Candida albicans-induzierte Genexpression in primären ... - OPUS

Candida albicans-induzierte
Genexpression in primären humanen
Endothelzellen
Mechanismen der Signaltransduktion
und Möglichkeiten der Intervention
Dissertation
zur Erlangung des naturwissenschaftlichen Doktorgrades
der Julius-Maximilians-Universität Würzburg
vorgelegt von
Verena Müller
aus Mannheim
Würzburg 2007

Eingereicht am: ………………………………
bei der Fakultät für Chemie und Pharmazie
1. Gutachter: …………………………………..
2. Gutachter: …………………………………..
der Dissertation
1. Prüfer: ……………………………………….
2. Prüfer: ……………………………………….
3. Prüfer: ……………………………………….
des Öffentlichen Promotionskolloquiums
Tag des Öffentlichen Promotionskolloquiums: ……………...
Doktorurkunde ausgehändigt am: …………………………….

Alles Wissen und alles Vermehren unseres Wissens endet nicht mit
einem Schlusspunkt, sondern mit einem Fragezeichen.
Hermann Hesse

Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung............................................................................................................1
1.1 Der Hefepilz Candida albicans......................................................................1
1.1.1 Vorkommen, Taxonomie und Morphologie ............................................1
1.1.2 Pathogenese und Virulenzfaktoren ........................................................3
1.1.3 Die klinische Bedeutung von Candida albicans......................................4
1.2 Das Endothel und seine Rolle bei Entzündungsprozessen...........................6
1.3 Der NF-κB-Signalweg...................................................................................6
1.4 Der p38 MAP Kinase-Signalweg...................................................................9
1.5 Die angeborene Immunität..........................................................................10
1.6 Toll-like Rezeptoren (TLRs) ........................................................................11
1.7 Ziel der Arbeit..............................................................................................14
2 Material .............................................................................................................17
2.1 Chemikalien ................................................................................................17
2.2 Lösungen und Puffer...................................................................................17
2.2.1 Puffer für Western Blots und Gelelektrophoresen................................17
2.2.2 Puffer für Proteinbestimmungen und Protein-Aktivierungsassays........18
2.2.3 Puffer und Lösungen für Transfektionen..............................................18
2.3 Enzyme und zugehörige Puffer...................................................................19
2.4 Stimulantien und Inhibitoren .......................................................................19
2.5 Antikörper ...................................................................................................20
2.5.1 Antikörper für Western Blots ................................................................20
2.5.2 Antikörper für Durchflußzytometrie.......................................................20
2.6 Reagenziensätze (Kits)...............................................................................21
2.7 Transfektionsreagenzien.............................................................................21
2.8 Zellkulturmaterial.........................................................................................21
2.8.1 Medien und Medienzusätze .................................................................21
2.8.2 Sonstiger Zellkulturbedarf ....................................................................22
2.9 Plasmide .....................................................................................................23
I

2.10 siRNAs (Doppelstrang-Oligonukleotide) .....................................................23
2.11 Zellen, Pilze und Bakterien .........................................................................24
2.12 Geräte.........................................................................................................25
3 Methoden ..........................................................................................................27
3.1 Zellkultur .....................................................................................................27
3.1.1 Lagerung, Einfrieren und Rekultivierung von Zellen.............................27
3.1.2 Zellkultur ..............................................................................................27
3.1.3 Herstellung verschiedener Präparationen von Candida albicans.........29
3.1.4 Stimulation und Inhibitorinkubation ......................................................29
3.2 Gentransfer in eukaryotische Zellen ...........................................................30
3.2.1 Retrovirale Infektion von HUVEC.........................................................31
3.2.2 DEAE-Dextran-Transfektion.................................................................31
3.2.3 Kalziumphosphat-Transfektion.............................................................32
3.2.4 Oligofectamine-Transfektion ................................................................32
3.2.5 Weitere Transfektionsmethoden ..........................................................33
3.3 Oligonukleotid-Mikroarray-Analyse .............................................................33
3.4 Quantitative real time RT-PCR....................................................................36
3.5 Lyse von Zellen zur Proteinanalyse ............................................................37
3.6 Western Blot ...............................................................................................38
3.6.1 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) ............................38
3.6.2 Proteintransfer......................................................................................39
3.6.3 Immundetektion....................................................................................39
3.6.4 Stripping...............................................................................................39
3.7 Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) ..........................................40
3.8 Protein-Aktivierungsassay (Immunkomplex-Kinaseassay) .........................40
3.9 Promoter-Reporter-Assay (Luciferase-Assay) ............................................41
3.10 Durchflußzytometrie....................................................................................42
3.11 Molekularbiologische Methoden..................................................................43
3.11.1 Transformation von Plasmid-DNA in Bakterien....................................43
3.11.2 Mini-, Midi- und Maxipräparation von Plasmid-DNA.............................43
3.11.3 Sequenzierung von DNA......................................................................43
II

3.11.4 Restriktionsverdau von Plasmid-DNA und Auftrennung von DNA-
Fragmenten durch horizontale Agarose-Gelelektrophorese.................44
3.11.5 DNA-Elution aus Agarosegelen............................................................44
3.11.6 Konzentrationsbestimmung von DNA-Lösungen..................................45
3.11.7 Klonierung von Doppelstrang-DNA-Oligos in pRetroSuper..................45
4 Ergebnisse........................................................................................................49
4.1 Etablierung eines in vitro-Modellsystems für Stimulationsstudien...............49
4.1.1 Co-Kultur von HUVEC und C. albicans................................................50
4.1.2 Die C. albicans-induzierte Expression von CXCL8 und CCL20 ist
dosisabhängig......................................................................................50
4.1.3 Einfluß des Serumgehalts auf die Stimulierbarkeit von HUVEC durch C.
albicans................................................................................................51
4.1.4 C. albicans induziert eine verzögerte Chemokinexpression in HUVEC52
4.1.5 Hitze-inaktivierte C. albicans induzieren keine CXCL8-Expression in
HUVEC ................................................................................................54
4.1.6 Die Aktivierung von HUVEC durch C. albicans ist nicht durch eine LPS-
Verunreinigung bedingt........................................................................55
4.2 Untersuchung des C. albicans-induzierten Transkriptoms von HUVEC......57
4.2.1 Das endotheliale Genexpressionsprofil nach Candida-Exposition .......57
4.2.2 Verifizierung der Mikroarray-Daten mittels quantitativer real time RT-
PCR .....................................................................................................59
4.3 Die Aktivierung der IKK/NF-κB Signalkaskade durch C. albicans...............60
4.3.1 C. albicans aktiviert IKK2 und führt zu Degradation von IκBα..............60
4.3.2 Stimulation mit C. albicans führt zu NF-κB-abhängiger Genexpression...
.............................................................................................................61
4.3.3 Die C. albicans-vermittelte Genexpression hängt von der Aktivierung
des NF-κB-Signalweges ab..................................................................62
4.3.4 Die C. albicans-induzierte Expression von CXCL8 und CCL20 ist von
der Aktivierung des IKK-Komplexes abhängig .....................................65
4.3.5 Die C. albicans-induzierte Expression von ICAM-1 ist IKK2-abhängig.67
III

4.3.6 Der C. albicans-induzierten CXCL8-Expression liegt kein autokriner
oder parakriner Mechanismus zugrunde..............................................68
4.4 C. albicans aktiviert die p38 MAP Kinase ...................................................71
4.4.1 Stimulation mit C. albicans führt zur Aktivierung von p38 ....................71
4.4.2 Die Candida-induzierte Expression ausgewählter Gene unterliegt der
Co-Regulation durch p38 .....................................................................71
4.4.3 Der p38-Inhibitor hat keinen direkten Einfluss auf C. albicans.............73
4.5 Die Candida-induzierte Genexpression in Endothelzellen erfordert MyD88
und IRAK1, verläuft aber unabhängig von TLR2 und TLR4........................74
4.5.1 TLR 2 und TLR 4 dienen nicht als Rezeptoren bei der Vermittlung des
Candida-induzierten Signals in HUVEC ...............................................74
4.5.2 MyD88 und IRAK1 sind entscheidend an der Weiterleitung des
Candida-induzierten Signals in HUVEC beteiligt..................................79
4.6 TLR3 ist an der C. albicans-induzierten CXCL8-Expression in HUVEC
beteiligt .......................................................................................................85
5 Diskussion........................................................................................................89
5.1 Das durch C. albicans induzierte Transkriptom primärer humaner
Endothelzellen ............................................................................................89
5.2 C. albicans aktiviert den NF-κB-Signaltransduktionsweg in Endothelzellen94
5.3 Eine Subgruppe C. albicans-induzierter Gene wird durch den p38 MAP
Kinase-Signalweg co-reguliert ....................................................................95
5.4 Die Bedeutung von TLR2 und TLR4 bei der Vermittlung der Candidainduzierten
Genexpression in HUVEC ........................................................98
5.5 MyD88 und IRAK1 sind entscheidend an der C. albicans-induzierten
Signaltransduktion beteiligt, die zur Expression von CXCL8 und CCL20 führt
..................................................................................................................100
5.6 Das C. albicans-induzierte Signal wird zumindest teilweise über TLR3
vermittelt ...................................................................................................101
5.7 Ausblick ....................................................................................................103
IV

6 Anhang............................................................................................................105
6.1 Endotheliale Gene, die durch C. albicans hochreguliert wurden...............105
6.2 Endotheliale Gene, die durch C. albicans herunterreguliert wurden .........108
7 Zusammenfassung ........................................................................................113
8 Summary.........................................................................................................115
9 Literatur ..........................................................................................................117
10 Abkürzungen ..................................................................................................137
11 Danksagung ...................................................................................................139
12 Lebenslauf ......................................................................................................141
13 Publikationsliste.............................................................................................143
13.1 Publikationen ............................................................................................143
13.2 Publizierte Abstracts .................................................................................144
14 Erklärung ........................................................................................................145
V

1 Einleitung
1.1 Der Hefepilz Candida albicans
1.1.1 Vorkommen, Taxonomie und Morphologie
Candida albicans ist ein wichtiger Vertreter der humanpathogenen Hefepilze aus der
Familie der Saccharomycetaceae. Er gehört als opportunistischer Keim zur
kommensalen Mikroflora der menschlichen Schleimhäute (Odds, 1988). In einem
gesunden Wirtsorganismus wird eine übermäßige Vermehrung des Pilzes durch
konkurrierende Mikroorganismen und durch die Immunabwehr des Wirtes verhindert.
Unter bestimmten Umständen, z. B. bei Immunsuppression, kann sich das
Gleichgewicht zugunsten von Candida verschieben und zur Etablierung einer lokalen
mukokutanen Candida-Infektion, einer sogenannten Candidose, führen (Steinmetz,
1999). Es kann sich auch eine systemische Mykose entwickeln, wenn Candida in die
Blutbahn gelangt und sich mit dem Blutstrom verteilt (Hawser and Douglas, 1994)
(Cole et al., 1996).
C. albicans besitzt eine mehrschichtige Zellwand, die zum größten Teil aus
Kohlenhydraten (β-Glukan, Mannan, Chitin), zum anderen aus Proteinen
(Mannoproteinen) und Fetten (Glykolipiden) besteht (Chaffin et al., 1998). Die
relative Verteilung der Komponenten variiert stark zwischen den einzelnen
Zellwandschichten. Die Zellwand ist unter anderem für die Adhäsionseigenschaften
und für die Immunogenität des Pilzes verantwortlich. Pilzspezifische Komponenten
der Zellwand wie z. B. das Ergosterol oder das β-(1,3)-D-Glukan, bieten als
Drug-Targets gute Angriffsmöglichkeiten für selektive Antimykotika. So kann
beispielsweise die Funktion des Ergosterols durch Azol-Antimykotika, Allylamine
oder Morpholine gestört werden, indem verschiedene an der Synthese beteiligte
Enzyme gehemmt werden.
Morphologisch können bei C. albicans verschiedene Wachstumsformen
unterschieden werden. Bei den Hefezellen (Blastosporen) handelt es sich um ovale
bis runde Einzelzellen mit einem Durchmesser von 4 bis 10 µm, die sich durch
Sprossung und anschließende Trennung von Mutter- und Tochterzelle vermehren.
Aus Blastosporen können sich auch Keimschläuche und anschließend filamentöse
1

Wachstumsformen (Myzel) ausbilden, wobei zwischen Pseudohyphen und echten
Hyphen unterschieden wird. Pseudohyphen sind hintereinander gelagerte elongierte
Hefezellen, die aneinander gereiht bleiben und damit echten Hyphen ähneln. Echte
Hyphen bestehen aus fadenförmigen Einzelzellen, die durch Septen zwischen den
einzelnen Abschnitten charakterisiert sind. Die Eigenschaft der Hefe-Myzel-
Transition nennt man Dimorphismus. Als wichtiges diagnostisches Kriterium
gegenüber anderen Hefen ist C. albicans in der Lage, auf nährstoffarmen Nährböden
sogenannte Chlamydosporen auszubilden. Diese Strukturen fungieren als
Dauersporen und entstehen durch Zellwandverdickung endständig an
Pseudohyphen (Odds, 1988).
Abbildung 1.1 Unterschiedliche Wachstumsformen von C. albicans. Aus Hefezellen können sich
sowohl Pseudohyphen als auch echte Hyphen entwickeln, auch der umgekehrte Wechsel ist möglich.
Ein Wechsel zwischen den beiden filamentösen Formen ist selten.
Die jeweils vorrangige Wachstumsform ist maßgeblich von Temperatur, pH-Wert,
Nährstoffangebot, CO 2 -Gehalt, Sauerstoffangebot und Oberflächenkontakt abhängig.
Es wird angenommen, dass die Anwesenheit von fadenförmigen Strukturen für eine
invasive Besiedlungsform des Pilzes spricht, wohingegen Blastosporen generell als
kommensale Kolonisationsform gelten.
2

1.1.2 Pathogenese und Virulenzfaktoren
Für Infektionen mit Pilzen wurden die verschiedensten Infektionswege beschrieben
(Höffken, 1989). Infektionen mit C. albicans entstehen meist endogen, d. h. beim
Versagen lokaler Abwehrmechanismen kommt es ausgehend vom Hauptreservoir für
Candida-Spezies, dem Gastrointestinaltrakt und dem Oropharynx, zu einer
Kolonisation, bei der Candida an die mukokutane Oberfläche adhäriert.
Anschließend kann der Erreger durch Penetration oder Persorption durch das Epithel
Anschluss an das Gefäßsystem erlangen. Bei der Dissemination verteilt sich
Candida im Blut. Der Austritt aus der Blutbahn erfolgt über die Adhäsion an
Endothelzellen und die Invasion in die umliegenden Gewebe (Odds, 1994). Neben
dem endogenen Infektionsmodus ist aber auch eine Infektion des Wirtsorganismus
auf dem exogenen Weg möglich. Die Erregerinvasion kann beispielsweise über
Venenkatheter bzw. perkutan bei Verbrennungen oder Verletzungen erfolgen.
Verschiedene Eigenschaften des Erregers, sogenannte Virulenzfaktoren, sind für die
Etablierung des Pilzes auf bzw. im Wirtsorganismus und damit für das Auftreten
einer Infektion maßgeblich verantwortlich. Im Gegensatz zu einigen obligat
pathogenen Bakterien, deren Virulenz meist nur auf einer oder sehr wenigen
Eigenschaften basiert, scheint die Pathogenität von C. albicans durch eine Vielzahl
von Mechanismen reguliert zu werden (Navarro-Garcia et al., 2001). Vermutlich
verleiht das koordinierte Zusammenspiel potentieller Virulenzgene während der
unterschiedlichen Stadien des Infektionsgeschehens dem Opportunisten eine
besondere Flexibilität und die Fähigkeit, sich stadienspezifisch an die verschiedenen
Wirtsnischen anzupassen (Calderone and Fonzi, 2001).
Zu den bekannten Virulenzfaktoren von C. albicans zählt neben dem Dimorphismus
auch der phänotypische Wechsel (phenotypic switching) zwischen verschiedenen
Phänotypen, die neben morphologischen auch physiologische Unterschiede
aufweisen: in den Antigeneigenschaften (Anderson, 1989), in der Polypeptidsynthese
(Soll, 1991), im Gehalt an Lipiden und Sterolen (Ghannoum et al., 1990), im
Adhäsions- und Biofilmbildungsvermögen (Calderone et al., 2000) und in der
Sensibilität gegenüber Neutrophilen und deren oxidativen Agenzien (Kolotila and
Diamond, 1990). Das bekannteste Beispiel für phänotypischen Wechsel ist das
„white-opaque switching“ von C. albicans-Kolonien auf Nähragar (Slutsky et al.,
1987). Außerdem bestimmen die Sekretion hydrolytischer Enzyme, die Fähigkeit zur
3

Adhäsion an Wirtszellen, die Oberflächenhydrophobizität, der Thigmotropismus
(Reaktion auf einen Berührungsreiz, „contact sensing“) und das molekulare Mimikry
die Pathogenität von C. albicans (Calderone and Fonzi, 2001; Schaller et al., 2005);
(Glee et al., 1995; Mayer et al., 1990; Nikawa et al., 1997; Rostand and Esko, 1997).
Neben dem phänotypischen Wechsel und dem Dimorphismus stellen die
verschiedenen hydrolytischen Enzyme von C. albicans das am meisten beforschte
Feld innerhalb der Virulenzfaktoren dar. Beispielsweise spielen die sekretorischen
Aspartatproteasen (Saps) eine wichtige Rolle sowohl bei der Invasion durch
Zerstörung von Wirtszellbarrieren (Morschhäuser et al., 1997), als auch bei der
Nährstoffbereitstellung durch Degradation von Wirtsproteinen (Schaller et al., 2005)
und bei der Eliminierung von Immunglobulinen und Komplementmolekülen des
menschlichen Abwehrmechanismus (Kaminishi et al., 1995).
1.1.3 Die klinische Bedeutung von Candida albicans
Als kommensale Keime kommen Candida Spezies bei über 50 % der gesunden
Bevölkerung mit oftmals multilokaler Verbreitung vor. Sie sind Bestandteil der
normalen mikrobiellen Flora der Haut, der Schleimhäute des Mund-, Rachen- und
Genitalbereichs und des Darms (Soll, 2002). Das Immunsystem des Wirtes und die
Konkurrenz um das Nahrungsangebot mit anderen Mikroorganismen der normalen
Flora verhindern bei gesunden Trägern eine übermäßige Vermehrung der Candida-
Spezies. Ist jedoch die Mikroflora geschädigt oder das Immunsystem geschwächt,
erhält Candida einen Wachstumsvorteil und es kann zu oberflächlichen oder in
schweren Fällen auch zu systemischen Candida-Infektionen kommen (Steinmetz,
1999). Zu den prädisponierenden Wirtsfaktoren, die eine Candida-Erkrankung
begünstigen, zählen physiologische (hohes oder sehr geringes Alter,
Schwangerschaft), hämatologische (HIV-Infektion, Leukämie), endokrinologische
(Diabetes mellitus, Adipositas), traumatische (starke Verbrennungen, Verletzungen,
Hämostase) und iatrogene Faktoren (Antibiotika, Chemotherapeutika, orale
Kontrazeptiva, Dauerkatheter).
Die bei Menschen am häufigsten auftretende klinisch relevante Candida-Spezies ist
Candida albicans. Dieser opportunistische Krankheitserreger ist für ein breites
Spektrum lokaler Mykosen verantwortlich. Hierzu zählen z. B. Infektionen der Haut
(insbesondere von feuchten Hautfalten), Soor (ein durch weiße Beläge
4

gekennzeichneter Befall der Zunge, des Gaumens oder der Speiseröhre) und die
häufig chronisch verlaufende oder rezidivierende vulvovaginale Candidose. C.
albicans kann aber auch systemische Candidosen verursachen wie Candidämien
(Verbreitung und Wachstum des Erregers im Blut), lebensgefährliche Organmykosen
(betroffen sind vor allem Lunge, Milz, Nieren, Leber, Herz und Gehirn (Hughes,
1982)) und Candida-Sepsis.
Candida-Spezies sind nach breit angelegten Untersuchungen die vierthäufigsten
Erreger nosokomialer Infektionen der Blutbahn (bloodstream infections, BSIs)
(Edmond et al., 1999; Wisplinghoff et al., 2004). Die Mortalitätsrate bei systemischen
Candida-Infektionen liegt je nach Studie zwischen 25 % und 38 % (Kibbler et al.,
2003; Wenzel and Edmond, 2001; Wey et al., 1988). Erklären lässt sich diese hohe
Sterblichkeitsrate u. a. mit einer häufig verspäteten oder ausbleibenden
antimykotischen Pharmakotherapie (Denning, 2003). Fieber ist häufig das erste und
meist einzige uncharakteristische Symptom, das auf eine Infektion schließen lässt
(Villalba et al., 1993). Der Nachweis des Erregers in Blutkulturen gelingt oft erst im
späteren Verlauf der Infektion und bleibt auch dann technisch relativ schwierig.
Für die Pharmakotherapie von Candidosen steht zwar eine Vielzahl von Pharmaka
mit hoher Effizienz aus verschiedenen Wirkstoffklassen zur Verfügung (Bastert et al.,
2001), jedoch stellt das gehäufte Auftreten klinisch relevanter Resistenzen von C.
albicans gegenüber verschiedenen Antimykotika ein zunehmendes Problem dar.
Beispielsweise führt die vermehrte Expression von Membrantransporter-Genen wie
den Candida drug resistance-Genen CDR1 und CDR2 sowie dem Multidrug
resistance Gen MDR1 unter anderem zu einem verstärkten Efflux der Antimykotika
aus der Pilzzelle (Vanden Bossche et al., 1998; White et al., 1998). Zur
Resistenzentwicklung vieler Candida-Stämme kommt es ebenfalls durch Mutationen
der Lanosteroldemethylase, dem Angriffspunkt der Azol-Antimykotika, wodurch die
Affinität des Enzyms zum Antimykotikum herabgesetzt wird. Ferner kann eine
Überexpression des Gens ERG11, welches für die Lanosteroldemethylase kodiert,
zur Resistenz des Keimes führen (Sanglard et al., 1998).
5

1.2 Das Endothel und seine Rolle bei Entzündungsprozessen
Das arterielle und venöse Gefäßsystem ist an seiner luminalen Seite mit einer
einschichtigen Lage spezialisierter Zellen, dem Endothel, ausgekleidet. Es wurde
lange nur als eine physikalische Barriere zwischen dem extra- und intravasalen
Raum angesehen. Heute gilt das Endothel jedoch als eigenständiges und
metabolisch hochaktives Organ, das vielfältige Aufgaben bei der Blutdruckregulation,
beim Stoffaustausch zwischen Blut und Gewebe, bei Gerinnungsprozessen, bei der
Angiogenese und bei immunologischen Prozessen wahrnimmt (Busse R, 1993).
Die Rolle von Endothelzellen bei Entzündungsprozessen ist für die vorliegende
Arbeit von besonderem Interesse. Endogene Substanzen oder auch den
menschlichen Körper invadierende Keime und deren Produkte treten über das
zirkulierende Blut oder über die Gewebsseite in direkten Kontakt mit dem Endothel
und können dort eine Entzündungsreaktion hervorrufen. Als Antwort auf die
Exposition mit proinflammatorischen Substanzen oder Pathogenen kommt es
ausgehend von Endothelzellen lokal zu einer Immunreaktion, die durch die
klassischen Entzündungszeichen gekennzeichnet ist (Nathan, 2002). Das klinische
Bild der Entzündung wird hervorgerufen durch Dilatation von Arteriolen, Venolen und
Kapillaren verbunden mit einem gesteigerten Blutfluss, durch erhöhte Permeabilität
der Gefäße für Zellen und lösliche Bestandteile aus dem Blut und durch die
transendotheliale Migration von Leukozyten in das umliegende Gewebe. Ausgelöst
wird diese Kette von Reaktionen durch die Expression löslicher und
zelloberflächengebundener Proteine wie Chemokine, Zytokine und
Adhäsionsmoleküle durch die Endothelzellen (Beekhuizen and van Furth, 1993;
Denk et al., 2001; Goebeler et al., 1993; Michiels, 2003; Pober and Cotran, 1990).
1.3 Der NF-κB-Signalweg
Durch proinflammatorische Stimuli wird in fast allen Körperzellen ein konservierter
intrazellulärer Signaltransduktionsweg aktiviert, der zur Aktivierung des
Transkriptionsfaktors NF-κB führt. Diese Stimuli sind hauptsächlich interzelluläre
Botenstoffe und infektiöse Agenzien. Die Aktivierung von NF-κB führt zur Expression
einer Vielzahl von Genprodukten, insbesondere inflammatorischen Zytokinen,
6

