem enzymkinetischem
Modell (Hansen et al., 1981) vorgeschlagen hat. Es ist aber noch nicht auf den AMFE
angewandt worden.
Es zeichnet sich also ab, daß die Reihe von AMFE-Arbeiten so bald nicht zu Ende ist.
Hierbei ist auch zu klären, warum die Strom-Spannungskurven mit und ohne Tl + bei 7°C
konvergieren. Dies könnte auch den entsprechenden Befund von Blunck (1996) beim Na + -
Block in anderem Licht erscheinen lassen.
78

9 Zusammenfassung
In dieser Arbeit wurde der anomale Molfraktionseffekt (AMFE) beim Kaliumkanal von
Tonoplasten der Grünalge Chara corallina mit Hilfe der Patch-Clamp-Technik untersucht.
Unter dem AMFE versteht man, daß bei einer konstanten Gesamtkonzentration die
Leitfähigkeit der Mischlösung (K + - und Tl + -Ionen) kleiner ist als die der reinen Lösung. Die
Aufgabe bestand darin, zu untersuchen, ob der anomale Molfraktionseffekt durch die nicht
ausreichende Auflösung des Meßsystems entsteht, d.h., ob das schnelle Schalten im Anti-
Aliasingfilter summiert wird und für die scheinbare Reduktion des Stromes verantwortlich ist.
Deshalb wird mit Abtastraten von 100 kHz und mit einem Anti-Aliasingfilter von 25 kHz
gearbeitet. Dazu wurden Strom-Spannungskurven in Abwesenheit und Gegenwart von 20 mM
TlNO3 (bei 250 bzw. 230 mM KNO3) gemessen. Es wird bei dem blockierten Zustand trotz
der hohen Abtastraten eine Reduktion der Leitfähigkeit um 25 % beobachtet.
Es wurden Messungen bei niedriger Temperatur (7°C) durchgeführt, um die
Reaktionsgeschwindigkeit der Schaltvorgänge zu reduzieren. Die Abkühlung erfolgte durch
die direkte Kühlung des Objekttisches. Bei tiefer Temperatur (7 °C) konvergieren die beiden
Ströme des blockierten und unblockierten Zustands. Dieser Effekt wurde bei Untersuchungen
des Na + -Blockes als ein wichtiger Hinweis auf die Beteiligung schnellen Schaltens an der
Einzelkanalstromreduzierung gewertet.
Um dies zu überprüfen, wurden die Daten mit einem Hinkley-Detektor höherer Ordnung
analysiert, um mit Hilfe von Dwell-Time-Histogrammen das kinetische Verhalten des Kanals
zu studieren. Der Detektor ist in der Lage, eine zeitliche Auflösung bis zu 40 µs für eine
Sprungdetektion zu erreichen.
Für eine stochastische Betrachtung der Schaltvorgänge der Kanäle wird ein Markov-
Modell benutzt. Die Wahrscheinlichkeitsverteilung für die Verweildauern auf einem Niveau
wird durch ein System von linearen Differentialgleichungen erster Ordnung beschrieben. Die
Gleichung läßt sich durch eine Summe von Exponentialfunktionen lösen.
Der neue Target-Fit aus Vorgängerarbeiten von Blunck (1996) und Kirst (1997)
ermöglicht, durch Fitten der Dwell-Time-Histogramme die Ratenkonstanten des
zugrundeliegenden Markov-Modells des Kanals zu ermitteln.
Die Wahl des geeigneten Markov-Modells ist der erste Schritt der Analyse. Die Analyse
der Dwell-Time-Histogramme ergab, daß zwei Offenzustände und drei Geschlossenzustände
für den Target-Fit benötigt werden. Durch den Vergleich unterschiedlicher 5-Zustandsmodelle
wurde das beste Fitergebnis durch das SOGCZ-Modell (C, G und Z
geschlossen, O und S offen) erreicht. Die Pascal-bedingte Beschränkung des Adreßraumes
ließ den Fit mit dem vorliegenden Programm von Aufzeichnungen bis zu drei Kanälen zu.
Als nächstes wurden die Übergangsratenkonstanten kij in diesem Modell bei
unterschiedlichen Temperaturen miteinander verglichen. Bei den Ratenkonstanten wurde kein
inverses Verhalten beobachtet. Inverses Verhalten bedeutet, daß keine der Ratenkonstanten
sich mit sinkender Temperatur steigert, was ein Hinweis auf ein falsches Modell oder eine
nicht ausreichende Zeitauflösung wäre. Bei einem inversen Verhalten wäre es notwendig

