Auflösung des schnellen Schaltens bei Patch-Clamp Untersuchungen

Kapitel 6: Experimenteller Aufbau und Methoden
Ausgangssignal des Besselfilters wird dann an einen digitalen Signal-Prozessor weitergeleitet
(Dalanco Spry). Dieses Board kann das Signal bis zu 200 kHz abtasten. Es war bei den in
dieser Arbeit durchgeführten Messungen auf 100 kHz eingestellt. Durch das 25-kHz Filter
kam es nicht zu einem Verstoß gegen das Abtasttheorem.
Die Daten werden per Knopfdruck durch das Aufnahmeprogramm „Sample“ auf die
Festplatte eines PC’s (486DX66) gespeichert. Es werden bei verschiedenen Spannungen
Aufnahmen gemacht. Die Dauer jeder Aufnahme betrug 20 Sekunden. Je länger die Meßzeit
ist, desto kleiner ist die Streuung der Dwell-Time Histogramme, aber desto kleiner wird die
Wahrscheinlichkeit, daß das Gigaseal überlebt, besonders bei hoher Haltespannung. In dem
Aufnahmeprogramm werden die Samplefrequenz, der Dateiname und die Länge des Meßfiles
dokumentiert. Nach der Auswertung werden die Files auf eine CD gebrannt.
6.6 Das Patchen
Aus einem Anzuchtbecken werden die Algen Chara corallina entnommen, und die
Radialzellen werden von den Internodialzellen entfernt. Die Internodialzellen der Alge werden
dann für die Vorbereitung des Versuchs, nachdem sie 10 Minuten getrocknet worden sind,
aufgeschnitten, und der Zellinhalt wird vorsichtig mit zwei Fingern in der Lösung der
Meßkammer ausgedrückt. Es bilden sich Vesikel (Tröpfchen), die am Boden der Rinne der
Meßkammer haften. Je kleiner die Krümmung der Vesikeloberfläche, desto größer ist die
Wahrscheinlichkeit einer Bildung des Gigaseals. Da die Vesikel einen Durchmesser um die 50
µm haben, wird ein invertierendes Mikroskop (Zeiss ID02) mit einem Objektiv von 5×, 10×
und 20× benutzt.
Danach wird die Pipette auf den Halter gesteckt und in die Lösung getaucht. Mit dem
Mund wird über einen seitlich angebrachten Schlauch ein Überdruck erzeugt. Durch diesen
Überdruck wird der Schmutz an der Oberfläche weggeblasen, so daß die Pipettenspitze beim
Durchfahren der Lösung nicht durch herumschwimmende Tropfentrümmer verunreinigt wird.
Bei eingetauchter Pipette wird der Offsetstrom im EPC7-Verstärker (Abschnitt 6.5) auf Null
kompensiert. Dann folgt das Anlegen einer Rechteckspannung für die Kontrolle des
Sealvorganges. Der von ihr erzeugte Strom wird kleiner, wenn das Seal die Pipette
verschließt. Die Pipette wird mit Hilfe des Mikromanipulators in die Nähe des Vesikels
gebracht. Die Pipette wird schräg bis senkrecht von oben auf das Vesikel zu bewegt. Es wird
kurz vor Berührung der Membran ein leichter Unterdruck erzeugt, so daß das Vesikel an die
Pipette herangezogen wird. Am Oszillographen wird beobachtet, daß bei Sealbildung der
rechteckige Pipettenstrom zusammenschrumpft. Bei einem hieraus ermittelten Widerstand im
Giga-Ohm-Bereich ist die Verbindung zwischen dem Glasrand der Pipettenöffnung und der
Membran fest. Man spricht von einem Gigaseal. Die Pipette wird dann ruckartig
zurückbewegt und es bildet sich ein „excised Patch“. Das am Pipettenmund klebende
Membranstück (Patch) wird aus der Zelle herausgerissen (Abschnitt 2.2.1). Danach wird der
Patch dicht unter die Oberfläche gebracht und somit das Rauschen reduziert (Keunecke,
1995). Der kapazitive Rauschstrom fließt hauptsächlich durch die Kapazität der benutzten
Pipettenwand. Somit ist das Rauschen sehr stark von der Eintauchtiefe des Patches abhängig.
Das Rauschen nimmt bei einer Eintauchtiefe von 20 µm um den Faktor 2.2 ± 0.5 ab
(Keunecke, 1995). Dann wird die Aufnahme durch den Rechner außerhalb des Faraday-Käfigs
über eine Fernbedienung von innen gestartet. Vorher wird noch die Empfindlichkeit des
Verstärkers auf 100 mV/pA erhöht.
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