Chemokinen, immunregulatorischen Oberflächenmolekülen und
Zelladhäsionsmolekülen (Pahl, 1999). Die Aktivierung dieser NF-κB-Zielgene dient
dem Aufbau einer schnellen Abwehrreaktion der Zelle und einer systemischen
Aktivierung des Immunsystems. Somit fungiert der Transkriptionsfaktor NF-κB als
Genschalter und zentraler Koordinator der menschlichen Immunantwort.
Der im Jahre 1986 erstmals beschriebene Faktor NF-κB (Sen and Baltimore, 1986)
ist mittlerweile ein kollektiver Begriff für strukturell verwandte, homo- und
heterodimere Transkriptionsfaktoren der Rel-Familie. Diese sind in den
verschiedenen Spezies höchst konserviert und spielen in der Transkriptionskontrolle
schnell induzierbarer Proteine eine zentrale Rolle (Baldwin, 1996; Baldwin, 2001). Im
Nachfolgenden wird mit „NF-κB“ das klassische Dimer p65/p50 bezeichnet.
Im Zytosol liegt NF-κB als inaktiver Komplex aus dem NF-κB-Dimer und einem
inhibitorischen Protein IκB (inhibitor of NF-κB) vor (Abbildung 1.2). IκBα wird durch
den aktiven IKK (IκBα Kinase)-Komplex an zwei Serinresten (Ser32 und Ser36)
phosphoryliert, wodurch seine Ubiquitinierung und Degradation im 26S-Proteasom
eingeleitet wird. Die Freisetzung von NF-κB von seinem inhibitorischen Protein führt
zur Translokation des Transkriptionsfaktors in den Zellkern, wo er an das NF-κB-
Kontrollelement in der Promoterregion der abhängigen Gene binden kann (Israel,
2000; Karin and Delhase, 2000). Der IKK-Komplex besteht aus den beiden Kinasen
IKKα und IKKβ sowie der regulatorischen Untereinheit NEMO (NF-κB essential
modulator), auch IKKγ genannt (Yamaoka et al., 1998). Bei Stimulation der Zellen,
z. B. durch TNFα (tumor necrose factor α), kann es zur Aktivierung des IKK-
Komplexes durch verschiedene MAPKK Kinasen (mitogen-activated protein kinase
kinase kinases) kommen. Beteiligte MAPKKKs können beispielsweise NIK (NF-κBinducing
kinase) oder MEKK1 (mitogen activated protein kinase/extracellular signalregulated
kinase kinase) sein. Außerdem können sie zur Aktivierung der MAP
Kinasen JNK und p38 führen.
7

Abbildung 1.2 Schematische Darstellung der NF-κB- und AP-1-Aktivierung. Als Antwort auf ein
extrazelluläres Signal z. B. über TNF-Rezeptoren, IL-1 Rezeptoren oder Toll-like Rezeptoren wird der
IKK-Komplex nach einer Serie von bisher unvollständig charakterisierten, an der zytoplasmatischen
Seite der Zellmembran ablaufenden Prozessen aktiviert. Die MAPK-Signalkaskaden können über eine
Quervernetzung ebenfalls aktiviert werden. Siehe Text für Details (in Anlehnung an (Karin and Ben-
Neriah, 2000; Wajant et al., 2003; Weston and Davis, 2002) und (Janssens and Beyaert, 2003)).
8

1.4 Der p38 MAP Kinase-Signalweg
Die Expression einiger NF-κB-Zielgene unterliegt dem modulierenden Einfluss
anderer Signalwege, beispielsweise dem p38 MAP Kinase-Signalweg (Goebeler et
al., 2001; Viemann et al., 2004; Wu et al., 1997).
p38 zählt zu den stressaktivierten Mitogen-aktivierten Protein Kinasen (mitogenactivated
protein kinase, MAPK) und spielt insbesondere bei Entzündungsprozessen
eine wichtige Rolle (Dong et al., 2002). Die MAPK-Signalwege bestehen aus einem
„drei-Kinasen-Modul“ (Widmann et al., 1999), das sich aus MAP Kinasen (MAPK),
MAPK Kinasen (MAPKK, MKK bzw. MEK) und MAPKK Kinasen (MAPKKK bzw.
MEKK) zusammensetzt, die sich in hierarchischer Folge aktivieren. Letztendlich
kommt es unter anderem zur Aktivierung von Transkriptionsfaktorproteinen, die im
Fall von JNK und p38 zum Transkriptionsfaktor AP-1 dimerisieren können
(Abbildung 1.2).
Neben p38 gehören zu den MAP Kinasen auch ERK1, 2 und 5 (extracellular signalregulated
kinases) und JNK (c-jun NH 2 -terminal kinase). Die
Signaltransduktionswege von JNK und p38 sind eng vernetzt, und es findet ein
wechselseitiger Signalfluss zwischen beiden Kaskaden statt (Lewis et al., 1998;
Schaeffer and Weber, 1999). Zu einer Vernetzung der MAPK-Signalwege mit der
NF-κB-Kaskade kann es ausgehend von TRAF über MAPKKKs kommen.
Die MAP Kinasen sind wichtige signalübertragende Enzyme, die in fast allen
eukaryontischen Zellen vorkommen und dort an vielen unterschiedlichen Prozessen
der zellulären Regulation beteiligt sind. Die MAPK Signalkaskaden sind an der
Kontrolle des programmierten Zelltodes und der Zellproliferation sowie an der
Regulation der Genexpression als Antwort auf einen extrazellulären Stimulus beteiligt
(Chang and Karin, 2001). Viele der von MAP Kinasen regulierten oder modulierten
Gene kodieren für Proteine mit immunmodulatorischer Wirkung (Ashwell, 2006).
9

1.5 Die angeborene Immunität
Die angeborene Immunität (innate immunity) stützt sich auf eine ganze Reihe
unterschiedlicher Abwehrmechanismen, die dem Schutz des Wirtes vor einer
Infektion dienen. Zum angeborenen Immunsystem zählen neben anatomischen und
physiologischen Barrieren (z. B. Epithelien) auch die Gegenwehr durch Phagozytose,
hydrolytische Enzyme, antimikrobielle Peptide und oxidative Spezies (Segal, 2005),
ebenso wie das Komplementsystem und proinflammatorische Signalmoleküle
(Zytokine, Chemokine, Oberflächenmoleküle), die die Immunantwort verstärken und
lenken können. Mit diesen unterschiedlichen Strategien der angeborenen Immunität
kann der Körper effektiv vor der Invasion pathogener Keime geschützt werden
(Abbas, 2005).
Die Rezeptoren der angeborenen Immunität, sogenannte Muster erkennende
Rezeptoren (pattern-recognition receptors, PRRs), erkennen evolutionär konservierte
molekulare Strukturen, die jeweils einer Vielzahl von pathogenen Mikroorganismen
gemeinsam sind und eng mit dem Überleben oder der krankmachenden Eigenschaft
des Erregers verbunden. Prominente Beispiele für diese Pathogen-assoziierten
molekularen Muster (pathogen-associated molecular patterns, PAMPs) sind
beispielsweise Lipopolysaccharide aus gramnegativen Bakterienzellwänden oder
CpG-reiche unmethylierte bakterielle DNA (Aderem and Ulevitch, 2000).
PRRs werden von zahlreichen Effektorzellen des angeborenen Immunsystems
exprimiert, zu denen auch Endothelzellen gehören. Das angeborene Immunsystem
bedient sich einer Vielzahl von PRRs, die auf der Zelloberfläche und in intrazellulären
Kompartimenten exprimiert sein können oder die ins Blut oder andere
Körperflüssigkeiten abgegeben werden. Die Hauptfunktionen der PRRs umfassen
die Opsonisierung des Pathogens, die Aktivierung des Komplementsystems und der
Gerinnungskaskade, die Einleitung der Phagozytose, die Induktion von Apoptose
und die Aktivierung von proinflammatorischen Signalwegen (Janeway and
Medzhitov, 2002).
Zu den signaltransferierenden PRRs gehören die Toll-like Rezeptoren (TLR) (Akira
and Takeda, 2004). Das Erkennen von PAMPs durch TLRs führt über eine
zytoplasmatische Signalkaskade zur Aktivierung von Transkriptionsfaktoren und zur
Transkription abhängiger Gene. Nachfolgend kommt es zur Expression eines für die
10

PAMPs und deren TLRs spezifischen Musters an proinflammatorischen Zytokinen,
Chemokinen und Adhäsionsmolekülen (Netea et al., 2004c; Pivarcsi et al., 2004;
Zeuke et al., 2002). TLRs stellen auch die Verbindung des angeborenen zum
adaptiven Immunsystem dar, indem die Reifung von dendritischen Zellen induziert
und die T-Zell-vermittelte Antwort dirigiert wird (Netea et al., 2004c).
Die frühe Abwehrreaktion des Menschen gegen C. albicans stützt sich auf das
System der angeborenen Immunität (Medzhitov and Janeway, 2000) und führt
anschließend zur Aktivierung des erworbenen Immunsystems. Beide eng vernetzten
Komponenten des Immunsystems sind für den Verlauf einer Candida-Infektion
entscheidend (Bellocchio et al., 2004).
1.6 Toll-like Rezeptoren (TLRs)
Toll wurde als erstes Mitglied der Toll/IL-1Rezeptor-Superfamilie in Drosophila
melanogaster während eines Screenings nach Polaritätsgenen in Embryonen
identifiziert (Hashimoto et al., 1988). Erst später wurde für diesen Rezeptor eine
Beteiligung an der Immunantwort der ausgewachsenen Fruchtfliege auf Infektionen
mit Pilzen und Gram-positiven Bakterien nachgewiesen (Lemaitre et al., 1996).
Strukturell ist Toll ein transmembranärer Rezeptor mit einer extrazellulären
Leucin-reichen Domäne (leucine-rich repeat, LRR) sowie einer intrazellulären
Domaine, die Sequenzhomologien zum Interleukin-1-Rezeptor (IL-1R) aufweist und
daher Toll/IL-1R (TIR) Domäne genannt wird (Akira and Takeda, 2004).
Nach der Entdeckung von Drosophila Toll wurden auch in Säugetieren Homologe
dieses Rezeptors beschrieben, bis heute sind zehn Toll-like Rezeptoren (TLRs 1-10)
im Menschen näher charakterisiert. Den humanen TLRs wird keine
entwicklungsphysiologische Funktion zugeschrieben, sie spielen aber eine wichtige
Rolle bei der angeborenen Immunität, indem sie verschiedene pathogene
Mikroorganismen erkennen und eine Reihe von proinflammatorischen Signalen
auslösen. Die TLRs unterscheiden sich durch ihre Ligandenspezifität (Abbildung 1.3),
ihre Expressionsmuster und wahrscheinlich auch in den Zielgenen, die sie induzieren
können (Janeway and Medzhitov, 2002).
11

Abbildung 1.3 TLRs und ihre Liganden. Dargestellt sind Drosophila Toll, die 10 humanen TLRs
sowie der IL-1 Rezeptor. Die waagerechten Pfeile weisen auf die Heterodimerisierung von TLR2/TLR1
und TLR2/TLR6 hin. Spaetzle ist der natürliche Ligand von Drosophila Toll. Die Darstellung zeigt die
wichtigsten Liganden und erhebt keinen Anspruch auf Vollständigkeit (in Anlehnung an (Akira and
Takeda, 2004)).
LRRs: leucine-rich repeats; TIR Domaine: Toll/IL-1R Domaine; triacyl. LP: triacylierte Lipoproteine;
Pam3CSK4: synthetisches triacyliertes Lipoprotein; LTA: Lipoteichonsäure; PGN: Peptidoglykane;
LAM: Lipoarabinomannan (von Mykoplasmen); dsRNA: doppelsträngige RNA;
LPS: Lipopolysaccharide (von Gram-negativen Bakterien); diacyl. LP: diacylierte Lipoproteine;
ssRNA: einzelsträngige RNA; CpG-DNA: CpG-reiche unmethylierte Bakterien-DNA
Die TLR-Signalkaskade führt über verschiedene Protein-Protein-Interaktionen,
Konformationsänderungen und Phosphorylierungsreaktionen zur Aktivierung von
Transkriptionsfaktoren und damit zur Transkription der für die immunologische
Antwort relevanten Gene. Die Signaltransduktion der TLRs kann abhängig oder
unabhängig von dem Adapterprotein MyD88 (myeloid differentiation marker 88)
erfolgen (vgl. Abbildung 1.2).
Bei der MyD88-abhängigen Signalkaskade kommt es nach Bindung des Rezeptors
durch den entsprechenden Liganden über Interaktionen der TIR-Domainen zur
Rekrutierung von MyD88-Adaptermolekülen an den aktivierten Rezeptor. MyD88
rekrutiert die Kinase IRAK4 (IL-1R-associated kinase 4) in den Komplex. Weiterhin
wird ein bereits im Zytosol vorliegender Komplex aus Tollip (Toll interacting protein)
und IRAK1 (IL-1R-associated kinase 1) an den Rezeptor assoziiert, was eine
MyD88-IRAK1-Wechselwirkung über deren N-terminale Todesdomainen (death
domain) erlaubt und IRAK4 in enge Nachbarschaft mit IRAK1 bringt. Dadurch kann
IRAK4 IRAK1 phosphorylieren, was für eine Aktivierung von IRAK1 wichtig ist und
12

eine Reihe von Autophosphorylierungen von IRAK1 nach sich zieht. TRAF6
(TNF receptor-associated factor 6) wird transient an phosphorylierte IRAK1
gebunden und verlässt mit dieser den Rezeptorkomplex. Im Komplex mit den
Adaptermolekülen TAB1 und TAB2 (in Abbildung 1.2 nicht gezeigt) aktiviert TRAF6
die Kinasen TAK1 (transforming growth factor β-activated kinase) und MEKK1
(mitogen activated protein kinase/extracellular signal-regulated kinase kinase), die
wiederum den IKK-Komplex und die MAPKs aktivieren können (Janssens and
Beyaert, 2003).
Im Mausmodell wurde erstmals 2002 die Beteiligung der beiden Rezeptoren TLR2
und TLR4 bei der Erkennung von C. albicans impliziert (Netea et al., 2002). Seitdem
ist eine Vielzahl von Studien publiziert worden, die vermuten lässt, dass in
unterschiedlichen Zelltypen verschiedene Rezeptoren (TLR2 und/oder TLR4,
evtl. unter Beteiligung des Mannose-Rezeptors oder der C-Typ Lektin-Rezeptoren
Dectin-1 oder DC-SIGN) für die Erkennung von C. albicans verantwortlich sein
könnten (Cambi et al., 2003; Gantner et al., 2003; Roeder et al., 2004a; Szolnoky et
al., 2001; Taylor et al., 2007). Die Rolle von Toll-like Rezeptoren bei der Erkennung
von C. albicans durch humane Endothelzellen soll daher in der vorliegenden Arbeit
näher untersucht werden.
TLR4 wurde als erster Toll-like Rezeptor charakterisiert (Medzhitov et al., 1997;
Poltorak et al., 1998). Er ist essentiell für die Erkennung von Lipopolysacchariden
(LPS) aus der Gram-negativen Bakterienzellwand. TLR4 bildet an der Zellmembran
ein Dimer zusammen mit MD-2, einem extrazellulären Adapterprotein, das die
Bindung des Ligandenkomplexes aus LPS, LBP (LPS binding protein) und CD14 aus
dem Serum an den TLR4 vermittelt (Hailman et al., 1994; Tobias et al., 1995; Visintin
et al., 2003). Durch die Bindung von LPS an den Rezeptorkomplex kommt es zu
einer frühen MyD88-abhängigen Aktivierung von NF-κB und in einer späten
MyD88-unabhängigen Reaktionskaskade (Palsson-McDermott and O'Neill, 2004).
Neben LPS stellen auch Fibronectin, das Fusionsprotein des respiratory syncytial
virus (RSV) und Taxol, ein pflanzliches Diterpen, Liganden von TLR4 dar (Kawasaki
et al., 2000; Kurt-Jones et al., 2000; Okamura et al., 2001).
Die Erkennung von Liganden über TLR2 ist ebenfalls sehr komplex. TLR2 ist in der
Lage, ein sehr breites Spektrum an unterschiedlichen Komponenten mikrobieller
Pathogene zu binden. Die durch TLR2 erkannten Liganden reichen von Strukturen
13

der Gram-positiven Bakterienzellwand über Pilzkomponenten bis zu
Mykoplasmenbestandteilen. Eine Erklärung für die Bindung solch unterschiedlicher
PAMPs liegt darin, dass TLR2 Heterodimere mit anderen TLRs bildet (Ozinsky et al.,
2000; Takeuchi et al., 2001; Wyllie et al., 2000). So konnte ein Heterodimer aus
TLR2 und TLR1 nachgewiesen werden, das z. B. ein triacyliertes Lipoprotein von
Borrelia burgdorferi bindet (Kirschning and Schumann, 2002). Außerdem wurden
TLR2/TLR6-Dimere gefunden, die beispielsweise Zymosan (ein Zellwandbestandteil),
Mykoplasma-Lipoprotein oder diacylierte Lipoproteine binden können.
Neben den extrazellulären TLRs (TLR1, TLR2, TLR4, TLR6) kommen andere TLRs
intrazellulär vor und erkennen Strukturen von in die Zelle eingedrungenen
Pathogenen. Dies sind TLR3, dessen Ligand Doppelstrang-RNA ist, TLR7 und TLR8,
die beispielsweise Einzelstrang-DNA erkennen, und TLR9, der CpG-reiche DNA
bindet.
1.7 Ziel der Arbeit
Die Bedeutung der NF-κB-Signalkaskade und der Rezeptoren der angeborenen
Immunität für die Erkennung von C. albicans durch Makrophagen und Keratinozyten
von Maus und Mensch wurde mehrfach gezeigt (Netea et al., 2004b; Pivarcsi et al.,
2004; Roeder et al., 2004b). Wenig bekannt ist bislang aber über die Interaktionen
von C. albicans und humanen Endothelzellen, wie sie bei einer Streuung des Pilzes
im Blut auftreten.
Das Genexpressionsprofil von Endothelzellen nach einer C. albicans-Infektion wurde
bisher noch nicht untersucht, es könnte aber weitere Erkenntnisse über die
Abwehrmechanismen dieser Zellen während eines Infektionsgeschehens bringen.
Zudem gibt es noch keine systematischen Studien über die durch C. albicans
induzierten Signaltransduktionsprozesse sowie über die Vermittlung des Candidainduzierten
Signals auf Rezeptorebene in diesem Zelltyp. Die Untersuchung der
Signalperzeption ist vor dem Hintergrund der Diskussion über die Beteiligung von
TLR4 neben TLR2 an der Übertragung des Candida-Signals in anderen Zelltypen
besonders interessant (Gil and Gozalbo, 2006a; Gil and Gozalbo, 2006b; Netea et
al., 2006b).
14

Mit der vorliegenden Arbeit sollte daher im Einzelnen auf folgende Fragenkomplexe
eingegangen werden:
1) Unter welchen Bedingungen reagieren primäre humane Endothelzellen
(HUVEC) in vitro auf eine Infektion mit Candida albicans?
2) Welche globalen Genmuster werden in humanen Endothelzellen durch
C. albicans induziert?
3) Welche Signaltransduktionskaskaden sind für die beobachteten Änderungen
am basalen Genmuster verantwortlich?
4) Über welchen Rezeptor / welche Rezeptoren werden C. albicans-induzierte
Signale in HUVEC vermittelt? Welche neuen Erkenntnisse lassen sich aus
den erhaltenen Daten für die Therapie Candida-induzierter Krankheiten
ableiten?
15

2 Material
2.1 Chemikalien
Sofern nicht anders angegeben, wurden alle Chemikalien und Lösungsmittel in
p.a. Qualität von folgenden Firmen bezogen: AppliChem (Darmstadt), Fluka (Buchs,
Schweiz), Merck (Darmstadt), Roth (Karlsruhe) und Sigma (Taufkirchen)
2.2 Lösungen und Puffer
Gebräuchliche Lösungen und Puffer wurden nach Protokollen von Sambrook et al.
(Sambrook, 1989) hergestellt. Für die Durchführung der Experimente essentielle
Puffer und Lösungen sind nachfolgend aufgelistet:
2.2.1 Puffer für Western Blots und Gelelektrophoresen
4 x SDS-Probenpuffer
250 mM Tris-HCl (pH 6,8), 8 % Natriumdodecylsulfat, 40 % Glycerol, 10 %
β-Mercaptoethanol, 0,01 % Bromphenolblau in dd H 2 O
Trenngel-Vormix
0,75 M Tris-HCl (pH 8,8), 0,2 % SDS in dd H 2 O
Sammelgel-Vormix
0,25 M Tris-HCl (pH 6,8), 0,2 % SDS in dd H 2 O
1 x SDS-PAGE-Laufpuffer
25 mM Tris-HCl, 192 mM Glycin, 0,1 % SDS in dd H 2 O
1 x Blottingpuffer
25 mM Tris-HCl, 192 mM Glycin, 20 % Methanol in dd H 2 O
1 x TRIS-gepufferte Kochsalzlösung (TBS)
20 mM Tris-HCl, 137 mM Natriumchlorid in dd H 2 O, mit HCl auf pH 7,6 eingestellt
1 x TBS-Tween (TBST)
0,05 % Tween 20 in 1 x TBS
Milchpulver-Blockingpuffer
5 % Magermilchpulver in 1 x TBS
Strippingpuffer
100 mM β-Mercaptoethanol, 2 % SDS, 62,5 mM Tris-HCl (pH 6,7) in dd H 2 O
17