Kapitel 9: Zusammenfassung
gewesen, das gewählte Modell in Frage zu stellen oder eine missed-events-Korrektur
einzuführen, da die Auflösung wahrscheinlich nicht ausreicht. Der größte Unterschied bei
Aufzeichnungen mit und ohne Thallium zeigte sich im Übergang OG und bestan darin,
daß der G-Zustand bei Anwesenheit von Tl + länger wurde.
Die so ermittelten Ratenkonstanten wurden benutzt, um Zeitreihen zu simulieren. Zu den
mit dem SOGCZ-Modell simulierten Zeitreihen wurde Rauschen mit SNR =
4 addiert. Die Gewichtung mit einem 4-poligen Besselfilter (25 kHz) und die Abtastung mit
100 kHz vervollkommnete die Korrespondenz zu den echten Zeitreihen. Der
Einzelkanalstrom wurde bei der Simulation entsprechend den Messungen an Chara mit 6 pA
festgesetzt.
Amplitudenhistogramme der simulierten Zeitreihen dienten dem Studium der Wirkung
des Schaltens auf den gemessenen Einzelkanalstrom. Es ergab sich kein sichtbarer Effekt bei
der Simulation des vollständigen Modells. Die Beschränkung auf den Burstbereich durch
Selektion des Teilmodells SOG mit den Ratenkonstanten der Tl + -Messungen bei
Raumtemperatur erbrachte eine Reduzierung des gemessenen Einzelkanalstroms auf 5.88 pA.
Dieser Effekt von 2% wäre in der Analyse realer Daten nicht detektierbar.
Das Ergebnis der Analyse ist damit eindeutig: Die Reduktion des Einzelkanalstromes im
Bereich des AMFE ist nicht auf schnelles Schalten zurückzuführen. Es wird diskutiert, ob es
noch unentdecktes schnelles Schalten geben könnte. Da die Amplitudenverteilungen der
echten Daten keine signifikanten Abweichungen von Gaußverteilungen zeigen, ist zu
schließen, daß solch ein hypothetisches schnelles Schalten weit über 200 kHz liegen müßte
und mit der heutigen Technologie nicht zu verwirklichen ist.
Bevor dieser endgültige Schluß dargestellt wird, beschäftigte sich die Arbeit mit der
Frage, ob bei Untersuchungen mit geringerer Zeitauflösung als der hier benutzten eine
Stromreduzierung durch schnelles Schalten auftreten könnte. Dazu wird wieder das für Bursts
verantwortliche SOG Teilmodell betrachtet. Die Mittelung über die Offen- und
Geschlossenzeiten in einem solchen Burst ergibt tatsächlich eine 10-prozentige
Stromreduzierung bei Anwesenheit von Tl + bei Raumtemperatur. Das bedeutet, daß
Messungen mit langsameren Aufzeichnungsanlagen einen scheinbaren AMFE messen
würden, der um 10% höher liegt als der in diesen Messungen auftretende.
Als Kontrolle für die Dwell-Time-Analyse wurde mit Hilfe der Mehrkanal-
Offenwahrscheinlichkeit des Hinkley-Detektors die Offenwahrscheinlichkeit eines Kanals
über eine Binomialverteilung berechnet. Die Ergebnisse bei Raumtemperatur stimmen mit den
Ergebnissen von Draber et al. (1991) trotz der großen Streuung überein. Trotz der besseren
Auflösung verglichen mit der von Draber et al. (1991) tritt keine Veränderung der
Offenwahrscheinlichkeit bei Raumtemperatur für den blockierten und unblockierten Zustand
auf. Die Offenwahrscheinlichkeit steigt mit Abnahme der Temperatur.
Die Offenwahrscheinlichkeit eines Kanals kann auch durch die Addition der
Besetzungswahrscheinlichkeiten von Zustand S und O bestimmt werden, die sich aus der
kinetischen Analyse (Dwell-Time-Fit) ergeben. Da die Besetzungswahrscheinlichkeiten aus
den Ratenkonstanten bestimmt werden, wird sie auch als Kontrolle für die Ratenkonstanten
verwendet. Weil die Werte aus den beiden unabhängigen Methoden größenordnungsmäßig
übereinstimmen, ist dies ein Hinweis für die recht gute Bestimmung der Ratenkonstanten.
Außerdem wurde bei einigen Messungen ein direkter Zeitreihenfit mit dem Hidden-
Markov-Modell (SOGCZ) durchgeführt. Die Ergebnisse der schnellen
Ratenkonstanten stimmen hier erstaunlich gut mit dem Target-Fit überein.
80

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85

Danksagung
Herrn Prof. Dr. Ulf-Peter Hansen danke ich für das interessante Thema und die unermüdliche
und geduldige Betreuung. Ihm bin ich für den freundschaftlichen Umgang und die kritischen
Ratschlägen zum Dank verpflichtet.
Maike Keuneke danke ich für die Einführung in die Patch-Clamp-Technik, für viele klärende
Gespräche, erfrischende Hinweise, ihre Unterstützung und Hilfestellung.
Thilo Rießner danke ich für die Lösungen aus den vielen Computerproblemen und die
kompetente Diskussionsbereitschaft bei den vielen theoretischen Problemen. Er hat mir
außerdem einige seiner Programme zur Verfügung gestellt.
Mein Dank gilt auch den Mitgliedern der Arbeitsgruppe für Biophysik, die durch kritische
Diskussionen wesentlich zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen haben.
Einen ganz herzlichen Dank an alle, die bei der Korrektur der Arbeit mitgewirkt haben.
Ganz besonders bedanke ich mich bei meinen Eltern, die mir das Studium ermöglichten und
mich jederzeit tatkräftig unterstützten.
86

Erklärung
Hiermit versichere ich an Eides statt, daß ich die vorliegende Diplomarbeit selbständig und
nur mit Hilfe meiner akademischen Lehrer sowie der angegebenen Literatur angefertigt habe.
87
Kiel, den ..........................
Afshin Farokhi