6 x Probenpuffer für Agarose-Gelelektrophorese
0,25 % Bromphenolblau, 40 % Sucrose in dd H 2 O
1 x TAE-Puffer
40 mM Tris-Acetat und 1 mM Natrium-EDTA in dd H 2 O; mit Essigsäure auf pH 8,3
eingestellt
2.2.2 Puffer für Proteinbestimmungen und Protein-Aktivierungsassays
E1A Lysis Puffer (ELB)
150 mM Natriumchlorid, 50 mM HEPES (pH 7,5), 5 mM EDTA, 0,1 % NP-40 in
dd H 2 O; jeweils frisch mit 20 mM Natrium-β-Glycerophosphat, 0,5 mM
Natriumorthovanadat und 1 x Complete (Roche, Grenzach) supplementiert
Triton Lysis Puffer (TLB)
20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 137 mM Natriumchlorid, 10 % Glycerol, 1 % Triton-X-
100, 2 mM EDTA, 50 mM Natrium-β-Glycerophosphat, 20 mM
Natriumpyrophosphat in dd H 2 O; jeweils frisch mit 1 mM Pefabloc ® , 5 µM/ml
Leupeptin, 5 µM/ml Aprotinin, 5 mM Benzamidin und 1 mM Natriumorthovanadat
supplementiert
Kinasepuffer
10 mM Magnesiumchlorid, 25 mM HEPES (pH 7,5), 25 mM Natrium-β-
Glycerophosphat in dd H 2 O; jeweils frisch mit 5 mM Benzamidin, 1 mM
Natriumorthovanadat und 0,5 mM Dithiothreithol (DTT) supplementiert
2.2.3 Puffer und Lösungen für Transfektionen
5 mg/ml Polybrene in dd H 2 O; sterilfiltriert
2 x HBS-Puffer
280 mM Natriumchlorid, 10 mM Kaliumchlorid, 1,5 mM Dinatriumhydrogenphosphat,
12 mM Glukose, 50 mM HEPES in dd H 2 O; mit Natronlauge
auf pH 7,05 eingestellt und sterilfiltriert
2,5 M Kalziumchlorid-Lösung; sterilfiltriert
1 mM HEPES in PBS; sterilfiltriert
10 mg/ml DEAE-Dextran in dd H 2 O; sterilfiltriert
100 mM Chloroquine in dd H 2 O; sterilfiltriert
18

2.3 Enzyme und zugehörige Puffer
Restriktionsenzyme
Tango-Puffer
T4 DNA Ligase
Ligasepuffer
Pfu DNA Polymerase
Fermentas (St. Leon-Rot)
Fermentas (St. Leon-Rot)
Fermentas (St. Leon-Rot)
Fermentas (St. Leon-Rot)
Fermentas (St. Leon-Rot)
2.4 Stimulantien und Inhibitoren
Stimulans
Verdünnung (soweit nicht
anders angegeben)
Herkunft
rekombinantes TNFα 2 ng/ml R&D (Minneapolis, USA)
rekombinantes IL-1β 100 U/ml R&D (Minneapolis, USA)
Lipopolysaccharid (LPS) von
E. coli
100 ng/ml Sigma (Taufkirchen)
Pam3CSK4 200 ng/ml InvivoGen (San Diego, USA)
Poly(I:C) 1 µg/ml InvivoGen (San Diego, USA)
Inhibitor
Verdünnung (soweit nicht
anders angegeben)
Herkunft
rekombinanter IL-1-R
Antagonist
200 ng/ml R&D (Minneapolis, USA)
Etanercept (Enbrel ® ) 10 µg/ml Wyeth Pharma (Münster)
SB202190 0,001 – 10 µM Calbiochem (Darmstadt)
Polymyxin B-sulfat (PMB) 50 µg/ml Sigma (Taufkirchen)
Aprotinin 1 µg/ml Sigma (Taufkirchen)
Pefabloc ® 0,25 mM Merck (Darmstadt)
19

2.5 Antikörper
2.5.1 Antikörper für Western Blots
Primärantikörper Verdünnung Herkunft
Maus Anti-IL-8 1 µg/ml BD Pharmingen (Franklin Lakes, USA)
Maus Anti-IKK2 1:500 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz,
USA)
Kaninchen Anti-IκBα 1:800 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz,
USA)
Kaninchen Anti-ERK2 1:2000 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz,
USA)
Kaninchen Anti-IRAK1 (C-terminal) 1 µg/ml Upstate (Lake Placid, USA)
Maus Anti-Myc 1 µg/ml Upstate (Lake Placid, USA)
Ratte Anti-HA (high affinity) 50 ng/ml Roche (Grenzach)
Sekundärantikörper Verdünnung Herkunft
Schaf Anti-Maus HRP 1:2000 Amersham (Buckinghamshire, GB)
Esel Anti-Kaninchen HRP 1:2000 Amersham (Buckinghamshire, GB)
Ziege Anti-Ratte HRP 1:2000 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz,
USA)
2.5.2 Antikörper für Durchflußzytometrie
Primärantikörper Verdünnung Herkunft
Maus Anti-ICAM 1:100 Immunotech (Marseille, F)
Maus Anti-TLR2 1:100 BioLegend (San Diego, USA)
Maus Anti-TLR4 1:100 BioLegend (San Diego, USA)
Maus IgG Isotypkontrolle 1:100 Dako Cytomation (Hamburg)
Sekundärantikörper Verdünnung Herkunft
Esel Anti-Maus Cy5-gekoppelt 1:200 Dianova (Hamburg)
Ziege Anti-Maus Biotin-gekoppelt 1:200 Dianova (Hamburg)
Streptavidin-PE-Cy5 1:250 BD Pharmingen (Franklin Lakes, USA)
20

2.6 Reagenziensätze (Kits)
ECL Western Blotting Detection Reagents
Qiagen Plasmid Kits (Mini, Midi, Maxi)
QIAquick Gel Extraction Kit
DyeEx 2.0 Spin Kit
BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit
BD OptEIA human IL-8 ELISA Set
Duo Set human MIP-3α ELISA Development System
Dual-Glo Luciferase Assay System
Quick Start Bradford Dye Reagent
Amersham
(Buckinghamshire, GB)
Qiagen (Hilden)
Qiagen (Hilden)
Qiagen (Hilden)
Applied Biosystems
(Foster City, USA)
BD Pharmingen
(Franklin Lakes, USA)
R&D (Minneapolis, USA)
Promega
(Madison, USA)
BioRad (München)
2.7 Transfektionsreagenzien
DEAE-Dextran
Lipofectamine 2000
FuGENE 6
Oligofectamine
HiPerFect
Effectene
PromoFectin-HUVEC
Magnet Assisted Transfection (MATra)-Reagenz
HUVEC Nucleofector Kit
Sigma (Taufkirchen)
Invitrogen (Karlsruhe)
Roche (Grenzach)
Invitrogen (Karlsruhe)
Qiagen (Hilden)
Qiagen (Hilden)
PromoCell (Heidelberg)
PromoCell (Heidelberg)
Amaxa (Köln)
2.8 Zellkulturmaterial
2.8.1 Medien und Medienzusätze
Endothelial Cell Basal Medium (EBM)
EGM-SingleQuot Supplements and Growth Factors
Cambrex
(East Rutherford, USA)
Cambrex
(East Rutherford, USA)
21

Dulbecco’s modified Eagle’s Medium +GlutaMAX I Gibco (Karlsruhe)
Medium M199 with Earle‘s Salt
PAA (Pasching)
(gebrauchsfertig und Pulver zum Ansetzen von Medium)
RPMI 1640 Medium + GlutaMAX I
Gibco (Karlsruhe)
OptiMEM I Reduced Serum Medium
Invitrogen (Karlsruhe)
Fötales Rinderserum (foetal bovine serum, FBS)
PAA (Pasching)
100 x Penicillin/Streptomycin (10.000E/10 mg/ml) Linaris (Wertheim)
L-Glutamin
Linaris (Wertheim)
Hydrokortison
Calbiochem (Darmstadt)
Gentamicin
Sigma (Taufkirchen)
Liquemin ® N5000 (Heparin-Natrium)
Roche (Grenzach)
100 x Non-essential amino acids Biochrom (Berlin)
Natriumpyruvat
Sigma (Taufkirchen)
Insulin (vom Rind)
Sigma (Taufkirchen)
Zeozin Cayla (Toulouse, F)
Puromycin
AppliChem (Darmstadt)
Amphotericin B
Sigma (Taufkirchen)
2.8.2 Sonstiger Zellkulturbedarf
1 x phosphatgepufferte Kochsalzlösung Gibco (Karlsruhe)
ohne Ca 2+ /Mg 2+ (PBS)
Dimethylsulfoxid (DMSO)
Serva (Heidelberg)
10 x Trypsin/EDTA (0,5 %/0,2 % in PBS) Pan (Aidenbach)
Trypanblau
Sigma (Taufkirchen)
Zellkulturschalen und -flaschen
Greiner (Frickenhausen),
BD Falcon
(Franklin Lakes, USA)
0,45 und 0,8 µm Spritzenvorsatzfilter Sartorius (Göttingen)
Mikrotiterplatten mit hoher Bindungsaffinität
Nunc (Wiesbaden)
Sabouraud-Glukose-Agarplatten
Merck (Darmstadt)
Microbank Kryoröhrchen
Mast Diagnostica
(Bootle, GB)
22

2.9 Plasmide
Für Promoter-Reporter-Assays (Luciferaseassays) wurden ein 6xκB-abhängiges
Firefly-Luciferase Konstrukt und ein Ubiquitin-abhängiges Renilla-Luciferase
Konstrukt verwendet (freundlicherweise zur Verfügung gestellt von B. Baumann,
Universität Ulm).
Für die retrovirale Infektion einer Kinase-toten Mutante von IKK2 (IKK2KD, (Denk et
al., 2001)) und dominant-negativer Mutanten von IRAK1 (IRAK(83-544), (Cao et al.,
1996)) und von MyD88 (MyD88(152-296), (Wesche et al., 1997)) wurde der
retrovirale Vektor pCFG5-IEGZ genutzt. Dieser Vektor verfügt über eine multiple
cloning side, in die die Konstrukte kloniert wurden, und über ein Zeozin-
Resistenzgen. Zusätzlich enthält das MyD88dn-Konstrukt ein Myc-Tag, über welches
der Expressionsnachweis mittels Western Blot möglich war, da zwei getestete
Antikörper gegen MyD88 selbst keine zufriedenstellenden Ergebnisse lieferten. Der
IRAK1-Antikörper erkennt zwar das endogene Protein, nicht aber die kürzere IRAK1-
DD-Mutante, sodass zu deren Nachweis mittels Western Blot ein enthaltenes HA-
Tag diente.
Verschiedene dsDNA-Oligonukleotide, die für small hairpin RNA (shRNA) gegen
MyD88 oder IRAK1 kodierten, wurden mit der iRNAi 2.0 Software (NKI, Nederlands
Kanker Instituut) entworfen und von Sigma Genosys synthetisiert. Die Konstrukte
wurden zur Testung und für eine retrovirale Infektion in den Vektor pRetroSuper
(pRS) kloniert (Brummelkamp et al., 2002). Dieser Vektor verfügt neben der multiple
cloning side über ein Puromycin-Resistenzgen.
2.10 siRNAs (Doppelstrang-Oligonukleotide)
Zur Herunterregulation einzelner Proteine in HUVEC wurden folgende bei der Firma
Qiagen (Hilden) kommerziell erworbenen siRNAs verwendet:
siRNA MyD88
Hs_MYD88_5_HP Validated siRNA (# SI00300909)
Targetsequenz AACTGGAACAGACAAACTATC
siRNA TLR3
Hs_TLR3_8_HP Validated siRNA (# SI02655156)
Targetsequenz AAGAACTGGATATCTTTGCCA
siRNA TLR4
Hs_TLR4_1 (# SI00151004)
Targetsequenz CTCGATGATATTATTGACTTA
23

2.11 Zellen, Pilze und Bakterien
HUVEC primäre humane Nabelschnurendothelzellen
(human umbilical vein endothelial cell);
Cambrex (East Rutherford, USA) und Promocell
(Heidelberg)
UTA 6
humane Osteosarkoma-Zelllinie,
abgeleitet von U2OS (Englert et al., 1995);
Stammsammlung des Nederlands Kanker Instituut
(NKI, Amsterdam, NL)
HEK293 humane embryonale Nierenzelllinie (human
embryonic kidney epithelial cell line);
InvivoGen (San Diego, USA)
HEK293-hTLR1/2
HEK293-Zelllinie, exprimiert stabil die humanen
TLRs 1 und 2; InvivoGen (San Diego, USA)
HEK293-hTLR4/CD14/MD-2 HEK293-Zelllinie, exprimiert stabil den humanen
TLR4 zusammen mit CD14 und MD-2;
InvivoGen (San Diego, USA)
THP-1
humane monozytäre Zelllinie;
Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und
Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig)
ΦNX ampho
retrovirale Verpackerzelllinie;
Orbigen (San Diego, USA)
FLYRD-18
Fibrosarkomazelllinie zur hochtitrigen Produktion
von rekombinanten Retroviren
(Cosset et al., 1995);
European Collection of Cell Cultures
Candida albicans SC3514 humanpathogener Hefepilz-Stamm;
O. Kurzai, Universität Würzburg
DH5α hitzekompetenter E. coli-Stamm für die
Amplifikation von rekombinanten Plasmiden;
Bethesda Res.Lab. (Bethesda, USA)
24

2.12 Geräte
Brutschränke: HERAcell 150
Inkubatoren: Certomat R und Certomat HK
Sterile Werkbänke: HERAsafe
Ultrazentrifuge: Sorvall RC5C plus
Megazentrifuge: Megafuge
Minizentrifugen: MiniSpin plus und 5417R
Mikroskope: Leica DM IL und Leica DM IRB
Waagen: Sartorius TE1502S und Sartorius BP301S
PCR-Cycler: PTC-200 und DNA Engine DYAD
Elektrophoresekammern (DNA-Gele)
Gel-Imager
DNA Sequenzer: Abi Prism 310
Elektrophorese- und Blottingkammern (Proteingele)
UV/Vis-Spektralphotometer: Ultospec 3100 pro
Spektral-Photometer: SLT RainBow (ELISA-Reader)
Luminometer: Luminoskan Ascent
Röntgenfilm-Entwicklermaschine
FACS Scan und FACS Calibur
Phosphoimager: Fuji BAS 2000
Heraeus (Hanau)
Braun Biotech
(Melsungen)
Heraeus (Hanau)
Kendro (Langenselbold)
Heraeus (Hanau)
Eppendorf (Hamburg)
Leica (Solms)
Sartorius (Göttingen)
MJ Research
(Waltham, USA)
Biometra (Göttingen)
Intas (Göttingen)
Applied Biosystems
(Foster City, USA)
BioRad (München)
Biometra (Göttingen)
SLT Labinstruments
(Crailsheim)
Thermo Labsystems
(Waltham, USA)
Kodak (Stuttgart)
Becton Dickinson
(Franklin Lakes, USA)
Raytest (Straubenhardt)
25

3 Methoden
3.1 Zellkultur
Alle Zellkulturarbeiten wurden unter sterilen Bedingungen (unter Laminar Air Flow,
Verwendung steriler Lösungen und Medien, steriles Verbrauchsmaterial)
durchgeführt. Sämtliche primären Zellen und Zelllinien wurden bei 37°C, 5 % CO 2
und hoher Luftfeuchtigkeit kultiviert.
3.1.1 Lagerung, Einfrieren und Rekultivierung von Zellen
Die Langzeitlagerung aller Zellen erfolgte in flüssigem Stickstoff. Zum Einfrieren der
Zellen wurden diese durch Inkubation mit 1 x Trypsin/EDTA von der Kulturplatte
gelöst, die Wirkung des Trypsins mit gleichem Volumen an 10 %igem FBS in PBS
abgestoppt, die Zellen pelletiert und in 1 ml Einfriermedium bestehend aus 10 %
DMSO, 20 % FBS und 70 % des jeweiligen Kulturmediums aufgenommen. Je nach
Bedarf wurden die Zellen in kleinere Portionen aufgeteilt und über Nacht bei -80°C in
einem Styroporständer eingefroren. Am nächsten Tag wurden die Aliquots in
flüssigen Stickstoff überführt. Zur Rekultivierung der Zellen wurden diese in einem
Wasserbad bei 37°C aufgetaut, in vorgewärmtem Medium suspendiert und auf
Kulturgefäße verteilt. Am folgenden Tag wurde zur Entfernung von DMSO-Resten
das Medium gewechselt.
3.1.2 Zellkultur
3.1.2.1 HUVEC
Die primären humanen Nabelschnurendothelzellen wurden bei den Firmen Cambrex
(East Rutherford, USA) und Promocell (Heidelberg) erworben. Die Stockaliquots
wurden bis zur Passage 3 vermehrt und zur Lagerung in flüssigen Stickstoff
überführt. Bei Bedarf wurden HUVEC mit einer Dichte von mindestens 3500
Zellen/cm 2 auf Zellkulturgefäße ausgesät. Bis zum Erreichen der gewünschten
Konfluenz wurde alle 2-3 Tage das Medium gewechselt.
Zellkulturmedium: Mischung aus 1 Teil EBM Basal Medium mit EGM-SingleQuot
Supplements and Growth Factors (500 ml Basalmedium werden supplementiert mit
10 ml Fetal Bovine Serum (FBS), 0,5 ml human Endothelial Growth Factor (hEGF),
27

0,5 ml Hydrocortison, 0,5 ml Gentamicin/Amphotericin B und 2 ml Bovine Brain
Extract mit Heparin) und 2 Teilen M199 supplementiert mit 10 % FBS, 30 µg/ml
Gentamicin, 15 pg/ml Amphotericin B und 0,8 I.E./ml Heparin.
3.1.2.2 HEK293, HEK293-hTLR1/2 und HEK293-hTLR4/CD14/MD-2
Bei HEK293 handelt es sich um eine humane embryonale Nierenzelllinie. Von der
Firma InvivoGen (San Diego, USA) wurden neben den Wildtypzellen auch
Transfektanten bezogen, die entweder die humanen Toll-like Rezeptoren (TLR) 1
und 2 oder den humanen TLR 4 zusammen mit CD14 und MD-2 exprimieren. Der
Wildtyp und die Transfektanten wurden in Dauerkultur zweimal pro Woche bei
70-80 % Konfluenz 1:6 (Wildtyp) bzw. 1:4 (Transfektanten) gesplittet. Dafür wurden
die Zellen einmal vorsichtig mit PBS gewaschen und anschließend kurz (ca. 1 min)
mit 1 x Trypsin/EDTA inkubiert. Das Trypsin wurde nach dem Ablösen der Zellen
durch ein äquivalentes Volumen einer 10 %igen FBS-Lösung in PBS inaktiviert.
Die Zellen wurden 5 min bei 1200 rpm pelletiert, in frischem Medium
wiederaufgenommen und ausgesät.
Zellkulturmedium: DMEM supplementiert mit 10 % FBS und 30 µg/ml Gentamicin.
3.1.2.3 THP-1
Die monozytäre Suspensionszelllinie THP-1 wurde nach einem Protokoll der
Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig)
in einer Dichte zwischen 2 x 10 5 und 1 x 10 6 Zellen/ml gehalten. Dafür wurde
regelmäßig alle 2-3 Tage mittels Neubauer-Zählkammer die Zellzahl bestimmt und
die Zellen entsprechend gesplittet. Für den Mediumwechsel bzw. die Passagierung
wurde die Zellsuspension 5 min bei 1200 rpm zentrifugiert und das Pellet
anschließend in frischem Medium resuspendiert. Diese Suspension wurde entweder
zur Dauerkultur mit 2 x 10 5 Zellen/ml neu ausgesät und kultiviert oder am Vortag
eines Experiments in einer Dichte von 375.000 Zellen/ml auf 6-Loch-Platten
ausgesät.
Zellkulturmedium: RPMI1640 mit GlutaMAX supplementiert mit 10 % FBS, 1 x nichtessentiellen
Aminosäuren, 1 x Penicillin/Streptomycin, 1 mM Natriumpyruvat und
9 µg/ml bovines Insulin
28

3.1.2.4 ΦNX ampho und FLYRD-18
Die retroviralen Verpackerzelllinien ΦNX ampho und FLYRD-18 und deren stabile
Transfektanten wurden für die Dauerkultur alle 2-3 Tage mit frischem Medium
versorgt und zweimal pro Woche vor Erreichen der Konfluenz gesplittet. Dafür
wurden ebenso verfahren wie unter 3.1.2.2 beschrieben.
Zellkulturmedium: DMEM supplementiert mit 10 % FBS und 30 µg/ml Gentamicin.
3.1.3 Herstellung verschiedener Präparationen von Candida albicans
Für alle Untersuchungen wurde der C. albicans-Stamm SC5314 verwendet (Gillum et
al., 1984). Aus C. albicans-Kolonien auf einem Sabouraud-Glukose-Agar wurde nach
den Herstellerangaben in einem Microbank Kryoröhrchen (Mast Diagnostica,
Bootle, GB) eine Stammsuspension hergestellt und bei -80°C aufbewahrt.
3.1.3.1 Lebende Hefezellen
Um eine einheitliche morphologische Form der C. albicans-Zellen als Hefe zu
erreichen, wurden jeweils am Vorabend eines Versuches 20 ml Medium M199 (mit
HCl auf pH 4 eingestellt und sterilfiltriert) mit einer Impfperle aus der gefrorenen C.
albicans-Suspension geimpft. Dieser Ansatz wurde über Nacht bei 28°C mit 200 rpm
geschwenkt.
3.1.3.2 Hitze-inaktivierte Hefezellen
Zur Analyse von Hitze-inaktivierten C. albicans wurden über Nacht Hefezellen
generiert wie unter 3.1.3.1 beschrieben. Am Versuchstag wurde 1 ml der
Candida-Kultur entnommen und für 30 min bei 95°C inkubiert.
3.1.3.3 SB202190-vorbehandelte Hefezellen
SB202190-vorbehandelte Hefezellen wurden generiert, indem über Nacht eine
SB202190-Lösung (10 µM, in Medium M199 mit pH 4) als Anzuchtmedium
eingesetzt wurde.
3.1.4 Stimulation und Inhibitorinkubation
Für Stimulationen mit C. albicans wurde 24 Stunden vor Versuchsbeginn bei allen
Zellen das übliche Kulturmedium durch antibiotikafreies, ansonsten gleiches Medium
ersetzt. Soweit nicht anders angegeben, war das Medium während der Stimulation
für alle Zellen M199 supplementiert mit 7 % FBS. Zur Stimulation mit C. albicans
29

wurde am Versuchstag 1 ml der Übernachtkultur (Abschnitt 3.1.3.1) entnommen und
5 min mit 5000 rpm in einer Eppendorf-Minizentrifuge zentrifugiert. Der Überstand
wurde verworfen und das Candida-Pellet in 1 ml PBS resuspendiert. Anschließend
wurde eine 1:100-Vorverdünnung dieser Candida-Suspension mit Hilfe einer
Neubauer-Zählkammer ausgezählt. Eine Einheit (ein Well einer 6-Loch-Platte oder
eine 10 cm-Schale) der zu stimulierenden Zellen wurde ebenfalls mittels Neubauer-
Zählkammer ausgezählt, nachdem adhärente Zellen zuvor mit Trypsin von der
Kulturschale gelöst worden waren. Die verbleibenden plattierten Zellen wurden dann,
soweit nicht anders angegeben, mit der gleichen Anzahl an Candida-Hefezellen aus
der PBS-Suspension (multipicity of infection, MOI = 1) versetzt. Bei Verwendung
anderer Stimuli wurden die Agenzien direkt aus einer Stocklösung dem
Kulturmedium zugesetzt. Wenn nötig wurden diese zuvor in M199 oder, bei
Unlöslichkeit in wässrigen Medien, in einem passenden Lösungsmittel vorverdünnt.
Für die Zugabe von Inhibitoren wurde ebenso verfahren. Inhibitoren wurden vor der
Stimulation jeweils für 30 min vorinkubiert.
3.2 Gentransfer in eukaryotische Zellen
Je nach Zelltyp und Verwendungszweck der transfizierten Zellen wurde eine der
nachfolgenden Transfektionsmethoden eingesetzt.
HUVEC ließen sich am besten mittels retroviraler Infektion stabil transfizieren, für
eine transiente Transfektion wurde die DEAE-Dextran-Methode angewendet. HEK
293-Zellen und UTA6 wurden mit der Kalziumphosphat-Methode transfiziert. Für die
Verpackerzelllinien ΦNX ampho und FLYRD-18 stellten sich die Transfektionen mit
den kommerziellen Transfektionsreagenzien Lipofectamine 2000 und FuGENE 6
oder auch die Kalziumphosphat-Methode als beste Verfahren heraus.
Für alle Methoden befanden sich die Zellen am Tag der Transfektion in der
logarithmischen Wachstumsphase (ca. 40-60 % Konfluenz).
30

3.2.1 Retrovirale Infektion von HUVEC
Zur Überexpression dominant-negativer Mutanten von MyD88 und IRAK1 in HUVEC
kam der retrovirale Vektor pCFG5-IEGZ zum Einsatz. Plattierte HUVEC wurden
dreimal innerhalb von zwei Tagen (im Abstand von mindestens 6 h) mit filtriertem
Überstand (Porengröße des Filters 0,8 µm) der virusproduzierenden
Verpackerzelllinie ΦNX ampho, die diesen Vektor mit oder ohne Transgen
exprimierten, in Anwesenheit von 5 µg/ml Polybrene infiziert. 6 h nach der dritten
Infektion wurde das Infektionsmedium durch Kulturmedium ersetzt und die Zellen
normal kultiviert. Zur Selektion infizierter Klone wurde 48 Stunden nach der letzten
Infektion 250 µg/ml Zeozin in das Kulturmedium gegeben. Die überlebenden Klone
wurden 3 Tage unter Selektion kultiviert, 1 Tag in Medium ohne
Selektionsantibiotikum gehalten und anschließend für verschiedene Untersuchungen
verwendet.
Für die retrovirale Infektion von HUVEC mit small hairpin RNA (shRNA) wurden
Doppelstrang-Oligonukleotide in den retroviralen Vektor pRetroSuper kloniert
(Abschnitt 3.11.7). Dieser Vektor und der leere Kontrollvektor wurden jeweils in die
Verpackerzelllinie FLYRD-18 transfiziert und deren Zellkulturüberstände zur Infektion
von HUVEC genutzt (siehe oben). Zur Selektion infizierter HUVEC wurde bei diesen
Ansätzen dem Kulturmedium für 3 Tage 1 µg/ml Puromycin zugesetzt.
Die Verpackerzelllinien wurden mittels Lipofectamine 2000, FuGENE 6 oder
Kalziumphosphat-Methode transfiziert und sowohl unselektioniert als auch stabil
transfiziert zur Gewinnung von Kulturüberstand verwendet.
3.2.2 DEAE-Dextran-Transfektion
Die nachfolgende Methode ist für HUVEC in 10 cm-Petrischalen beschrieben. Zu
einmal mit HEPES/PBS (1 mM) gewaschenen Zellen wurde eine Lösung aus 4 ml
HEPES/PBS (1 mM), 100 µl DEAE-Dextran-Lösung (10 mg/ml) und 4 µg zu
transfizierender DNA gegeben. Dieser Ansatz wurde für 30 min bei 37°C und
5 % CO 2 inkubiert. Anschließend wurden 6 ml M199, supplementiert mit 10 % FBS
und 0,15 mM Chloroquine, dazupipettiert und die Zellen für weitere 3 h inkubiert.
Danach wurde das Medium entfernt, 3 ml serumfreies M199 mit 10 % DMSO
zugegeben und die Schalen 2,5 min bei Raumtemperatur geschwenkt. Anschließend
31

wurde das Medium vollständig abgesaugt und die Zellen in normalem Kulturmedium
bis zur Weiterverwendung kultiviert.
3.2.3 Kalziumphosphat-Transfektion
Für die Kalziumphosphat-Transfektion von Zellen in einer 10 cm-Petrischale nach
einem modifizierten Protokoll nach Graham und van der Eb (Graham and van der
Eb, 1973) wurde folgendermaßen vorgegangen: Am Morgen der Transfektion wurde
das Kulturmedium durch 10 ml antibiotikafreies Medium ersetzt. Am Nachmittag
wurde zunächst das DNA-Präzipitat hergestellt. Dafür wurde in einem
Mikrozentrifugenröhrchen die DNA (10-12 µg) vorgelegt, das Volumen mit sterilem
dd H 2 O auf 450 µl aufgefüllt und 50 µl CaCl 2 -Lösung (2,5 M) dazugegeben. Nach
Vortexen wurden 500 µl 2 x HBS vorsichtig mit kreisenden Bewegungen vom Boden
des Röhrchens nach oben dazupipettiert und zur Vermischung noch einige
Luftblasen durch die Pipette gedrückt. Zur Bildung des Präzipitats wurde der Ansatz
15 min bei Raumtemperatur stehen gelassen und anschließend tropfenweise zu den
Zellen gegeben. Die Schale wurde dann vorsichtig geschwenkt und bei 37°C und
5 % CO 2 kultiviert. Nach 24 h erfolgte nach einmaligem Waschen mit PBS ein
Mediumwechsel.
3.2.4 Oligofectamine-Transfektion
Für die Transfektion von HUVEC und UTA6-Zellen mit chemisch hergestellten
small interfering RNA (siRNA)-Oligonukleotiden wurden verschiedene Transfektionsmethoden
getestet und optimiert. Verwendet wurden die Lipid-basierten
Transfektionsreagenzien Lipofectamine 2000, HiPerFect, Effectene, FuGENE 6,
PromoFectin-HUVEC und Oligofectamine, sowie die Elektroporation und die
Magnet-unterstützte Transfektion. Bei allen diesen Methoden wurde nach den
Angaben des Herstellers verfahren, es wurden jedoch bis auf eine Ausnahme keine
zufriedenstellenden Transfektionsraten in HUVEC erreicht. Als einziges
Transfektionsreagenz führte Oligofectamine zu einer guten Rate an transfizierten
siRNA-Oligonukleotiden.
Dazu wurden HUVEC am Tag nach der Aussaat in 6 Loch-Platten (100.000
HUVEC/Well) mit einer Mischung aus einer siRNA-Lösung (10 µl siRNA (20 µmol)
und 90 µl OptiMEM) und einer Oligofectamine-Lösung (6 µl Oligofectamine und
32

94 µl OptiMEM) versetzt. Beide Lösungen wurden bei Raumtemperatur zunächst 10
min einzeln, anschließend 30 min zusammengemischt stehen gelassen. Im Anschluß
an diese Inkubationszeiten wurden 800 µl OptiMEM dazugegeben. Nach
zweimaligem Waschen der Zellen mit OptiMEM wurde der siRNA-Oligofectamine-
Ansatz zu den Zellen gegeben. Die HUVEC wurden vier Stunden mit dieser
Mischung bei 37°C und 5 % CO 2 kultiviert, bevor die Mischung durch normales
Kulturmedium ersetzt wurde.
3.2.5 Weitere Transfektionsmethoden
Lipofectamine 2000 und FuGENE 6 wurden nach den Angaben der Hersteller für die
stabile Transfektion von retroviralen Vektoren in die Verpackerzelllinien ΦNX ampho
und FLYRD-18 verwendet.
3.3 Oligonukleotid-Mikroarray-Analyse
Für die vorliegende Arbeit wurden die Genexpressionsanalysen unter Verwendung
von Affymetrix GeneChips ® Human Genome U133A (Affymetrix, Santa Clara, USA)
durchgeführt. Diese Chips decken ungefähr 13.000 humane Transkripte ab, die
genaue Liste der enthaltenen Gene ist unter www.affymetrix.com einzusehen.
Ein Affymetrix GeneChip ® ist in kleine quadratische Flächen, sogenannte
Sondenzellen (probe cells oder features) unterteilt, die jeweils Millionen von gleichen
Sonden enthalten. Sonden sind 25 Basen lange, für ein Gen spezifische und zur
codierenden Region des Gens komplementäre Oligonukleotide. Zwei Sondenzellen
bilden ein Sondenpaar (probe pair). Es besteht jeweils aus einer perfect match-Zelle
(Sonde ist komplementär zur entsprechenden Sequenz des Gens) und einer
mismatch-Zelle (Sonde ist nicht vollständig komplementär zur entsprechenden
Sequenz des Gens, da hier ein Nukleotid ausgetauscht wurde). Die miss match-
Zellen dienen der Kontrolle auf nicht-spezifische Bindungen. Jedes Gen wird durch
bis zu 20 unterschiedliche Sondenpaare repräsentiert, die zusammen eine
Sondengruppe (probe set) bilden. Durch die mehrfache Vertretung eines Gens auf
einem Chip wird der Array weniger störanfällig (vgl. Abbildung 3.1).
33

Abbildung 3.1 Chipdesign eines Affymetrix GeneChips ® . Sondenpaare setzen sich aus zwei
einzelnen Sondenzellen, jeweils einer perfect match-Zelle und einer mismatch-Zelle, zusammen.
Verschiedene Sondenpaare, die das gleiche Gen repräsentieren, bilden Sondengruppen.
Der gesamte Human Genome U133A GeneChip ® von Affymetrix deckt etwa 13.000 Gene ab
(nach http://www.ohsu.edu/gmsr/amc/amc_technology.html).
Durchführung: Bei der Probenaufbereitung wurde aus den zu untersuchenden Zellen
mittels RNeasy Kit (Qiagen, Hilden) die mRNA gewonnen. Für eine Oligonukleotid-
Mikroarray-Analyse wurden jeweils 5 µg mRNA eingesetzt. Die mRNA wurde durch
reverse Transkriptase unter Verwendung eines Oligo(dT)-Primers in cDNA
umgeschrieben. Als nächstes diente diese cDNA als Template für eine in vitro-
Transkriptionsreaktion, bei der biotinylierte Nukleotide eingesetzt wurden und deren
Produkt amplifizierte, Biotin-markierte Antisense-cRNA war. Nach der
Fragmentierung dieser cRNA unter Verwendung von Mg 2+ und Hitze in Fragmente
von 25-200 Basen erfolgte die Hybridisierung auf den Chip durch eine 16-stündige
Inkubation bei 45°C. Die Färbung der auf die Sonden hybridisierten Fragmente
wurde mit einem biotin-bindenden Fluoreszenzfarbstoff (Phycoerythrin-gekoppeltes
Streptavidin) durchgeführt. Nach dem Waschen der Mikroarrays wurden die
Fluoreszenzsignale anschließend mittels HP G2500A Gene Array Scanner
(Affymetrix, Santa Clara, USA) detektiert.
34

Abbildung 3.2 Darstellung der Oligonukleotid-Mikroarray-Analyse. Probenaufarbeitung und
Durchführung des Mikroarray-Chips (nach http://www.albany.edu/genomics/genechip-expression.html)
Auswertung: Zur Analyse der erhaltenen Signale wurden die Daten mit Hilfe der
MicroArray Suite (MAS) Software 5.0 (Affymetrix) wie beschrieben ausgewertet
(Viemann et al., 2004). Zunächst wurden Hintergrund-berichtigte Rohintensitäten
berechnet, die unspezifische Bindungen berücksichtigten, indem Sondenpaare mit
nicht signifikanten Unterschieden zwischen perfect match (PM) und mismatch (MM)
Proben ausgeschlossen wurden. Für jede Sondengruppe wurden dann einzelne
Rohwerte aus dem Mittel der Quotienten aus PM/MM ihrer Sondenpaare berechnet.
Die „fold-changes“ (log ratio changes) und „change p values“ wurden für jedes
Experiment basierend auf einem „Signed Rank Test“ ermittelt. Als signifikant reguliert
wurden nur solche Gene betrachtet, die Veränderungen mit p ≤ 0,05 in mindestens
3 von 4 Versuchen aufwiesen. Der „log ratio change“ für jedes einzelne Gen wurde
35

erechnet als Mittelwert der „log ratio changes“ aller Experimente mit signifikanten
p-Wert-Veränderungen. Es wurden schließlich nur diejenigen Gene mit einem
mittleren „log ratio change“ von mindestens 2,5 oder -2,5 berücksichtigt.
Die Mikroarray-Analysen sowie die quantitativen real time RT-PCR-Untersuchungen
wurden in Kooperation mit Herrn Prof. Dr. J. Roth und Frau Dr. D. Viemann vom
Institut für Experimentelle Dermatologie der Universität Münster durchgeführt.
3.4 Quantitative real time RT-PCR
Für die quantitative real time RT-PCR wurde jede RNA-Probe im Duplett untersucht.
Zur Konfirmation der Mikroarray-Daten wurden ausgewählte Gene aus demselben
Probenmaterial herangezogen. cDNA wurde ausgehend von 4 µg Gesamt-RNA mit
Hilfe der SuperScript II RNase H reverse transcriptase (Invitrogen, Karlsruhe)
synthetisiert. Für das Primerdesign wurde die Primer Express Software (Applied
Biosystems, Foster City, USA) benutzt. Folgende Primer wurden von MWG Biotech
(Ebersberg) bezogen und verwendet:
Primer für vorwärts (5‘→3‘) rückwärts (5‘→3‘)
CCL2 (MCP-1) TCGCCTCCAGCATGAAAGTC TTGCATCTGGCTGAGCGAG
CCL20 (MIP-3α) TTCTGGAATGGAATTGGACATAGC ACCCTCCATGATGTGCAAGTG
CXCL1 (Groα) CATCCAAAGTGTGAACGTGAAGTC TTCCGCCCATTCTTGAGTGT
CXCL2 (Groβ) ACATCCAAAGTGTGAAGGTGAAGTC AAGCTTTCTGCCCATTCTTGAGT
CXCL3 (Groγ) AGCGTATCATTGACACTTCCTGC TCCCTTTCCAGCTGTCCCTAG
CXCL5 (ENA78) GATCCAGAAGCCCCTTTTCTAAAG AGAGACCTCCAGAAAACTTCTCTGC
CXCL6 (GCP2) CGATTGGTAAACTGCAGGTGTTC TCCGGGTCCAGACAAACTTG
CXCL8 (IL-8) ACCACCGGAAGGAACCATTC TTCACACAGAGCTGCAGAAATCA
CX3CL1
(Fractalkine)
ACATCACGTGCAGCAAGATGAC
GATGATTGCGCGTTTGCC
ICAM-1 ACCTCCCCACCCACATACATTT GGCATAGCTTGGGCATATTCC
36

VCAM-1 ACATGGAATTCGAACCCAAACA GGCTGACCAAGACGGTTGTATC
coxsackie virus
and adenovirus
receptor (CAR)
GCTAAGGTAGCTGCCCCTAATCTAA
G
CGGAGAGCACAGATGAGACATATG
glyceraldehyde
phosphate
dehydrogenase
(GAPDH)
AGGTGGTCTCCTCTGACTTCAACA
AGCTTGACAAAGTGGTCGTTGAG
Für die Durchführung der quantitativen real time RT-PCR wurden ein Quanti-Tect
SYBR Green PCR Kit (Qiagen, Hilden) (Rajeevan et al., 2001) und das
ABI PRISM 7900 (Applied Biosystems, Foster City, USA) eingesetzt. Die
Genexpression wurde durch Bezug auf das konstant exprimierte Housekeeping-Gen
Glyceraldehydphosphatdehydrogenase (GAPDH) normiert. Die relative Expression
der einzelnen Gene wurde nach der comparative threshold cycle (CT)-Methode
berechnet (Liu and Saint, 2002).
3.5 Lyse von Zellen zur Proteinanalyse
Zur Lyse von Zellen wurden diese nach zweimaligem Waschen mit eiskaltem PBS in
der Kulturschale für 30 min bei 4°C mit ELB-Puffer (für Western Blot und ELISA) oder
TLB-Puffer (für Kinase-Assays) inkubiert. Unter diesen Bedingungen wurden die
Endothelzellen lysiert, Candida-Hyphen jedoch weitestgehend nicht zerstört. Nach
Ablauf der Inkubationszeit wurden die Zelllysate mittels Zellschaber von der
Kulturschale gekratzt und in gekühlte Mikrozentrifugenröhrchen überführt. Die
unlöslichen Zellbestandteile wurden durch Zentrifugation bei 14.000 rpm und 4°C
abgetrennt. Der Proteingehalt wurde standardmäßig unter Verwendung des Quick
Start Bradford Dye Reagent (BioRad, München) nach Herstellerangaben bestimmt.
Für Western Blot bestimmte Zelllysate wurden in einem Verhältnis von 3:1 mit
4 x SDS-Probenpuffer gemischt, 5 min bei 95°C denaturiert und bis zur Verwendung
bei -20°C aufbewahrt. Für ELISA oder Immunkomplex-Kinaseassay bestimmte
Lysate wurden bis zur weiteren Verwendung bei -80°C gelagert.
37

3.6 Western Blot
3.6.1 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE)
Zur Analyse von Proteinen wurde das Proteinlysat zunächst durch eindimensionale
Gelelektrophorese unter denaturierenden Bedingungen fraktioniert, wobei die
einzelnen Proteine entsprechend ihrem Molekulargewicht aufgetrennt wurden. Die
dazu benutzten SDS-Polyacrylamidgele setzten sich zu ca. 1/3 aus einem 3 %igen
Sammelgel und ca. 2/3 aus einem Trenngel mit abweichendem pH-Wert zusammen.
Der Acrylamidgehalt des Trenngels (8 % bis 12 %) richtete sich dabei nach der
Größe der zu untersuchenden Proteine. Die nachfolgende Tabelle enthält die
Pipettierschemata, nach denen die einzelnen Gele gegossen wurden, sowie die
Auftrennungsoptima der einzelnen Trenngele. Die Zusammensetzung der Vormixe
für Trenngel und Sammelgel sind in Abschnitt 2.2.1 beschrieben.
Konzentration des Sammelbzw.
Trenngels
3 % 8 % 10 % 12 %
30 % Acrylamid 1 ml 2.66 ml 3.33 ml 4 ml
Trenngel-Vormix - 5 ml 5 ml 5 ml
Sammelgel-Vormix 5 ml - - -
dd H2O 4 ml 2.33 ml 1.66 ml 1 ml
Ammoniumpersulfat (APS) 150 µl 100 µl 100 µl 100 µl
Temed 10 µl 4 µl 4 µl 4 µl
Auftrennungsoptimum - > 90 kDa 40-90 kDa < 40 kDa
Das polymerisierte Gel wurde in eine Vertikalapparatur eingesetzt und das Reservoir
mit Laufpuffer (Abschnitt 2.2.1) aufgefüllt. Anschließend wurden die mit SDS-
Probenpuffer versetzten Proben auf das Sammelgel gegeben. Pro Geltasche wurden
dabei bis zu 30 µg Protein geladen. Die Proteingemische wurden dann bei einer
konstanten Stromstärke von 35-50 mA aufgetrennt.
38

3.6.2 Proteintransfer
Für den immunologischen Nachweis der in der SDS-PAGE aufgetrennten Proteine
wurden diese mittels einer Blotting-Apparatur im Nass-Blot-Verfahren je nach
Empfehlung der Antikörperhersteller auf eine Nitrozellulosemembran (0,2 µm,
Schleicher und Schüll, Dassel) bzw. eine methanolaktivierte Polyvinyldifluorid-
Membran (Immobilon ® , Millipore, Schwalbach) übertragen. Dafür wurde für 90 min
eine Stromstärke von 400 mA an die Blotting-Apparatur angelegt.
3.6.3 Immundetektion
Zur Absättigung unspezifischer Bindungen wurde die Membran nach dem
Blotvorgang für 1 h bei Raumtemperatur (RT) in Milchpulver-Blockingpuffer
(Abschnitt 2.2.1) geschwenkt. Zum Nachweis einzelner Proteine wurde die Membran
dann mit dem entsprechenden Primärantikörper, verdünnt in frischem Milchpulver-
Blockingpuffer, bei 4°C über Nacht inkubiert. Nach viermaligem Waschen mit TBST
(je 7 min) erfolgte die Inkubation mit dem jeweiligen Meerrettich-Peroxidase (horseradish
peroxidase, HRP)-gekoppelten Sekundärantikörper für 1 h bei RT. Die
Membran wurde zur Entfernung von unspezifisch gebundenem Sekundärantikörper
erneut viermal 7 min lang mit TBST gewaschen. Der gebundene HRP-gekoppelte
Sekundärantikörper wurde nach dem Prinzip der verstärkten Chemolumineszenz
(enhanced chemoluminescence, ECL) mit Reagenzien (ECL Western Blotting
Detection Reagents) und Röntgenfilmen der Firma Amersham (Buckinghamshire,
GB) dem Herstellerprotokoll entsprechend nachgewiesen. Alternativ wurde auch
selbst hergestelltes ECL-Reagenz verwendet (0,1 M Tris-HCl (pH 8,5),
2,5 mM Luminol, 0,4 mM para-Hydroxycoumarinsäure und 0,02 % H 2 O 2 in dd H 2 O).
3.6.4 Stripping
Um einen Blot ein zweites Mal für eine Antikörper-Inkubation zu verwenden, wurden
die zuvor gebundenen Antikörperkomplexe durch 30-minütige Inkubation bei 50°C in
Strippingpuffer (Abschnitt 2.2.1) entfernt. Anschließend wurde die Membran erneut
mit Blockingpuffer und Antikörper-Verdünnungen wie in Abschnitt 3.6.3 beschrieben
inkubiert.
39

3.7 Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA)
Zum Nachweis von CXCL8 im Zellkulturüberstand verschiedener Zellen wurden
enzymgekoppelte Immunnachweise durchgeführt. Dafür wurde der
Zellkulturüberstand nach Ablauf der Stimulationszeit in ein Mikrozentrifugenröhrchen
überführt, zur Abtrennung von eventuell enthaltenen Zellen und Zellbestandteilen bei
5000 rpm zentrifugiert und bis zur weiteren Verwendung bei -20°C gelagert. Die
Konzentration von CXCL8 in diesen Proben wurde mit dem kommerziell erhältlichen
BD OptEIA human IL-8 ELISA Set (BD Pharmingen, Franklin Lakes, USA) nach den
Angaben des Herstellers gemessen. Dabei wurde CXCL8 von spezifischen
Antikörpern auf der Oberfläche einer Mikrotiterplatte gebunden und durch einen
Detektionskomplex nachgewiesen. Der Komplex wurde mit Hilfe einer Farbreaktion
am ELISA-Reader quantitativ über den Vergleich mit einer internen
Standardkonzentrationsreihe ausgewertet. Das gleiche Prinzip wurde zur
Quantifizierung von CCL20 (MIP-3α) in Totalzelllysaten mittels Duo Set human MIP-
3α ELISA Development System (R&D, Minneapolis, USA) angewendet. Die durch
ELISA erhaltenen Werte wurden auf den Proteingehalt der Proben normiert.
Alle Proben wurden immer mindestens in Doppelbestimmungen analysiert und die
erhaltenen Werte auf unstimulierte Kontrollen bezogen dargestellt.
3.8 Protein-Aktivierungsassay (Immunkomplex-Kinaseassay)
Prinzip: Kinasen übertragen γ-Phosphatreste von Adenosintriphosphat (ATP) auf
Zielmoleküle. Die enzymatische Aktivität von Kinasen lässt sich messen, indem man
die Übertragung von radioaktiv markiertem [γ 32 -P-] ATP auf spezifische Substrate
quantitativ bestimmt. In der Praxis wird die zu untersuchende Kinase zunächst mit
spezifischen Antikörpern aus den Zelllysaten immunpräzipitiert. Nach der
Präzipitation wird die Kinase dann in Anwesenheit von radioaktivem [γ 32 -P-] ATP mit
einem spezifischen Substrat inkubiert und die Einbaurate von radioaktivem 32 P in das
Substratmolekül durch Autoradiographie gemessen.
Durchführung: HUVEC wurden bis zum Erreichen eines Konfluenzgrades von
70-80 % kultiviert. Dann wurden sie wie in Abschnitt 3.1.4 beschrieben mit
C. albicans bzw. TNFα für die angegebenen Zeitperioden stimuliert. Anschließend
40

wurden die stimulierten Zellen mit TLB-Puffer lysiert und die zu untersuchenden
Kinasen nach Messung der Proteinkonzentration mit spezifischen Antikörpern aus
den Lysaten immunpräzipitiert. Zur Immunpräzipitation wurden 500 µg Totallysat für
2 h bei 4°C mit 25 µl Protein A-Agarose (Roche, Grenzach) und einem spezifischen
Kaninchenantiserum gegen p38 (C-20) bzw. IKK2 (H-470, Santa Cruz Biotechnology,
Santa Cruz, USA) inkubiert. Die immunpräzipitierten Kinasen wurden vor der
Kinasereaktion je zweimal mit TLB-Puffer mit erhöhtem Kochsalzgehalt (500mM) und
mit Kinasepuffer (Abschnitt 2.2.2) gewaschen. Anschließend wurden die Proben 15
min bei 30°C in 20 µl Kinasepuffer mit 5 µCi radioaktivem [γ 32 -P-] ATP, 100 µM
nichtradioaktivem ATP und den jeweiligen Kinasesubstraten (GST-IκBα als Substrat
für IKK2 und 3pK bzw. ATF-2 als Substrat für p38) inkubiert. Die
Phosphorylierungsreaktionen wurden dann durch Zusatz von 4 x SDS-Probenpuffer
und kurzem Aufkochen bei 95°C gestoppt. Die einzelnen Proben wurden
anschließend auf ein Polyacrylamidgel geladen und die Proteine nach einer
Gelelektrophorese auf Nitrozellulose geblottet. Die Phosphorylierungsrate wurde
routinemäßig mit Hilfe eines Phosphoimagers quantifiziert und mittels
Autoradiographie auf Röntgenfilmen sichtbar gemacht. In allen Fällen wurden
Western Blots durchgeführt, um die Präzipitation gleicher Mengen von p38 bzw. IKK2
zu gewährleisten.
Die Durchführung der Immunkomplex-Kinaseassays erfolgte durch Herrn
Prof. Dr. S. Ludwig vom Institut für Molekulare Virologie der Universität Münster.
3.9 Promoter-Reporter-Assay (Luciferase-Assay)
Zur Bestimmung der Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF-κB wurden HUVEC
oder HEK293-Zellen in 10 cm-Schalen mittels DEAE-Dextran-Methode bzw.
Kalziumphosphat-Methode (Abschnitte 3.2.2 und 3.2.3) transfiziert. Die
transfizierte DNA setzte sich dabei aus einem 6xκB-Promoter-abhängigen
Firefly-Luciferasekonstrukt und aus einem Ubiquitin-Promoter-abhängigen
Renilla-Luciferasekonstrukt im Verhältnis 30:1 zusammen. 24 h nach Transfektion
wurden die Zellen abgelöst, gezählt und auf 96-Loch-Flachboden-Mikrotiterplatten
neu ausgesät (20.000 HUVEC/Well bzw. 30.000 HEK293/Well). Weitere 24 h später
wurden die Zellen für acht Stunden stimuliert, anschließend erfolgte die Bestimmung
41

der Luciferaseaktivität gemäß den Angaben des Herstellers unter Verwendung des
Dual-Glo Luciferase Assay Systems von Promega (Madison, USA). Aus den bei der
luminometrischen Messung der Luciferaseaktivitäten erhaltenen Werten wurde
jeweils der Quotient 6xκB-Firefly-Luciferase/Ubiquitin-Renilla-Luciferase berechnet.
Dieser Quotient stellt den normierten Wert für die NF-κB-Aktivierung in den Zellen
des jeweiligen 96er-Wells dar. Alle Werte wurden mindestens im Triplett ermittelt.
3.10 Durchflußzytometrie
Zur durchflußzytometrischen Analyse von Toll-like Rezeptoren auf HUVEC oder
HEK 293-Zellen wurden die Zellen mit 1 x Trypsin/EDTA von der Kulturplatte gelöst,
gewaschen und für 30 min mit 1 % BSA in PBS geblockt. Anschließend wurden sie
zunächst mit den jeweiligen Primärantikörpern bzw. der IgG-Isotypkontrolle inkubiert,
danach mit einem Cy5-gekoppelten Sekundärantikörper (jeweils 45 min bei RT). Alle
Antikörper wurden in 1 % BSA in PBS verdünnt. Zwischen den Färbeschritten
wurden die Zellen dreimal mit 1 % BSA in PBS gewaschen, nach der zweiten
Färbung dreimal mit PBS. Für die danach erfolgende FACS-Analyse wurden die
Zellen in einem geeigneten Volumen an PBS resuspendiert. Die Fluoreszenz des
Cy5-konjugierten Farbstoffs wurde im vierten Kanal (FL-4) detektiert.
Für die Färbung von ICAM-1 auf stimulierten HUVEC wurde eine 3-Schritt-Methode
angewendet. Dafür wurden die Zellen zunächst 30 min auf Eis mit 1 % BSA in PBS
geblockt und anschließend mit Primärantikörper gegen ICAM-1 bzw. mit IgG-
Isotypkontrolle inkubiert (45 min auf Eis). Der verwendete Sekundärantikörper war
bei dieser Methode Biotin-gekoppelt, für die Farbreaktion wurde dann Streptavidin-
PE-Cy5 eingesetzt, das im dritten Kanal (FL-3) gemessen wurde. Zwischen den
einzelnen Färbeschritten wurden die Zellen je dreimal mit einer Lösung von 1 % BSA
in PBS gewaschen. Alle Färbeschritte dauerten 45 min und wurden auf Eis
durchgeführt. Nach der Farbreaktion wurden die Zellen in PBS gewaschen und für
die folgende FACS-Analyse in einem adäquaten Volumen an PBS resuspendiert.
Zellen, die durch Transfektion oder retrovirale Infektion das grün fluoreszierende
Protein GFP (green fluorescent protein) exprimierten, wurden ohne vorherige
Färbung im ersten Kanal (FL-1) des FACS-Gerätes gegen nichtfluoreszierende
42

Kontrollen gemessen. Dafür wurden Zellen der Sicherheitsstufe 2 zuvor mit 4 %
Paraformaldehyd (PFA) fixiert, S1-Zellen wurden unfixiert verwendet.
Die Daten der hier beschriebenen durchflußzytometrischen Untersuchungen wurden
mit Hilfe der Cellquest Research Software (Becton Dickinson, Franklin Lakes, USA)
als Histogramm-Plots oder Dot-Plots dargestellt.
3.11 Molekularbiologische Methoden
Allgemeine molekularbiologische Standardmethoden wurden nach Sambrook et al.
(Sambrook, 1989) durchgeführt.
3.11.1 Transformation von Plasmid-DNA in Bakterien
Die Transformation von Plasmid-DNA in kompetente DH5α-Bakterien erfolgte mittels
Hitzeschock nach Sambrook et al. (Sambrook, 1989). Die transformierten Bakterien
wurden zur Selektion plasmidtragender Kolonien mit Ampicillin-Resistenz auf Luria-
Bertani (LB)-Agarplatten mit 100 µg/ml Ampicillin ausplattiert. Von Einzelkolonien
wurden Übernachtkulturen in LB-Medium mit 50 µg/ml Ampicillin angesetzt.
3.11.2 Mini-, Midi- und Maxipräparation von Plasmid-DNA
Alle Präparationen von Plasmid-DNA aus den Übernachtkulturen wurden nach dem
Protokoll der Firma Qiagen (Hilden) unter Verwendung der Qiagen Plasmid Kits
durch Reinigung über Anionenaustauschersäulen durchgeführt. Alternativ wurde für
Minipräparationen auch die Methode der alkalischen Lyse von Birnboim und Doly
(Birnboim and Doly, 1979) angewendet. Am Ende der Aufreinigungsschritte wurde
die gefällte DNA je nach Größe des Pellets in einem adäquaten Volumen an dd H 2 O
aufgenommen und bei Bedarf photometrisch vermessen. Die Lagerung der
DNA-Lösungen erfolgte bei -20°C.
3.11.3 Sequenzierung von DNA
Sequenzierungen wurden unter Verwendung des Abi Prism BigDye Terminator Cycle
Sequencing Kit von Applied Biosystems (Foster City, USA) nach der Methode von
Sanger (Sanger et al., 1977) durchgeführt. Statt radioaktiv markierter
Didesoxynukleosidtriphosphate (ddNTPs) wurden jedoch unterschiedlich
fluoreszierende ddNTPs eingesetzt. Als Template für die Sequenzierungs-PCR
wurde Mini-, Midi- oder Maxipräparations-DNA verwendet. Die eingesetzte DNA-
43

Menge betrug 0,5 µg bis 1 µg, die Primermenge 10 pmol. Von allen anderen
Reagenzien wurden die Mengen eingesetzt, die in der Anleitung des Herstellers
empfohlen werden. Die Durchführung der Sequenzierungs-PCR erfolgte nach dem
Herstellerprotokoll. Aus den durch die PCR erhaltenen Proben wurden mit Hilfe des
DyeEx 2.0 Spin Kits von Qiagen (Hilden) überschüssige, farbig markierte ddNTPs
entfernt, die die darauf folgende Sequenzierung im DNA Sequenzer stören könnten.
3.11.4 Restriktionsverdau von Plasmid-DNA und Auftrennung von DNA-
Fragmenten durch horizontale Agarose-Gelelektrophorese
Zur Kontrolle der erfolgreichen Präparation von Plasmid-DNA wurden 5 µl der DNA-
Lösung zusammen mit je 0.5 µl von zwei unterschiedlichen Restriktionsenzymen in
5 µl passender 5 x Pufferlösung und 14 µl ddH 2 O für 1-2 h bei 37°C inkubiert. Dabei
sollten die Enzyme den Plasmidvektor bzw. das Insert so schneiden, dass ein
charakteristisches Fragment zur Identifizierung der DNA entsteht.
Je nach Länge der erwarteten Fragmente wurden Gele mit einem Agarosegehalt von
0,8 % bis 1,5 % hergestellt. Die Agarose wurde durch kurzes Aufkochen in einem
entsprechenden Volumen 1 x TAE-Puffer vollständig gelöst. Nach Abkühlen der
Lösung auf 50-60°C wurde die Lösung mit Ethidiumbromid (ca. 3 µl/100ml) versetzt
und in eine Gelkammer mit Kamm für die Auftragtaschen gegossen. Das erstarrte
Gel wurde in der Elektrophoresekammer vollständig mit TAE-Puffer bedeckt. Die
aufzutragenden Proben und ein DNA-Molekulargewichtsmarker wurden mit einem
bromphenolblauhaltigen Probenpuffer (Abschnitt 2.2.1) versetzt und in die
Geltaschen überführt. Nach der elektrophoretischen Auftrennung im Agarosegel
wurden die DNA-Fragmente mit UV-Licht (λ=254 nm) anhand des fluoreszierenden,
interkalierten Ethidiumbromids detektiert und bei Bedarf mittels Skalpell
herausgeschnitten.
3.11.5 DNA-Elution aus Agarosegelen
DNA wurde aus Agarosegelen nach dem Protokoll der Firma Qiagen (Hilden) mit
Anionenaustauschersäulen und Lösungen des QIAquick Gel Extraction Kits eluiert.
44

3.11.6 Konzentrationsbestimmung von DNA-Lösungen
Die Bestimmung der Konzentration verdünnter DNA-Lösungen erfolgte
spektralphotometrisch durch Messung der Absorption bei 260 nm. Dabei entspricht
eine optische Dichte (OD) von 1 bei doppelsträngiger DNA 50 µg/ml, so dass sich
unter Einbeziehung des Verdünnungsfaktors aus der gemessenen OD die
Konzentration der DNA-Lösung errechnen lässt.
3.11.7 Klonierung von Doppelstrang-DNA-Oligos in pRetroSuper
Prinzip: Für das gezielte Ausschalten einzelner Gene in den Zielzellen wurde die
Methode der RNA-Interferenz genutzt. Das Prinzip dieser Methode basiert auf der
Beobachtung, dass kurze Doppelstrang-RNA-Moleküle (small interfering RNA,
siRNA) zur Degradation einer komplementären mRNA führen können und somit die
Expression des von ihr kodierten Proteins verhindern. Die siRNA kann chemisch
synthetisiert und direkt in die Zielzellen transfiziert werden oder durch ein
Vektorplasmid in die Zellen transfiziert oder auch retroviral infiziert werden. In diesen
Fällen wird die DNA-Information auf dem Plasmid in RNA-Fragmente (sogenannte
small hairpin RNA, shRNA) übersetzt, die dann in der Zelle zu kurzen siRNA-
Molekülen prozessiert wird. Hier wurde ein System verwendet, das auf einem
retroviralen Vektorplasmid basierte und die stabile Expression von shRNA-Molekülen
erlaubte (Abbildung 3.3 (A)).
Dazu wurde ein dsDNA-Oligonukleotid, das für eine spezifische shRNA kodierte,
mittels eines retroviralen Vektorplasmids (pRetroSuper, pRS) in die Targetzellen
eingebracht. Das Vektorplasmid pRS enthielt zudem eine
RNA-Polymerase III-Promoter-Kassette, die innerhalb der Zelle zum Ablesen der
DNA-Matrize und zur Polymerisation von shRNA führte. Diese shRNA-Moleküle
werden intrazellulär durch das dsRNA-prozessierende Enzym Dicer zu kleinen
doppelsträngigen RNA-Stücken, den siRNAs, geschnitten. Diese sind in der Lage,
sequenzspezifisches gene silencing zu induzieren. Dazu wird die siRNA in einem
RISC-Komplex (RNA-induced silencing complex) integriert, der mit der
komplementären mRNA-Targetsequenz interagiert und zu deren Degradation führt
(Abbildung 3.3).
45

Abbildung 3.3 Übersicht zur RNA Interferenz. Verschiedene Möglichkeiten, small interfering RNA
(siRNA) in die Zielzellen einzubringen: direkte Transfektion von chemisch synthetisierter siRNA (1),
Transfektion (2) oder Infektion (3) von Plasmiden, die für small hairpin RNA (shRNA) kodieren; shRNA
wird wiederum zu kurzen siRNA-Molekülen prozessiert (A). shRNA wird im Zytoplasma durch das
Enzym Dicer zu siRNA geschnitten, deren Antisense-Strang im RISC-Komplex (RNA-induced
silencing complex) mit komplementärer Ziel-mRNA interagiert und zu deren Degradation führt (B)
(in Anlehnung an (Medema, 2004) und (Brummelkamp and Bernards, 2003)).
46

Klonierung: Für die vorliegende Arbeit wurden 2 bzw. 5 shRNA-Vektorplasmid-
Konstrukte gegen verschiedene Zielsequenzen in der mRNA von MyD88 oder IRAK1
kloniert und in transienten Transfektionsversuchen auf einen Knock-down des
Zielproteins untersucht. Keine der verwendeten Zielsequenzen zeigte Homologien zu
anderen publizierten cDNAs.
Zur Klonierung der Konstrukte wurden je zwei komplementäre Oligonukleotide
(64-mere) zu einem doppelsträngigen Fragment mit jeweils einem 5‘-Überhang
kondensiert. Die Überhänge waren so gewählt, dass sie sich in eine Bgl II- bzw. eine
Hind III-Schnittstelle einpassen konnten. Alle Oligonukleotide wurden mit Hilfe der
iRNAi 2.0 Software (NKI, Nederlands Kanker Instituut, Amsterdam, NL) entworfen
und von Sigma Genosys synthetisiert. Die Loopsequenz basierte auf Angaben von
Brummelkamp et al. (Brummelkamp et al., 2002). Die Oligonukleotide waren wie folgt
aufgebaut:
Vorwärtsprimer:
5‘- GATCCC (Präfix) - 19 nt (Sense-Targetsequenz) - TTCAAGAGA (Loopsequenz) -
19 nt (Antisense-Targetsequenz) - TTTTTGGAAAA (Suffix) -3‘
Rückwärtsprimer:
5‘- AGCTTTTCCAAAAA (Präfix) – 19 nt (Sense-Targetsequenz) - TCTCTTGAA
(Loopsequenz) - 19 nt (Antisense-Targetsequenz) – GGG (Suffix) -3‘.
Beide Oligonukleotide wurden jeweils in H 2 O zu 1 mM gelöst. Von beiden Lösungen
wurde je 1 µl in ein Mikrozentifugenröhrchen vorgelegt. Es wurden dann 48 µl eines
„Annealing Buffers“ (10 mM Kaliumacetat, 30 mM HEPES-KOH (pH 7,4), 2 mM
Magnesiumacetat) zugegeben und alles zusammen in einem Heizblock für 4 min auf
95°C erhitzt. Danach wurde der Heizblock ausgeschaltet und die Probe darin
langsam auf Raumtemperatur abgekühlt. Während dieser Zeit hybridisierten die
komplementären Oligonukleotide zu einem dsDNA-Fragment. Dieses Fragment
wurde dann in den Bgl II- und Hind III-verdauten Vektor pRetroSuper kloniert
(Brummelkamp et al., 2002). Zum Verdau des Vektors wurde folgender Ansatz
pipettiert und für 2 h bei 37°C inkubiert: 1 µl Bgl II, 1 µl Hind III, 5 µl Tango-Puffer,
5 µg Vektor pRS (1 µg/µl) und 13 µl H 2 O. Anschließend wurde der verdaute Vektor
über eine horizontale 1 %ige-Agarose-Gelelektrophorese aufgereinigt und mittels
47

QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, Hilden) aus dem Gel eluiert. Die hybridisierten
dsDNA-Fragmente wurden dann in den geschnittenen Vektor pRS ligiert. Dafür
wurde der folgende Ligationsansatz vorbereitet: 2 µl einer 1:5-Verdünnung des
„Annealing“-Ansatz der Oligonukleotide, 1 µl verdauter Vektor (entsprach ca. 50-100
ng), 1 µl Ligasepuffer, 1 µl Ligase, 5 µl H 2 O. Die Ligation erfolgte über Nacht bei
16°C. Aus diesem Ansatz wurden 5 µl verwendet, um das ligierte Konstrukt in Hitzekompetente
Bakterien zu transformieren. Die transformierten Bakterien wurden auf
eine LB-Agarplatte mit 100 µg/ml Ampicillin ausgestrichen und über Nacht kultiviert,
die gewachsenen Kolonien wurden gepickt und für Minipräparationen vermehrt. Die
aus den Minipräparationen erhaltene DNA wurde zur Kontrolle der erfolgreichen
Ligation mit EcoR I und Xho I testverdaut und mittels Gelelektrophorese untersucht.
Mögliche positive Klone wurden sequenziert und die Plasmid-DNA bei korrekter
Sequenz mittels Midi- oder Maxipräparation vermehrt.
Das erhaltene Konstrukt wurde dann für gene silencing-Versuche in UTA6-Zellen
transfiziert. Die Zellen wurden für 24 h mit Puromycin gepulst, 72-96 h nach
Transfektion lysiert und im Western Blot auf ihren Gehalt des Targetproteins
untersucht.
Üblicherweise führt nur ein geringer Anteil von shRNAs zu einem zufriedenstellenden
Knock-down. Ein überzeugendes Ergebnis gelang hier mit einer shRNA gegen
IRAK1 und war gegen die folgende Zielsequenz von IRAK1 gerichtet:
5‘-AGCACAGGCTTCACAGTGATTT-3‘. Nur dieses Konstrukt (pRS-IRAK1) wurde für
weiterführende Versuche verwendet, indem es in die retrovirale Verpackerzelllinie
FLYRD-18 transfiziert wurde, mit deren virushaltigem Überstand dann HUVEC
infiziert wurden. Als Kontrollen wurden parallel dazu der leere Vektor pRetroSuper
(pRS) bzw. pRetroSuper mit einem Nonsense-Oligonukleotid (pRS scrambled)
verwendet.
48

4 Ergebnisse
4.1 Etablierung eines in vitro-Modellsystems für Stimulationsstudien
Der Eintritt von Candida albicans in die Blutbahn kann zu einer schwerwiegenden
Sepsis und zur Invasion des Pilzes in tiefere Gewebe führen. Dabei stellen die
Endothelzellen der Blutgefäße die erste Kontaktstelle zwischen dem Pathogen und
dem Wirtsorganismus dar.
Die Abwehrmechanismen primärer humaner Endothelzellen gegen C. albicans und
ihre Rolle bei der lebensbedrohlichen Candida-Sepsis sollten im Rahmen dieser
Arbeit untersucht werden, daher galt es zunächst, ein geeignetes in vitro-System zur
experimentellen Infektion von HUVEC mit C. albicans zu etablieren. Eine besondere
Herausforderung bestand darin, in einem in vitro-Modell mit zwei unterschiedlichen
lebenden Organismen Versuchsparameter festzulegen und Bedingungen zu
schaffen, unter denen es zu einer reproduzierbaren Interaktion der beiden
Komponenten kam. Dies wurde gewährleistet, indem verschiedene Faktoren variiert
und das Maß der Aktivierung der HUVEC durch C. albicans bestimmt wurde. Da in
Endothelzellen und in anderen Zelltypen gezeigt wurde, dass Candida die
Expression des Chemokins CXCL8 (IL-8) induziert (Castro et al., 1996; Filler et al.,
1996; Schaller et al., 2002), wurde als Read-out in dieser Testphase die
Konzentration von CXCL8 im Überstand der Co-Kultur mittels ELISA gemessen. Als
weiterer messbarer Faktor wurde das Chemokin CCL20 untersucht, das ebenso wie
CXCL8 ein bekanntes Zielgen des NF-κB-Signalwegs ist. Die Konzentration von
CCL20 im Totalzelllysat der mit Candida stimulierten HUVEC wurde ebenfalls mittels
ELISA gemessen.
49

4.1.1 Co-Kultur von HUVEC und C. albicans
Unter den Bedingungen der Co-Kultur von HUVEC und C. albicans in
Endothelzellmedium kam es durch Aussprossen der Blastosporen zur Ausbildung
von Hyphen und deren starker Vermehrung (Abbildung 4.1). Die stark
lichtbrechenden Hyphen machten es ab ca. 360 min Inkubationsdauer schwierig, die
unter dem Candida-Myzel liegenden HUVEC im Lichtmikroskop zu erkennen.
Abbildung 4.1 Veränderung der Wachstumsform von Candida albicans von der Hefe- zur
Hyphenform während der Co-Kultur mit HUVEC. Plattierte HUVEC wurden zusammen mit
C. albicans unter standardisierten Zellkulturbedingungen inkubiert. Zu den angegebenen Zeitpunkten
wurden Bilder der Co-Kultur in einer 40-fachen Vergrößerung mit dem Lichtmikroskop aufgenommen.
4.1.2 Die C. albicans-induzierte Expression von CXCL8 und CCL20 ist
dosisabhängig
Für alle folgenden Versuche war es wichtig herauszufinden, bei welchem
Infektionsverhältnis von Candida-Hefezellen zu HUVEC (multiplicity of infection, MOI)
eine ausreichend starke Stimulation der HUVEC bei minimaler Zelltodinduktion
stattfindet. Für diese Untersuchung wurden HUVEC in verschiedenen Verhältnissen
mit C. albicans infiziert. Die Beurteilung der Stimulation erfolgte nach acht Stunden
Co-Kultur, wobei jeweils die Proteinmengen von CXCL8 im Kulturüberstand
(Abbildung 4.2 (A)) und von CCL20, einem weiteren durch C. albicans induzierten
Chemokin, im Totalzelllysat (Abbildung 4.2 (B)) mittels ELISA bestimmt wurden.
Darüber hinaus wurde der CXCL8-Gehalt im Totalzelllysat auch mittels Western Blot-
Analyse untersucht (Abbildung 4.2 (C)).
Für die Expression beider Chemokine konnte eine direkte Abhängigkeit vom
Ausgangsverhältnis Candida/HUVEC festgestellt werden. Allerdings ließ sich die
Chemokinexpression nur in einem gewissen Rahmen steigern, sodass bei einer MOI
von 1 ein guter Kompromiss zwischen Stimulation und Überlebensrate erreicht war.
50

Für weitere Versuche wurde, soweit nicht anders angegeben, daher immer eine MOI
von 1 gewählt.
Abbildung 4.2 Untersuchung der Abhängigkeit der C. albicans-induzierten Expression von
CXCL8 und CCL20 von der eingesetzten MOI. HUVEC wurden mit den angegebenen
Anfangsverhältnissen (multiplicity of infection, MOI) mit C. albicans stimuliert und für acht Stunden
co-kultiviert. Die Überstände der Co-Kulturen wurden mittels ELISA auf ihren CXCL8-Gehalt
untersucht (A). Die Totalzelllysate wurden ebenfalls mittels ELISA auf ihren Gehalt an CCL20
untersucht (B). Die gezeigten Werte und Standardfehler wurden aus vier (A) bzw. zwei (B)
unabhängigen Versuchen berechnet. Totalzelllysate wurden mit einem Antiserum gegen CXCL8 im
Western Blot auf CXCL8-Expression hin untersucht. Eine Ladekontrolle erfolgte mittels
ERK2-Färbung (C).
4.1.3 Einfluß des Serumgehalts auf die Stimulierbarkeit von HUVEC durch C.
albicans
Von anderen Pathogenen wie z. B. E. coli ist bekannt, dass die Anwesenheit von
opsonisierenden Bestandteilen aus dem Serum notwendig ist, um ihre Bindung an
die Membranen von Wirtszellen und ihre Aufnahme durch Phagozytose zu
verstärken (Gratchev et al., 2005). Auch wurde publiziert, dass opsonisierte
Zymosanpartikel von HUVEC zu einem höheren Anteil aufgenommen werden als
nicht opsonisiertes Zymosan (Langeggen et al., 2003). Schließlich ist die
Anwesenheit von Serum immer auch ein wichtiger bestimmender Faktor für
Wachstum, Differenzierung, Stimulierbarkeit etc. der Zelle.
Unter ansonsten identischen Bedingungen wurde die Konzentration von FBS in
Medium M199 als Kulturmedium während der Co-Kultur von C. albicans und HUVEC
51

variiert, um den Einfluss der Serumkonzentration im Medium während der
Stimulation zu untersuchen. Es sollte die niedrigste Konzentration gefunden werden,
bei der es zu einer ausreichenden Stimulation der HUVEC kommt. Damit sollte ein
eventuell störender Effekt von FBS z. B. bei der Auswertung von
Zellkulturüberständen im ELISA minimiert werden.
Die Titration der Serumkonzentration im Medium während der Co-Kultur von HUVEC
und C. albicans ergab ein Maximum der CXCL8-Expression bei 7 % FBS, daher
wurde für alle weiteren Stimulationsversuche diese Serumkonzentration beibehalten
(Abbildung 4.3).
Abbildung 4.3 Untersuchung der C. albicans-induzierten CXCL8-Expression in Abhängigkeit
des Serumgehaltes im Medium. Unmittelbar vor der Stimulation der Endothelzellen mit C. albicans
in einem Verhältnis von 1:1 wurde das Wachstumsmedium der HUVEC abgesaugt und durch M199
mit der jeweils angegebenen FBS-Konzentration ersetzt. Nach acht Stunden Stimulationszeit wurden
die Zellkulturüberstände gesammelt und mittels CXCL8-ELISA untersucht. Die gezeigten Werte sind
Mittelwerte aus zwei bzw. drei Versuchen, die Fehlerbalken zeigen die Standardfehler (± SEM).
4.1.4 C. albicans induziert eine verzögerte Chemokinexpression in HUVEC
Für den Zeitrahmen der Stimulationsversuche waren folgende Faktoren besonders
zu berücksichtigen: Nach Stimulation unterliegt die Neusynthese von Proteinen durch
die normalen Transkriptions- und Translationsreaktionen einer gewissen zeitlichen
Verzögerung. Daher ist eine Mindeststimulationsdauer der Endothelzellen notwendig,
um eine ausreichende Expression der zu untersuchenden Proteine zu ermöglichen.
Andererseits führt die Penetration von Candida-Hyphen in die Wirtszellen während
52

der Co-Kultur letztendlich zum Zelltod. Daher ist mit einer Stagnation bzw.
Verringerung des Proteingehalts im Kulturmedium bzw. im Zelllysat zu rechnen.
Hinsichtlich der Dauer der Stimulation musste daher unter Berücksichtigung der
Methode der Versuchsauswertung ein Kompromiss gefunden werden. HUVEC und
C. albicans wurden mit den zuvor festgelegten Parametern von 7 % Serum im
Stimulationsmedium und einer MOI von 1 über verschieden lange Zeiträume hinweg
co-kultiviert. Im Zellkulturüberstand konnte ab einer Stimulationsdauer von
4-6 Stunden eine annähernd gleichbleibend hohe Konzentration von sezerniertem
CXCL8 beobachtet werden (Abbildung 4.4 (A)). Im Zelllysat der Candida-stimulierten
HUVEC konnte die höchste Konzentration an CCL20 bei einer Stimulationsdauer von
6 h nachgewiesen werden (Abbildung 4.4 (B)). Die anschließende leichte
Konzentrationsabnahme könnte auf ein „Leck“ der von Candida penetrierten
Endothelzellen oder auf einen intrazellulären Abbau des gebildeten CCL20
hindeuten.
Abbildung 4.4 Untersuchung des zeitlichen Verlaufs der C. albicans-induzierten Expression
von CXCL8 und CCL20. Zu den angegebenen Zeitpunkten wurden Medium und Lysat von
Candida-stimulierten HUVEC gesammelt und der zeitliche Verlauf der Konzentrationen von CXCL8 im
Kulturüberstand (A) und von CCL20 im Totalzelllysat (B) mittels ELISA untersucht. Dargestellt sind die
Ergebnisse eines Einzelversuchs.
Aufbauend auf dieser Untersuchung konnte in einem Stimulationsversuch in
Anwesenheit von Inhibitoren der Proteolyse gezeigt werden, dass in einem Zeitraum
von bis zu 8 Stunden das gebildete CXCL8 unter den gewählten Kulturbedingungen
nicht degradiert wurde (Abbildung 4.5). Dem Stimulationsmedium wurden für diese
Untersuchung nach fünf Stunden Co-Kultur von HUVEC und C. albicans die
Proteaseinhibitoren Aprotinin und Pefabloc ® zugesetzt. Diese Ansätze wurden für
53

weitere drei Stunden inkubiert und die Zellkulturüberstände nach insgesamt acht
Stunden Stimulation mittels CXCL8-ELISA ausgewertet.
Abbildung 4.5 C. albicans-induziertes CXCL8 wird innerhalb des achtstündigen
Versuchszeitraums nicht proteolytisch degradiert. HUVEC wurden mit C. albicans oder nur mit
Medium als Kontrolle stimuliert. Nach fünf Stunden Stimulationszeit wurden dem Medium die
Proteaseinhibitoren Aprotinin (1 µg/ml) und Pefabloc ® (0,25 mM) zugesetzt und die Ansätze für
weitere drei Stunden inkubiert. Zum Vergleich wurden parallele Stimulationen ohne Zusatz von
Proteaseinhibitoren kultiviert. Nach insgesamt acht Stunden Stimulationszeit wurden die
Zellkulturüberstände gesammelt und mittels ELISA auf CXCL8 untersucht. Gezeigt sind die
Ergebnisse eines Einzelversuches.
Unter Berücksichtigung der in den Abbildungen 4.4 und 4.5 dargestellten Ergebnisse
wurde für Nachweise von Proteinen, Phosphorylierungsreaktionen und
Transkriptionsaktivität eine Stimulationsdauer von acht Stunden festgelegt, für
DNA- und RNA-Untersuchungen wurde die Zeit auf fünf Stunden verkürzt.
4.1.5 Hitze-inaktivierte C. albicans induzieren keine CXCL8-Expression in
HUVEC
In der Literatur wurde beschrieben, dass zur Auslösung von Abwehrreaktionen in
Immunzellen schon der Kontakt mit abgetöteten C. albicans ausreicht (Arancia et al.,
1998). Andere Studien besagen, dass nur lebende C. albicans, nicht aber
Hitze-inaktivierte Candida die Zytokinexpression in Wirtszellen induzieren
(Mostefaoui et al., 2004; Schaller et al., 2002). Ob nun für die Stimulation von
HUVEC der Kontakt mit Oberflächenstrukturen von C. albicans genügt, um die
Expression von CXCL8 zu induzieren, sollte mit Hitze-inaktivierten C. albicans
untersucht werden. Dazu wurde die Übernachtkultur von C. albicans für 30 min auf
95°C erhitzt und ein Teil dieser Zellen zur Kontrolle der erfolgreichen
54

Hitze-Inaktivierung auf einer Sabouraud-Glukose-Agar-Platte ausgestrichen, wobei in
Kultur aufgrund der Vorbehandlung keine Lebendkulturen mehr entdeckt werden
konnten (Daten nicht gezeigt). Sowohl lebende Candida-Hefen als auch
Hitze-inaktivierte Candida-Hefen wurden mit einer MOI von 1 zur Stimulation von
HUVEC eingesetzt. Die Auswertung der Zellkulturüberstände nach acht Stunden
mittels ELISA ergab, dass nur die lebenden Candida-Hefezellen in HUVEC eine
CXCL8-Expression induzieren konnten (Abbildung 4.6, links). Das gleiche Ergebnis
wurde in der Western Blot-Analyse von HUVEC beobachtet, die mit lebenden und
Hitze-inaktivierten C. albicans in verschiedenen MOI über acht Stunden co-kultiviert
wurden (Abbildung 4.6, rechts).
In allen Versuchen waren also nur lebende Candida in der Lage, die Expression des
Chemokins in HUVEC zu induzieren.
Abbildung 4.6 Hitze-inaktivierte C. albicans induzieren keine CXCL8-Expression in HUVEC.
HUVEC wurden für acht Stunden mit lebenden oder Hitze-inaktivierten C. albicans (MOI=1)
co-kultiviert. Die Kulturüberstände wurden mittels ELISA auf CXCL8 untersucht. Die gezeigten Werte
und Standardfehler wurden aus drei unabhängigen Versuchen berechnet (links). Für eine Western
Blot-Analyse wurden die mit lebenden und Hitze-inaktivierten C. albicans stimulierten HUVEC nach
acht Stunden Co-Kultur lysiert. Der Blot wurde mit Antiseren gegen CXCL8 und ERK2 gefärbt (rechts).
4.1.6 Die Aktivierung von HUVEC durch C. albicans ist nicht durch eine LPS-
Verunreinigung bedingt
Da bei der Arbeit mit einem Hefepilz wie Candida albicans eine Kontamination mit
anderen Keimen nicht unbedingt sofort auffallen würde, sollte eine Verunreinigung
der Candida-Kultur mit Lipopolysaccharid (LPS), einem Bestandteil von Gramnegativen
Bakterienzellwänden und einem bekanntermaßen sehr starken
Immunogen, ausgeschlossen werden.
Es gibt in der Literatur einige Fälle, die veranschaulichen, dass Verunreinigungen in
verwendeten Präparationen zu missverständlichen Schlussfolgerungen führen
können. Ein Beispiel sind Berichte von 1998, dass Toll-like Rezeptoren 2 (TLR2) die
55

LPS-induzierte Aktivierung von NF-κB vermittelten und dass dieser Rezeptor der
langgesuchte LPS Signalüberträger sei (Kirschning et al., 1998; Yang et al., 1998).
Es konnte jedoch später gezeigt werden, dass die verwendeten kommerziell
erworbenen LPS-Präparation mit bakteriellem Lipoprotein, einem TLR2-Liganden,
verunreinigt waren (Lee et al., 2002) und dass TLR4 statt TLR2 der Signalüberträger
für LPS ist (Poltorak et al., 1998; Qureshi et al., 1999).
Um Artefakte dieser Art auszuschließen wurden Stimulationsversuche in An- und
Abwesenheit von Polymyxin B Sulfat (PMB) durchgeführt. PMB kann an den
Lipid A-Anteil von LPS binden und so dessen biologische Aktivität neutralisieren. Die
durch LPS in HUVEC induzierte Expression von CXCL8 wurde durch Zugabe von
PMB auf Kontrollniveau gehemmt (Abbildung 4.7, links), wohingegen die
Candida-induzierte CXCL8-Expression durch PMB kaum beeinflusst wurde
(Abbildung 4.7, rechts). Es konnte daher geschlossen werden, dass die Stimulation
der HUVEC Candida-spezifisch war und nicht durch LPS-Verunreinigungen
verursacht wurde.
Darüber hinaus wurden Limulus Amoebozytenlysat (LAL)-Assays durchgeführt (in
Kooperation mit Dr. T. Vogl vom Institut für Experimentelle Dermatologie der
Universität Münster), die die Abwesenheit von LPS-Verunreinigungen in der
verwendeten Candida-Präparation bestätigten (Daten nicht gezeigt).
Abbildung 4.7 Die C. albicans-induzierte CXCL8-Expression in HUVEC wird nicht durch eine
LPS-Verunreinigung verursacht. Polymyxin B Sulfat (PMB)-präinkubierte bzw. unbehandelte
HUVEC wurden für acht Stunden in An- bzw. Abwesenheit von PMB (50 µg/ml) mit LPS (10 ng/ml)
oder C. albicans (MOI=1) stimuliert. Die Kulturüberstände wurden mittels CXCL8-ELISA untersucht.
Die Daten wurden aus drei unabhängigen Versuchen gemittelt, die Fehlerbalken zeigen die
Standardfehler (± SEM).
56

4.2 Untersuchung des C. albicans-induzierten Transkriptoms von HUVEC
Nach der Definition der Kulturbedingungen wurde nunmehr im Hauptteil der Arbeit
mit der Evaluation des Candida-induzierten Genexpressionsprofils und relevanter
Signalwege begonnen.
4.2.1 Das endotheliale Genexpressionsprofil nach Candida-Exposition
Endothelzellen bilden nicht nur eine physikalische Barriere zwischen
unterschiedlichen Gewebekompartimenten, sondern spielen auch eine wichtige Rolle
bei der Abwehr von Pathogenen im Rahmen der angeborenen Immunität. Ihr Beitrag
zur Immunantwort auf C.albicans sollte hier näher definiert werden, daher wurde das
Genexpressionsmuster primärer humaner Endothelzellen nach einer C. albicans-
Infektion mittels Mikroarray-Technologie charakterisiert. Dafür wurden HUVEC über
5 Stunden mit C. albicans co-kultiviert oder als Kontrolle nur in Medium inkubiert. Die
aus diesen Zellen gewonnene RNA wurde für eine Untersuchung mittels Affymetrix
GeneChip ® U133A (Affymetrix, Santa Clara, USA) verwendet. Es wurden vier
unabhängige Oligonukleotid-Mikroarray-Analysen durchgeführt. Zur Auswertung der
Daten wurden die Einschlusskriterien auf eine mindestens 2,5-fache Erhöhung oder
Erniedrigung des Genexpressionsniveaus und einen p-Wert von ≤ 0,05 festgelegt.
Auf diese Weise wurden 56 Gene gefunden, die durch eine Candida-Stimulation in
HUVEC hochreguliert wurden, während 69 Gene herunterreguliert wurden. Die
gesamte Liste der regulierten Gene befindet sich im Anhang (Tabellen 6.1 und 6.2).
Außerdem ist sie im Gene Expression Omnibus (GEO) mit der Zugangsnummer
GSE7355 hinterlegt und kann unter http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/geo/
eingesehen werden.
Die induzierten Gene konnten den folgenden funktionellen Gruppen zugeordnet
werden (Abbildung 4.8): Chemokine/Immunantwort, Signaltransduktion,
Apoptose/Zellproliferation, Metabolismus, Transporter/Kanäle und Zellstruktur.
Ein auffallend großer Teil der Gene war der ersten Gruppe zugehörig, diente also im
weiteren Sinn der Rekrutierung von Immunzellen und der Auslösung einer
entzündlichen Immunantwort. Weiterhin wurden viele Gene gefunden, deren
Produkte die Signaltransduktion, den Zellzyklus und den Metabolismus beeinflussen.
57

Die meisten dieser Gene wurden bisher noch nicht im Zusammenhang mit einer C.
albicans-Infektion beschrieben. Ein beträchtlicher Anteil der regulierten Gene sind
bekannte Zielgene des NF-κB-Signalweges.
Abbildung 4.8 Klassifizierung der durch C. albicans induzierten endothelialen Gene. Die durch
vier unabhängige Oligonukeotid-Mikroarray-Untersuchungen gefundenen Gene, die durch Stimulation
mit C. albicans im Vergleich zu unstimulierten HUVEC hochreguliert wurden, wurden den
beschriebenen Gruppen zugeordnet.
Eine weitere Auswertung der ermittelten hochregulierten Gene erfolgte durch eine
bioinformatische Analyse, bei der unter Berücksichtigung der
Wahrscheinlichkeitswerte (p-Werte ≤ 0,01) diejenigen Gene Ontology (GO)-Gruppen
dargestellt wurden, die im Verhältnis zu allen auf dem Chip repräsentierten Gene
überproportional repräsentiert waren. Im Gene Ontology Project
(http://www.geneontology.org) werden alle bekannten Genprodukte nach ihrer
Zugehörigkeit zu zellulären Komponenten, biologischen Prozessen und molekularen
Funktionen in einem Baumdiagramm verschiedenen GO-Gruppen zugeordnet. Die
gefundenen überrepräsentierten GO-Gruppen wurden der Übersicht halber farblich in
verschiedenen Überkategorien zusammengefasst (Abbildung 4.9). Ein kleiner p-Wert
(= großer Balken) bedeutet eine erhöhte Wahrscheinlichkeit für eine signifikante
Regulation der dargestellten Gene. Auch bei dieser Art der Mikroarray-Auswertung
58

waren Gene, die im Zusammenhang mit Chemotaxis und Entzündung, aber auch
Signaltransduktion und Zellzyklus stehen, am stärksten reguliert.
Abbildung 4.9 Überrepräsentierte GO-Gruppen innerhalb der durch C. albicans hochregulierten
Gene. Mittels bioinformatischer Auswertung wurden diejenigen GO-Gruppen ermittelt, in denen im
Verhältnis zur Gesamtheit der auf dem Chip vertretenen Gene überdurchschnittlich viele Gene
signifikant durch C. albicans hochreguliert wurden (p-Werte ≤ 0,01).
4.2.2 Verifizierung der Mikroarray-Daten mittels quantitativer real time RT-PCR
Die Regulation der im Mikroarray gefundenen Gene sollte durch eine weitere,
unabhängige Methode verifiziert werden. Dafür wurde mit denselben Proben, die
auch für die Oligonukleotid-Mikroarrays verwendet wurden, für einige ausgewählte
Gene (elf Chemokine bzw. Oberflächenmoleküle, ein im Mikroarray nicht reguliertes
Gen (CAR) und ein konstant exprimiertes „Housekeeping-Gen“ (GAPDH)) eine
quantitative real time RT-PCR durchgeführt. Zur statistischen Auswertung wurden die
erhaltenen Werte auf die Expression des Housekeeping-Gens GAPDH normiert und
auf unstimulierte HUVEC bezogen. Für alle untersuchten Gene konnte eine
Erhöhung der mRNA in HUVEC nach einer fünfstündigen Stimulation mit C. albicans
beobachtet werden (Abbildung 4.10). Das Gen CAR, das im Mikroarray nicht als
Candida-reguliert gefunden worden war, wurde als interne Kontrolle zusammen mit
59

den anderen Genen untersucht und zeigte, wie erwartet, auch in der real time
RT-PCR keine signifikante Regulation. Somit untermauert dieses Ergebnis die
Glaubwürdigkeit der in der Mikroarray-Analyse erhaltenen Daten.
Abbildung 4.10 Untersuchung der mRNA von HUVEC nach C. albicans-Stimulation mittels
quantitativer real time RT-PCR. In C. albicans-stimulierten HUVEC wurde mittels real time RT-PCR
der mRNA-Gehalt von verschiedenen Chemokinen und Oberflächenmolekülen gemessen. Die
erhaltenen Werte wurden auf das Housekeeping-Gen GAPDH normiert und als Induktion bezogen auf
unstimulierte HUVEC dargestellt. Die gezeigten Daten sind Mittelwerte und Standardfehler aus sechs
unabhängigen Versuchen.
4.3 Die Aktivierung der IKK/NF-κB Signalkaskade durch C. albicans
4.3.1 C. albicans aktiviert IKK2 und führt zu Degradation von IκBα
Ein großer Anteil der im Mikroarray gefundenen Gene wird bekanntermaßen durch
den Transkriptionsfaktor NF-κB reguliert. Es sollte daher bestätigt werden, dass
C. albicans den NF-κB-Signalweg in primären Endothelzellen aktiviert.
Zur Untersuchung der Aktivität der IκBα-phosphorylierenden Kinase IKK2 wurden
Immunkomplex-Kinaseassays durchgeführt. Es wurden parallele Ansätze mit den
beiden Stimuli C. albicans und TNFα durchgeführt, um die Antwort von HUVEC auf
Candida mit der NF-κB-Aktivierung auf einen bekanntermaßen starken κB-Aktivator,
TNFα, vergleichen zu können. Die Untersuchung von HUVEC-Lysaten, die zu
verschiedenen Zeitpunkten der Candida-Stimulation erhalten wurden, ergab eine
60

IκBα-Phosphorylierung innerhalb von 2-4 h (Abbildung 4.11 (A), links). Dagegen
erfolgte die TNFα-induzierte IκBα-Phosphorylierung auffallend schneller, mit einer
maximalen Aktivierung nach 20 min (Abbildung 4.11 (A), rechts), was mit bereits
publizierten Daten korrelierte (Goebeler et al., 2001). Die Kinetik der induzierten
IKK2-Aktivität wurde dann mit dem Zeitverlauf der IκBα-Degradation verglichen, der
mittels Western Blot-Analyse untersucht wurde. Bei beiden Stimuli verlief die
Degradation von IκBα ähnlich zu den Aktivitätsmustern von IKK2 (Abbildung 4.11
(B)).
Abbildung 4.11 Aktivierung von IKK2 und Degradation von IκBα in HUVEC nach Stimulation
mit C. albicans. HUVEC wurden mit C. albicans (MOI=1) (links) oder TNFα (2 ng/ml) (rechts)
stimuliert und zu verschiedenen Zeitpunkten lysiert. Der zeitliche Verlauf der Phosphorylierung von
IκBα wurde mittels Immunkomplex-Kinaseassay untersucht. Als Kontrolle für eine gleiche Beladung
der Banden wurden dieselben Lysate im Western Blot auf IKK2 gefärbt (A). Die Degradation von IκBα
wurde analysiert, indem unter gleichen Bedingungen gewonnene Lysate im Western Blot untersucht
wurden. Als Ladekontrolle wurden die Membranen gestrippt und mit einem Anti-ERK2 Antikörper
gefärbt (B).
4.3.2 Stimulation mit C. albicans führt zu NF-κB-abhängiger Genexpression
Da beide Stimuli die Phosphorylierung und die Degradation von IκBα induzierten,
sollte nun die NF-κB-Transkriptionsaktivität mittels Promoter-Reporter-Assays
(Luciferase-Assay) untersucht werden. HUVEC wurden dafür mit einem
6xκB-Promoter-abhängigen Firefly-Luciferasekonstrukt und einem Ubiquitin-
Promoter-abhängigen Renilla-Luciferasekonstrukt transfiziert und 48 Stunden später
mit C. albicans oder TNFα stimuliert.
61

Nach 8 Stunden konnte für Candida eine 3-4fach erhöhte transkriptionelle Aktivität
gemessen werden, wohingegen mit TNFα eine 15-20fache Induktion des
Reporterkonstrukts beobachtet wurden (Abbildung 4.12).
Abbildung 4.12 Untersuchung der κB-abhängigen Transkription in HUVEC nach Stimulation
mit C. albicans mittels Promoter-Reporter-Assay. HUVEC wurden mit einem 6xκB-Promoterabhängigen
Firefly-Luciferasekonstrukt und einem Ubiquitin-Promoter-abhängigen Renilla-
Luciferasekonstrukt transfiziert. 48 Stunden nach der Transfektion wurden sie für acht Stunden mit
C. albicans (MOI=1, links) oder TNFα (2 ng/ml, rechts) stimuliert. Als Kontrolle dienten transfizierte
und mit Medium inkubierte HUVEC. Die Lysate der Endothelzellen wurden im Luminometer auf ihre
Luciferaseaktivität untersucht. Die erhaltenen Firefly-Luciferasewerte wurden durch Bezug auf die
Werte der Renilla-Luciferaseaktivität auf die gleiche Anzahl transfizierter Zellen normiert. Die
gezeigten Daten sind Mittelwerte aus drei unabhängigen Versuchen, die Fehlerbalken stellen die
Standardfehler dar.
4.3.3 Die C. albicans-vermittelte Genexpression hängt von der Aktivierung des
NF-κB-Signalweges ab
Es sollte im Folgenden geklärt werden, inwieweit der NF-κB-Signalweg tatsächlich
für die C. albicans-induzierte Stimulation von HUVEC verantwortlich ist. Dafür wurde
der Einfluss einer stabil exprimierten Kinase-inaktivierten Mutante von IKK2
(IKK2KD) in Endothelzellen auf die Induktion von Chemokinen nach
Candida-Exposition untersucht. Diese dominant-negative Mutante von IKK2 wurde
über den retroviralen Vektor pCFG5-IEGZ vermittelt, als Kontrolle kam der Vektor
ohne Transgen zum Einsatz. HUVEC wurden mit den Zellkulturüberständen der
virusproduzierenden Verpackerzellen ΦNX ampho infiziert und durch die
Vektor-vermittelte Zeozin-Resistenz selektioniert. Über die ebenfalls durch den
Vektor vermittelte GFP-Expression konnte die Rate der erfolgreich infizierten Zellen
im Durchflusszytometer quantifiziert werden (Abbildung 4.13). Nach drei Tagen
62

Selektion war die geforderte Mindestrate von 85 % GFP-Positivität erreicht, und die
Zellen wurden für verschiedene Untersuchungen weiterverwendet.
Abbildung 4.13 Quantifizierung der retroviralen Infektionsraten von HUVEC nach Selektion. Zur
Kontrolle der Infektionsrate mit dem GFP-codierenden Vektor pCFG5-IEGZ wurden die infizierten
HUVEC nach drei Tagen Zeozin-Selektion im FACS auf ihre GFP-Expression untersucht. Die
Einstellung der Parameter (GFP-Fluoreszenz im ersten Kanal (FL-1) und Größe der Zellen im
Forwardscatter (FSC)) wurde anhand von uninfizierten HUVEC vorgenommen (HUVEC Wildtyp).
Anschließend wurden die mit dem leeren pCFG5-IEGZ-Vektor infizierten HUVEC (HUVEC Leervektor)
und die IKK2-Mutante-exprimierenden HUVEC (HUVEC IKK2KD) gemessen. Mit Hilfe der
Quadrantenauswertung konnten so die lebenden, GFP-positiven Zellen quantifiziert werden (Q2,
jeweils rechts oben).
Für einen Vergleich der mRNA-Induktion in Leervektor- und IKK2KD-infizierten
HUVEC nach Candida-Exposition wurden RNA-Lysate der stimulierten HUVEC
mittels real time RT-PCR analysiert. Alle untersuchten Gene wurden, wie zuvor für
uninfizierte HUVEC gezeigt (Abschnitt 4.2.2), ebenfalls in Leervektor-infizierten
Zellen durch Stimulation mit C. albicans induziert (Abbildung 4.14, graue Balken). Die
gemessenen Werte lagen deutlich unter den Werten der Wildtyp-HUVEC. Diese
reduzierte Stimulierbarkeit ist ein häufig beobachtetes Phänomen von genetisch
manipulierten Zellen. Im Vergleich zu den Werten der Leervektor-infizierten HUVEC
waren alle gemessenen Werte der IKK2KD-infizierten HUVEC deutlich reduziert
(Abbildung 4.14, schwarze Balken). Wiederum zeigte das Gen CAR keine Regulation
nach C. albicans-Stimulation.
63

Es konnte also demonstriert werden, dass die Candida-induzierte Expression der
untersuchten Gene entscheidend von der Aktivierung des NF-κB-Signalweges
abhängt.
Abbildung 4.14 Untersuchung der mRNA von IKK2KD-infizierten HUVEC nach C. albicans-
Stimulation mittels quantitativer real time RT-PCR. Mittels quantitativer real time RT-PCR wurde
der mRNA-Gehalt von verschiedenen Zytokinen und Oberflächenmolekülen in C. albicans-stimulierten
HUVEC gemessen, die zuvor mittels retroviraler Infektion mit einer Kinase-inaktivierten Mutante von
IKK2 in pCFG5-IEGZ (pCFG5-IEGZ IKK2KD) bzw. der Vektorkontrolle (pCFG5-IEGZ) transfiziert und
selektioniert worden waren. Ausreichende Infektionsraten wurden zuvor im Durchflusszytometer
überprüft (vgl. Abbildung 4.13). Die erhaltenen Werte wurden auf das Housekeeping-Gen GAPDH
normiert und als Induktion bezogen auf unstimulierte HUVEC dargestellt. Die Daten wurden aus drei
unabhängigen Versuchen berechnet und gemittelt, die Fehlerbalken zeigen die Standardfehler.
64

4.3.4 Die C. albicans-induzierte Expression von CXCL8 und CCL20 ist von der
Aktivierung des IKK-Komplexes abhängig
In früheren Arbeiten wurde gezeigt, dass die Kinase-inaktivierte Mutante von IKK2
(IKK2KD) die TNFα-vermittelte Induktion bekannter NF-κB-Targetgene nicht nur auf
mRNA-, sondern auch auf Proteinebene hemmt (Viemann et al., 2004). Daher sollte
auch in der vorliegenden Arbeit untersucht werden, inwieweit NF-κB an der
Candida-induzierten Expression von CXCL8 und CCL20 beteiligt ist und ob sich
deren Expression durch IKK2KD hemmen lässt. Zum Vergleich mit der bekannten
Datenlage wurden die Versuche parallel auch mit dem Stimulus TNFα durchgeführt.
Die verwendeten infizierten Zellen wurden zur Kontrolle der Überexpression von
IKK2KD im Western Blot mit einem Antiserum gegen IKK2 gefärbt, wobei der
verwendete Antikörper die Mutante von IKK2 ebenso binden konnte wie endogene
IKK2. Der Gehalt an endogener IKK2 war in HUVEC jedoch so gering, dass auf den
Western Blots keine Banden für die Leervektor-infizierten Zellen zu erkennen waren.
Die Banden der überexprimierten mutierten IKK2 waren dagegen deutlich zu sehen
(Abbildung 4.15 (A)). Somit wurde eine ausreichend hohe Expression der mutierten
IKK2 belegt, um die nachfolgend erhaltenen Daten als Effekt von IKK2KD zu
interpretieren. Die infizierten HUVEC wurden für acht Stunden mit C. albicans oder
TNFα stimuliert, danach wurden die Zellkulturüberstände und Zelllysate mittels
ELISA auf CXCL8 bzw. CCL20 untersucht. Entsprechend der gehemmten
mRNA-Induktion von CXCL8 und CCL20 wurde auch hier eine Hemmung der
Proteinexpression beider Chemokine durch IKK2KD beobachtet (Abbildung 4.15 (B)).
Sowohl die Candida-induzierte als auch die TNFα-vermittelte Expression von CXCL8
und CCL20 bedarf also einer Aktivierung des NF-κB-Signalweges, was die durch die
real time RT-PCR erhaltenen Ergebnisse bestätigt.
65

Abbildung 4.15 Eine dominant-negative Mutante von IKK2 hemmt die C. albicans-induzierte
Expression von CXCL8 und CCL20 in HUVEC. HUVEC wurden retroviral entweder mit dem leeren
Vektor pCFG5-IEGZ (Kontrolle) oder demselben Vektor mit der Kinase-inaktivierten Mutante von IKK2
(IKK2KD) infiziert. Die stabil transduzierten Zellen wurden drei Tage lang mit Zeozin (250 µg/ml)
selektioniert, einen Tag in normalem Kulturmedium ohne Antibiotika kultiviert und anschließend für
acht Stunden mit C. albicans (MOI=1) oder TNFα (2 ng/ml) stimuliert bzw. nur mit Medium behandelt.
Zur Infektionskontrolle wurden die Lysate von Vektor-infizierten und IKK2KD-infizierten stimulierten
und unstimulierten Zellen im Western Blot auf Expression von IKK2KD hin untersucht. Als
Ladekontrolle diente eine Färbung auf ERK2 (A). Die Überstände der stimulierten bzw.
Medium-behandelten infizierten Zellen wurden mittels ELISA auf CXCL8 untersucht (oben). Die
Totalzelllysate wurden für eine ELISA-Untersuchung auf CCL20 verwendet (unten) (B). Für die
gezeigten Daten wurden die Werte aus sechs (CXCL8) bzw. vier (CCL20) Versuchen gemittelt, die
Fehlerbalken zeigen die Standardfehler (± SEM).
66

4.3.5 Die C. albicans-induzierte Expression von ICAM-1 ist IKK2-abhängig
Neben den beiden Chemokinen CXCL8 und CCL20 sollte ebenfalls die Expression
eines Adhäsionsmoleküls auf der Oberfläche von HUVEC nach Aktivierung des
NF-κB-Signalweges untersucht werden. Eines der wichtigsten bekannten
NF-κB-regulierten Oberflächenmoleküle von HUVEC früherer Arbeiten ist ICAM-1
(intercellular adhesion molecule 1), das beispielsweise durch den
proinflammatorischen Stimulus TNFα stark hochreguliert wurde (Viemann et al.,
2004). Für dieses Adhäsionsmolekül konnte mittels real time RT-PCR bereits auf
mRNA-Ebene gezeigt werden, dass es nach C. albicans-Stimulation induziert wird
und dass IKK2KD diese Induktion zumindest teilweise hemmen kann (Abbildungen
4.10 und 4.14).
Trotz technischer Schwierigkeiten bei der durchflusszytometrischen Untersuchung
von Candida-stimulierten Zellen, die sich aus dem erheblichen Hyphenanteil
ergaben, konnte mittels Oberflächenfärbung gezeigt werden, dass in den mit
Leervektor infizierten HUVEC nach Stimulation mit C. albicans das membranständige
ICAM-1 hochreguliert wurde, und dass diese Proteinexpression nach Hemmung der
NF-κB-Signalkaskade durch IKK2KD unterbleibt. Zum Vergleich wurden die Zellen
auch in diesem Versuch parallel mit TNFα stimuliert (Abbildung 4.16).
Abbildung 4.16 IKK2KD hemmt die C. albicans-induzierte Expression von ICAM-1 auf HUVEC.
Die retroviral infizierten HUVEC wurden für acht Stunden mit C. albicans (MOI=1) oder TNFα (2 ng/ml)
stimuliert. Nach der anschließenden Oberflächenfärbung des Adhäsionsmoleküls ICAM-1 wurden die
Zellen im FACS untersucht. In den Leervektor-infizierten HUVEC wurde durch beide Stimuli die
Expression von ICAM-1 induziert (farbige Linien, oben), wohingegen in HUVEC, die die dominantnegative
Mutante von IKK2 exprimierten, die ICAM-1-Expression zum größten Teil bzw. komplett
gehemmt wurde (farbige Linien, unten). Zum Vergleich mit den IgG-Isotyp-Kontrollen (schwarze
Linien) wurden die Daten jeweils als Overlay-Histogramme dargestellt.
67

4.3.6 Der C. albicans-induzierten CXCL8-Expression liegt kein autokriner oder
parakriner Mechanismus zugrunde
Ein auffälliger Unterschied bei der Aktivierung der NF-κB-Signalkaskade durch die
beiden Stimuli Candida albicans und TNFα war der zeitliche Verlauf (vgl. Abbildung
4.11). Es lag daher die Vermutung nahe, dass ein auto- bzw. parakriner
Mechanismus, eventuell über IL-1β oder TNFα, für die verzögert auftretende
Aktivierung von NF-κB durch C. albicans verantwortlich sein könnte. Beide Zytokine
werden bekanntermaßen von HUVEC exprimiert und sind Auslöser einer
proinflammatorischen Immunantwort. Ein solcher autokriner Mechanismus über
TNFα wurde von der Arbeitsgruppe um S.G Filler unter anderem für die
Candida-induzierte CXCL8-Expression postuliert (Orozco et al., 2000).
Zur Untersuchung dieser Hypothese sollte daher im Folgenden geklärt werden,
inwieweit C. albicans die Expression von IL-1β oder TNFα induziert und ob diese
wiederum über membranständige Rezeptoren an der Oberfläche der HUVEC die
Expression von CXCL8 vermitteln. Dazu wurde der folgende Hemmversuch
konzipiert: HUVEC wurden mit IL-1β, TNFα oder C. albicans stimuliert, wobei dem
Medium 30 min vor Stimulationsbeginn verschiedene Zusätze beigefügt wurden. Die
biologische Aktivität von IL-1β und TNFα wurde durch den Zusatz von
Interleukin 1-Rezeptor-Antagonist (IL-1RA) bzw. Etanercept, einem löslichen
chimären Protein bestehend aus einem IgG-Fc-Anteil und der
Ligandenbindungsdomäne des menschlichen Tumornekrosefaktor-Rezeptors 2
(TNF-R2-Fc), neutralisiert. Als Kontrollen wurden dem Medium IgG beigemischt oder
die Zellen in zusatzfreiem Medium gehalten. Alle möglichen Kombinationen von
Inhibitor und Stimulus wurden für acht Stunden inkubiert und die anschließend
gewonnenen Zellkulturüberstände mittels ELISA auf CXCL8 untersucht.
Zur Auswertung dieses Versuchs wurde die für jeden Stimulus jeweils in
zusatzfreiem Medium erreichte CXCL8-Konzentration als 100 % Induktion definiert
und die anderen Werte entsprechend darauf bezogen. Es konnte beobachtet
werden, dass die IL-1β-induzierte CXCL8-Expression komplett durch IL-1RA, die
TNFα-vermittelte CXCL8-Expression vollständig durch TNF-R2-Fc gehemmt wurde.
Die durch C. albicans vermittelte CXCL8-Expression war in keinem Fall signifikant
verändert. In Anwesenheit von IgG-Isotypkontrolle wurden bei allen drei Stimuli die
CXCL8-Expressionen kaum beeinflusst (Abbildung 4.17). Somit konnte die
68

Hypothese eines indirekten Mechanismus der HUVEC-Stimulation durch C. albicans,
zumindest für die beiden wichtigsten Zytokine IL-1β und TNFα, widerlegt werden.
Abbildung 4.17 Die CXCL8-Expression in HUVEC nach C. albicans-Stimulation wird nicht
indirekt über IL-1β oder TNFα vermittelt. HUVEC wurden zunächst für 30 min in Medium mit Zusatz
eines IL-1-Rezeptor-Antagonisten (IL-1RA, 200 ng/ml), eines löslichen TNF-Rezeptor 2-Fc
(TNF-R2-Fc, 10 µg/ml) bzw. einer IgG-Kontrolle (von der Maus, 10 µg/ml) oder in zusatzfreiem
Medium präinkubiert. Anschließend wurden die Zellen für acht Stunden mit C. albicans (MOI=1),
TNFα (2 ng/ml) oder IL-1β (100 U/ml) stimuliert. Nach dieser Zeit wurden die Zellkulturüberstände
gesammelt und im ELISA auf CXCL8 untersucht. Der für jede Stimulation in Medium ohne Zusatz
erreichte CXCL8-Wert wurde als 100 % Induktion definiert und die anderen Werte entsprechend
darauf bezogen. Die gezeigten Daten sind Mittelwerte und Standardfehler aus drei unabhängigen
Versuchen.
Weiteren Aufschluss über die Fragestellung, ob die beobachtete κB-Aktivierung autooder
parakrin durch andere lösliche Faktoren ausgelöst wird oder über Faktoren, die
von C. albicans in das Zellkulturmedium abgegeben werden, ergaben Versuche mit
konditionierten Medien. Dafür wurden HUVEC für vier bzw. acht Stunden mit C.
albicans oder nur mit Medium kultiviert. Danach wurde der Zellkulturüberstand
sterilfiltriert und für weitere acht Stunden auf unabhängige HUVEC-Kulturen
gegeben. Als positive Kontrolle wurden parallel dazu HUVEC wiederum mit C.
albicans stimuliert (Abbildung 4.18). Zur Auswertung der Experimente wurde der
Gehalt an CXCL8 in den einzelnen Kulturüberständen bestimmt. Dabei wurden für
die konditionierten Medien die Differenzen der Werte vor und nach der achtstündigen
Stimulation gebildet. Das Ergebnis zeigte deutlich, dass die Überstände der
Candida-exponierten HUVEC im Gegensatz zu den lebenden C. albicans
Blastosporen keine CXCL8-Expression induzierten. Eine Beteiligung löslicher
Faktoren an der κB-Aktivierung konnte daher ausgeschlossen werden.
69

Abbildung 4.18 Mit C. albicans konditionierte Medien induzieren keine CXCL8-Expression in
HUVEC. Konditioniertes Medium wurde generiert, indem HUVEC für vier bzw. acht Stunden mit
C. albicans (MOI=1) oder nur mit Medium in gleichem Mediumvolumen kultiviert wurden. Der
Zellkulturüberstand wurde anschließend mittels 0,45 µm-Filter von eventuell darin vorkommenden
Zellen, Zellbestandteilen oder Blastosporen gereinigt. Die filtrierten Überstände wurden dann für
weitere acht Stunden auf HUVEC gegeben, parallel dazu wurden HUVEC mit C. albicans (MOI=1)
bzw. Medium kultiviert. Die durch ELISA erhaltenen CXCL8-Werte der Zellkulturüberstände wurden
jeweils auf die Mediumkontrolle bezogen. Die Werte der konditionierten Medien sind Differenzen aus
den CXCL8-Werten vor und nach der letzten achtstündigen Kultivierung. Dargestellt sind Mittelwerte
und Standardfehler (± SEM) aus drei unabhängigen Versuchen.
70

4.4 C. albicans aktiviert die p38 MAP Kinase
4.4.1 Stimulation mit C. albicans führt zur Aktivierung von p38
Es ist bekannt, dass die Induktion verschiedener Gene der Kooperation von
unterschiedlichen Signalkaskaden bedarf (Goebeler et al., 2001; Viemann et al.,
2004). Beispielsweise erfordert eine effiziente Induktion von CXCL8 neben der
Regulation durch NF-κB auch die Aktivierung der p38 MAP Kinase (Hippenstiel et al.,
2000; Hoffmann et al., 2002; Holtmann et al., 1999). Es sollte deshalb zunächst
untersucht werden, ob C. albicans in HUVEC nicht nur den NF-κB-Signalweg,
sondern auch p38 aktiviert. Dazu wurden Immunkomplex-Kinaseassays durchgeführt
unter Verwendung von 3pK und ATF-2 als Substrat für p38 (Abbildung 4.19).
Candida aktivierte endotheliales p38 innerhalb von 2-4 h nach dem Beginn der Co-
Kultur, während die maximale Aktivität von p38 durch TNFα innerhalb von 20 min
erreicht wurde.
Abbildung 4.19 C. albicans führt zu p38-Aktivierung in HUVEC. HUVEC wurden entweder mit
C. albicans (MOI=1, links) oder mit TNFα (2 ng/ml, rechts) über verschiedene Zeiten stimuliert. Zu den
angegebenen Zeitpunkten wurden Lysate der Endothelzellen hergestellt und diese im Immunkomplex-
Kinaseassay auf Phosphorylierung von 3pK bzw. ATF-2 (beides Substrate von p38) untersucht. Zur
Kontrolle der gleichmäßigen Beladung wurden die Lysate im Western Blot auf p38 gefärbt.
4.4.2 Die Candida-induzierte Expression ausgewählter Gene unterliegt der Co-
Regulation durch p38
Um die funktionelle Relevanz von p38 für die C. albicans-induzierte
Chemokinexpression zu untersuchen, wurden HUVEC mit dem pharmakologischen
p38-Inhibitor SB202190 in verschiedenen Konzentrationen präinkubiert. Dies führte
bei der anschließenden Stimulation zu einer dosisabhängigen Hemmung der C.
albicans-induzierten CXCL8-Expression. Die Auswertung mittels Western Blot und
ELISA ergab, dass die Konzentrationen an p38-Inhibitor, die für einen 50 %igen
Hemmeffekt (IC 50 ) nötig waren, für C. albicans wie auch für TNFα in einem Bereich
zwischen 1 und 0,1 µM lagen (Abbildung 4.20 (A) und (B)).
71

Abbildung 4.20 Die C. albicans-induzierte Expression von CXCL8 in HUVEC kann durch einen
p38-Inhibitor gehemmt werden. HUVEC wurden mit verschiedenen Konzentrationen des
p38-Inhibitors SB202190 präinkubiert und anschließend für acht Stunden entweder mit C. albicans
(MOI=1, links) oder mit TNFα (2 ng/ml, rechts) stimuliert. Totalzelllysate der stimulierten HUVEC
wurden im Western Blot auf CXCL8 untersucht, Ladekontrollen wurden mit Anti-ERK2 gefärbt.
Gezeigt ist ein repräsentativer Versuch von drei unabhängigen Versuchen (A). Die
Zellkulturüberstände der stimulierten HUVEC wurden mittels ELISA auf CXCL8-Expression
untersucht. Diese Daten wurden aus vier unabhängigen Versuchen gemittelt, die Fehlerbalken zeigen
die Standardfehler (± SEM) (B).
Im Gegensatz zur Expression von CXCL8 konnte sowohl die C. albicans-induzierte
als auch die TNFα-vermittelte CCL20-Expression durch Zusatz von SB202190 kaum
gehemmt werden. Selbst sehr hohe Dosen des p38-Inhibitors führten nicht zu einer
signifikanten Erniedrigung der CCL20-Konzentrationen im Zellkulturüberstand
stimulierter HUVEC (Abbildung 4.21).
Im Vergleich zu den Daten über die p38-Modulation von CXCL8 weisen diese
Beobachtungen deutlich darauf hin, dass die Candida-induzierte Expression
unterschiedlicher Zielgene auch verschiedenen co-stimulatorischen Einflüssen
unterliegt.
72

Abbildung 4.21 Die C. albicans-induzierte Expression von CCL20 kann nicht durch einen
p38-Inhibitor gehemmt werden. HUVEC wurden wie in Abbildung 4.20 beschrieben mit SB202190
behandelt und stimuliert. Die Totalzelllysate wurden mittels ELISA auf ihren Gehalt an CCL20
untersucht und die erhaltenen Werte auf den Proteingehalt der Proben normiert. Die gezeigten Daten
stellen Mittelwerte und Standardfehler aus drei (C. albicans) bzw. zwei (TNFα) unabhängigen
Versuchen dar.
4.4.3 Der p38-Inhibitor hat keinen direkten Einfluss auf C. albicans
Anschließend wurden parallele Stimulationsversuche mit drei verschiedenen
Candida-Präparationen durchgeführt um auszuschließen, dass der verwendete
p38-Inhibitor SB202190 einen direkten Effekt auf C. albicans hat, der die Virulenz
des Pilzes verändern und somit die gehemmte CXCL8-Expression in HUVEC
erklären könnte. Neben den in zusatzfreiem M199 gewachsenen Candida-Hefen
wurden Hefen verwendet, die in Anwesenheit von 1 µM SB202190 oder in
Anwesenheit von DMSO in der gleichen Konzentration, wie sie zum Herstellen der
SB202190-Lösung im Medium nötig war, angezüchtet worden waren. Alle drei
Übernachtkulturen wurden wie in Kapitel 3.1.3.1 beschrieben zentrifugiert, das
Candida-Pellet mit PBS einmal gewaschen und wieder in PBS resuspendiert.
Lösungsmittelreste oder Rückstände des Inhibitors in den Candida-Suspensionen
konnten somit ausgeschlossen werden. Nach einer achtstündigen Co-Kultur von
HUVEC mit den unterschiedlichen C. albicans-Präparationen wurden die
Zellkulturüberstände und die Totalzelllysate gewonnen und mittels ELISA auf CXCL8
bzw. CCL20 untersucht. Für beide Chemokine konnten keine Unterschiede bezüglich
ihrer Expression unter den unterschiedlichen Stimulationsbedingungen gefunden
werden (Abbildung 4.22).
Der beobachtete Hemmeffekt von SB202190 auf die Candida-vermittelte
CXCL8-Expression (Abbildung 4.20) ist also keine direkte Wirkung des Inhibitors auf
73

das Wachstum oder die Virulenz des Pilzes. SB202190 wirkt sich vielmehr hemmend
auf den p38 MAPK-Signalweg der HUVEC aus.
Abbildung 4.22 Eine Präinkubation mit p38-Inhibitor verändert nicht die C. albicans-induzierte
Expression von CXCL8 und CCL20. HUVEC wurden für acht Stunden mit C. albicans (MOI=1)
stimuliert, die unter verschiedenen Bedingungen über Nacht (ü.N.) angezüchtet worden waren: in
M199, in M199 mit SB202190 (1 µM) oder in M199 mit DMSO (Lösungsmittelkontrolle). Die im ELISA
gemessenen Candida-induzierten Expressionen von CXCL8 (links) und CCL20 (rechts) blieben von
den Bedingungen der Anzucht unbeeinflusst. Dargestellt sind die Ergebnisse eines Einzelversuches.
4.5 Die Candida-induzierte Genexpression in Endothelzellen erfordert MyD88
und IRAK1, verläuft aber unabhängig von TLR2 und TLR4
4.5.1 TLR 2 und TLR 4 dienen nicht als Rezeptoren bei der Vermittlung des
Candida-induzierten Signals in HUVEC
Nachdem die Bedeutung des NF-κB- und des p38-Signalweges für die
C. albicans-induzierte Genexpression in humanen Endothelzellen gezeigt werden
konnte, sollten nun die relevanten „upstream“ gelegenen Komponenten identifiziert
werden. Die Beteiligung von Toll-like Rezeptoren als die C. albicans-erkennenden
Rezeptoren wurde bereits in murinen Systemen und humanen Monozyten und
Makrophagen untersucht. Dabei besteht aber bis heute keine Einigkeit darüber, ob
die beiden Toll-like Rezeptoren TLR2 und TLR4 oder nur einer von beiden an der
Signalvermittlung beteiligt sind (Gil and Gozalbo, 2006b; Netea et al., 2002). Es sollte
daher zunächst die Relevanz dieser beiden Rezeptoren in dem HUVEC/C. albicans
Co-Kulturmodell untersucht werden.
In der Literatur wurde die endotheliale Expression von TLR4 beschrieben, während
die basale Expression von TLR2 auf Endothelzellen kontrovers diskutiert wird (Faure
et al., 2000; Talreja et al., 2004). Diesen Erkenntnissen entsprechend konnte mit
Lipopolysaccharid (LPS), einem bekannten starken TLR4-Aktivator, die
74

CXCL8-Synthese und die κB-kontrollierte Transkriptionsaktivität in HUVEC induziert
werden, wohingegen der TLR2/TLR1-Agonist Pam3CSK4 weder die
CXCL8-Expression noch die κB-abhängige Luciferaseaktivität induzierte (Abbildung
4.23 (A), links und (B)). Ebensowenig konnten die TLR2/TLR6-Agonisten MALP-2
und FSL-1 die Expression von CXCL8 in HUVEC induzieren. Der Grund für die
ausbleibende Aktivierung der HUVEC durch Pam3CSK4, MALP-2 und FSL-1 waren
nicht die Präparationen der Agonisten selber, da diese bei Kontrollversuchen mit der
TLR2- und TLR4-positiven Monozyten-Zelllinie THP-1 in gleicher Konzentration zu
einer starken CXCL8-Expression führten (Abbildung 4.23 (A), rechts). Diese
Beobachtungen deuteten darauf hin, dass HUVEC zumindest unter den vorliegenden
Kulturbedingungen keine funktionellen TLR2 Rezeptoren an der Zelloberfläche
exprimieren, und dass folglich eine C. albicans-induzierte Stimulation nicht über
diesen Rezeptor vermittelt sein kann.
Abbildung 4.23 Funktionelle Untersuchung der TLR2- und TLR4-Expression in HUVEC. HUVEC
bzw. THP-1 wurden für acht Stunden mit dem TLR4-Agonisten LPS (100 ng/ml), dem
TLR2/TLR1-Agonisten Pam3CSK4 (200 ng/ml) oder den TLR2/TLR6-Agonisten MALP-2 (100 ng/ml)
und FSL-1 (100 ng/ml) stimuliert. Die Überstände der Zellkulturen wurden anschließend mittels ELISA
auf CXCL8 untersucht. Drei unabhängige Versuche wurden hier gemittelt und mit Standardfehlern
dargestellt (A). HUVEC wurden für einen Promoter-Reporter-Assay mit einem 6xκB-abhängigen
Luciferasekonstrukt transfiziert und wie unter (A) beschrieben mit LPS bzw. Pam3CSK4 stimuliert. Die
Auswertung erfolgte über die Messung der Luciferaseaktivität im Luminometer. Dargestellt ist ein
repräsentativer Versuch (B).
75

Die Expression der Toll-like Rezeptoren TLR2 und TLR4 wurde nochmals überprüft,
indem die Rohwerte der Hybridisierungssignale der mit unstimulierten HUVEC
durchgeführten Oligonukleotid-Mikroarrays für diese Gene mittels MAS 5.0-Software
ausgewertet wurden. Ebenso wurde die Expression von TLR6, Dectin-1 und
Mannoserezeptor 1 überprüft. Als Positivkontrollen wurden die Signale von MyD88
und IRAK1 herangezogen. Die Auswertung zeigte deutlich, dass die untersuchten
HUVEC MyD88, IRAK1 und TLR4 exprimierten (Abbildung 4.24, graue Balken),
jedoch nicht TLR2, TLR6, Dectin-1 und Mannoserezeptor 1 (schwarze Balken). Die
gestrichelte Linie zeigt die durch MAS-Algorithmus berechnete Expressionsschwelle
an, die die Hintergrundbereinigung der Rohdaten und unspezifische Bindungen
berücksichtigt.
Abbildung 4.24 Relative Expression verschiedener PRRs in HUVEC untersucht im
Oligonukleotid-Mikroarray. Die Rohdaten der Hybridisierungsintensitäten für verschiedene Mustererkennende
Rezeptoren in unstimulierten HUVEC wurden mit Hilfe der MAS 5.0 Software ausgewertet
und als Mittelwerte mit Standardabweichung (± SD) aus vier unabhängigen Versuchen dargestellt. Die
Höhe der Hybridisierungssignale gibt Auskunft über die Expressionshöhe des jeweiligen Rezeptors im
Untersuchungsmaterial. Während TLR4 deutlich exprimiert ist, fehlen TLR2, TLR6, Dectin-1 und
Mannoserezeptor 1 (MRC1). IRAK1 und MyD88 dienen als positive Expressionskontrollen.
Die Rolle von TLR2 und TLR4 bei der Vermittlung des Candida-induzierten Signals
sollte anhand von etablierten Zelllinien weiter geklärt werden. Dazu wurden HEK293-
Wildtypzellen (HEK293 WT) untersucht, die weder endogene TLR2- noch
TLR4-Rezeptoren exprimierten, sowie transgene HEK293-Zelllinien, die entweder
humane TLR1- und TLR2-Rezeptoren (HEK293-hTLR1/2) oder humane TLR4
zusammen mit CD14 und MD-2 (HEK293-hTLR4) stabil exprimierten.
Die Expression der Rezeptoren auf der Oberfläche dieser kommerziell erworbenen
Zellen konnte mittels FACS-Analyse bestätigt werden. Dafür wurden die drei
76

HEK293-Zelllinien jeweils mit spezifischen Antikörpern gegen TLR2 und TLR4
gefärbt. Bei HEK293 Wildtypzellen konnte keiner der beiden TLR-Rezeptoren
nachgewiesen werden. HEK293-hTLR1/2 hingegen exprimierten den stabil
transfizierten TLR2, und HEK293-hTLR4 waren stark positiv für TLR4 (Abbildung
4.25 (A) und (B)).
Abbildung 4.25 Durchflusszytometrische Untersuchung der TLR2- und TLR4-Expression auf
HEK293. HEK293, HEK293-hTLR1/2 und HEK293-hTLR4 wurden im Durchflußzytometer auf die
Expression der membranständigen Rezeptoren TLR2 und TLR4 untersucht. Dafür wurden die Zellen
mit einem entsprechenden Primärantikörper bzw. mit IgG als Isotypkontrolle markiert und mit einem
Cy5-gekoppelten Sekundärantikörper gefärbt. Die Fluoreszenz des Cy5-Farbstoffs wurde im vierten
Kanal (FL-4) gemessen. Dargestellt sind in (A) Overlay-Histogramme der Anti-TLR2-Färbungen bzw.
in (B) der Anti-TLR4-Färbungen (rot) jeweils mit der Isotypenkontrolle (schwarz).
Die getesteten HEK293-Zelllinien wurden dann für weiterführende
Stimulationsversuche verwendet. HEK293-Wildtypzellen sprachen dabei weder auf
eine Stimulation mit Pam3CSK4 noch mit LPS an (Abbildung 4.26 (A) und (B), links),
wohingegen HEK293-hTLR1/2 nach Stimulation mit Pam3CSK4, nicht aber mit LPS,
große Mengen an CXCL8 produzierten und eine starke κB-abhängige
Luciferaseaktivität entwickelten (Abbildung 4.26 (A) und (B), Mitte). HEK293-hTLR4
zeigten eine erhöhte CXCL8-Expression und eine κB-vermittelte Luciferaseaktivität
nach Exposition mit LPS, während Pam3CSK4 keinen Effekt hatte (Abbildung 4.26
(A) und (B), rechts).
Bei keiner der drei Zelllinien konnte eine Stimulation mit C. albicans die Expression
von CXCL8 oder eine gesteigerte κB-abhängige Luciferaseaktivität induzieren.
77

Abbildung 4.26 C. albicans induziert keine CXCL8-Expression und keine κB-abhängige
Transkriptionsaktivität in TLR1/2- oder TLR4-positiven HEK293. HEK293 Zellen und deren stabile
Transfektanten mit TLR1 und TLR2 (HEK293-hTLR1/2) bzw. TLR4/CD14/MD-2 (HEK293-hTLR4)
wurden mit C. albicans (MOI=1), LPS (100 ng/ml) oder Pam3CSK4 (200 ng/ml) über acht Stunden
stimuliert. Die Überstände der Zellkulturen wurden im ELISA auf CXCL8 untersucht (A). Die gezeigten
Daten wurden aus 3 unabhängigen Versuchen gemittelt. Die gleichen Zellen wie unter (A)
beschrieben wurden für einen Promoter-Reporter-Assay mit einem κB-Promoter-abhängigen Firefly-
Luciferasekonstrukt und einem Ubiquitin-abhängigen Renilla-Luciferasekonstrukt transfiziert.
48 Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen stimuliert und auf Luciferaseaktivität untersucht
(B). Die Daten sind auf Renilla-Luciferaseaktivitäten normierte Mittelwerte aus drei unabhängigen
Versuchen ± Standardfehler.
Die Beobachtung, dass TLR4 nicht an der Signalvermittlung von C. albicans beteiligt
ist, wurde zusätzlich durch die Ergebnisse von TLR4-Knock-down-Versuchen in
HUVEC gestützt. Hierfür wurde in HUVEC mittels Transfektion einer kommerziell
erworbenen siRNA unter Verwendung des Transfektionsreagenzes Oligofectamine
der endogene TLR4-Rezeptor herunterreguliert. Die CXCL8-Expression in diesen
Zellen war nach Stimulation mit C. albicans im Vergleich zu Kontroll-siRNA-
78

transfizierten Zellen kaum beeinflusst, wohingegen eine Stimulation dieser Zellen mit
dem TLR4-Agonisten LPS verglichen mit den Kontrollzellen zu deutlich niedrigeren
CXCL8-Konzentrationen im Zellkulturüberstand und im Totalzelllysat führte. Wie
erwartet führte die Stimulation mit TNFα sowohl in den Kontroll-siRNA- als auch den
siRNA TLR4-transfizierten Zellen zu einer unbeeinflusst hohen CXCL8-Expression
(Abbildung 4.27 (A) und (B)).
Abbildung 4.27 Der Knock-down von TLR4 in HUVEC hemmt nicht die C. albicans-induzierte
CXCL8-Expression. HUVEC wurden mithilfe von Oligofectamine mit einer siRNA gegen TLR4 bzw.
einer Kontroll-siRNA transfiziert. Die Zellen wurden 48 Stunden später für acht Stunden mit
C. albicans (MOI=1), LPS (100 ng/ml) oder TNFα (2 ng/ml) stimuliert. Die Überstände aus drei
unabhängigen Versuchen wurden im CXCL8-ELISA untersucht (A). Dargestellt sind die normierten
Mittelwerte und Standardfehler. Die Totalzelllysate der stimulierten Zellen wurden im Western Blot auf
CXCL8 untersucht. Zur Ladekontrolle wurde eine Färbung von ERK2 durchgeführt (B). Gezeigt ist ein
repräsentativer Versuch.
All diese bisherigen Daten bieten keinerlei Hinweise dafür, dass TLR2 oder TLR4
entscheidend an der Candida-vermittelten NF-κB-abhängigen Genexpression in
HUVEC oder HEK293-Zellen beteiligt sind.
4.5.2 MyD88 und IRAK1 sind entscheidend an der Weiterleitung des Candidainduzierten
Signals in HUVEC beteiligt
Die Signaltransduktion über die meisten Rezeptoren der Toll/IL-1 Rezeptor-
Superfamilie benötigt die Rekrutierung des Adaptermoleküls MyD88 an den Rezeptor
und die anschließende Phosphorylierung der IL-1 Rezeptor-assoziieren Kinase 1
79

(IRAK1), um in eine Aktivierung von NF-κB zu münden. MyD88 und IRAK1 sind also
funktionell am „Flaschenhals“ der TLR-abhängigen Signaltransduktion lokalisiert. Zur
Klärung der Rolle dieses Signalweges bei der Candida-induzierten Aktivierung von
Endothelzellen sollten daher diese beiden Moleküle mittels RNA-Interferenz
ausgeschaltet werden bzw. deren Funktion durch die retroviral vermittelte Expression
von dominant-negativen Mutanten gehemmt werden (vgl. Abbildungen 1.2 und 3.3).
Zunächst sollten MyD88 oder IRAK1 über small hairpin RNA (shRNA), vermittelt
durch den retroviralen Vektor pRetroSuper (pRS), ausgeschaltet werden. Dafür
wurden mehrere Konstrukte für unterschiedliche shRNA in den Vektor kloniert und
zur funktionellen Testung in U2OS-Testzellen transfiziert. Durch routinemäßige
Knock-down-Kontrollen mittels Western Blot gelang es, unter diesen
shRNA-Konstrukten eine funktionell zufriedenstellende shRNA zu finden, die einen
guten Knock-down des IRAK1-Proteins in den U2OS erreichte (Daten nicht gezeigt).
Parallel wurde eine funktionelle Testung der shRNA durchgeführt, indem der für die
shRNA gegen IRAK1 codierende Vektor (pRS-IRAK1) bzw. der leere Vektor
(pRS LV) in HEK293-hTLR1/2 und in HEK293-hTLR4 transfiziert wurden. Im
6xκB-abhängigen Promoter-Reporter-Assay konnte beobachtet werden, dass
pRS-IRAK1-transfizierte und mit Pam3CSK4-stimulierte HEK293-hTLR1/2 deutlich
weniger κB-abhängige Transkriptionsaktivität zeigten als solche, die mit pRS LV
transfiziert und ebenso mit Pam3CSK4 stimuliert worden waren (Abbildung 4.28,
links). Die gleiche Beobachtung konnte für LPS-stimulierte HEK293-hTLR4 gemacht
werden. Auch hier zeigten die pRS-IRAK1-transfizierten Zellen eine deutlich
verringerte Transkriptionsaktivität gegenüber pRS LV-transfizierten Zellen (Abbildung
4.28, rechts). Wie schon zuvor gezeigt (Abbildung 4.26 (B)), konnte in keiner der
beiden Zelllinien mit C. albicans eine gesteigerte Transkriptionsaktivität induziert
werden.
80

Abbildung 4.28 Eine shRNA gegen IRAK1 hemmt die TLR2- und TLR4-vermittelte κB-abhängige
Transkription. HEK293-hTLR1/2 und HEK293-hTLR4 wurden transient mit dem retroviralen Vektor
pRetroSuper (pRS) bzw. dem Vektor mit der shRNA gegen IRAK1 (pRS-IRAK1) zusammen mit einem
6xκB-Promoter-abhängigen Firefly-Luciferasekonstrukt und einem Ubiquitin-abhängigen Renilla-
Luciferasekonstrukt transfiziert. Nach 48 Stunden wurden die transfizierten HEK293-hTLR1/2 für acht
Stunden mit Pam3CSK4 (200 ng/ml), C. albicans (MOI=1) oder nur mit Medium als Kontrolle
behandelt (links). Die transfizierten HEK293-hTLR4 wurden mit LPS (100 ng/ml), C. albicans oder
Medium behandelt. Anschließend wurden die Zellen lysiert und ihre Lumineszenz gemessen. Die
erhaltenen Firefly-Luciferasewerte wurden mittels der Renilla-Luciferasewerte auf gleiche Zellzahlen
normiert und das Ergebnis auf die Werte der unstimulierten Kontrollen bezogen. Die dargestellten
Daten sind Mittelwerte und Standardfehler aus drei unabhängigen Versuchen.
Diese funktionell getestete shRNA gegen IRAK1 wurde für weitere Untersuchungen
in die retrovirale Verpackerzelllinie FLYRD-18 transfiziert, die einen besonders hohen
Virustiter erzielt. Durch retrovirale Infektion wurde die shRNA dann stabil in HUVEC
exprimiert. Nach Selektion der infizierten Zellen wurden diese mit IL-1β, TNFα und
C. albicans stimuliert. Die Expression der shRNA führte in HUVEC zu einem nahezu
kompletten Knock-down des IRAK1-Proteins. Wie erwartet war die IL-1β-induzierte
CXCL8-Expression nach dem Knock-down von IRAK1 größtenteils gehemmt,
wohingegen die unabhängig von IRAK1 regulierte, TNFα-induzierte Expression des
Chemokins nicht beeinflusst wurde. Der Knock-down von IRAK1 in C. albicansstimulierten
HUVEC bewirkte, dass die Candida-induzierte CXCL8-Synthese fast
vollständig unterblieb (Abbildung 4.29 (A)). Ähnliche Beobachtungen wie im Western
Blot konnten für die CXCL8-Expression auch mittels ELISA gemacht werden
(Abbildung 4.29 (B), links). Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass auch die
Expression von CCL20 in den IRAK1-herunterregulierten HUVEC gehemmt war
(Abbildung 4.29 (B), rechts).
81

Abbildung 4.29 Ein Knock-down von IRAK1 durch shRNA hemmt die C. albicans-induzierte
Expression von CXCL8 und CCL20 in HUVEC. (A) HUVEC wurden mit dem retroviralen Vektor
pRetroSuper (pRS) bzw. dem Vektor mit dem shRNA-Konstrukt gegen IRAK1 (pRS-IRAK1) infiziert.
Nach dreitägiger Selektion wurden die Endothelzellen mit IL-1β (10 U/ml), TNFα (2 ng/ml) oder
C. albicans (MOI=1) stimuliert oder als Kontrolle nur mit Medium behandelt. Die Zellen wurden nach
acht Stunden Stimulation lysiert und im Western Blot untersucht. Die Expression von IRAK1 und
CXCL8 wurde mit den entsprechenden Antikörpern untersucht, zur Überprüfung einer gleichen
Beladung der Banden wurde der Blot gegen ERK2 gefärbt. (B) Die Zellkulturüberstände von mit
pRS scrambled bzw. pRS-IRAK1 infizierten HUVEC, die wie unter (A) beschrieben stimuliert worden
waren, wurden mittels ELISA auf CXCL8 untersucht (links). Parallel zu den Überständen wurden die
Totalzelllysate mittels CCL20-ELISA getestet (rechts). Dargestellt ist jeweils ein repräsentativer
Versuch von drei unabhängigen Versuchen.
MyD88 wurde mit Hilfe eines kommerziell erhältlichen, validierten siRNA-
Oligonukleotids herunterreguliert. Dafür wurde diese siRNA bzw. als Kontrolle eine
unspezifische, Alexa Fluor 488-gekoppelte siRNA (scrambled siRNA) in HUVEC
transfiziert. Zwei Tage nach der Transfektion wurden zur Transfektionskontrolle die
mit scrambled siRNA transfizierten Zellen im Fluoreszenzmikroskop untersucht. Eine
deutliche, intrazelluläre Fluoreszenz konnte in mehr als 90 % der Zellen beobachtet
werden (Daten nicht gezeigt). Anschließend wurden die HUVEC mit IL-1β, TNFα
oder C. albicans stimuliert. Sowohl die Kulturüberstände als auch die Totalzelllysate
wurden nach achtstündiger Stimulationsdauer gewonnen und ausgewertet. Obwohl
eine zufriedenstellende Färbung des MyD88-Proteins trotz Verwendung
82

unterschiedlicher Antikörper im Western Blot nicht gelang, konnte der Hemmeffekt
der Depletion auf die read-out-Moleküle CXCL8 und CCL20 nach Stimulation der
HUVEC durch IL-1β (Positivkontrolle) und C. albicans im Western Blot und im ELISA
beobachtet werden (Abbildung 4.30 (A) und (B)). Die Stimulation mit TNFα diente als
Negativkontrolle und führte unabhängig von der transfizierten siRNA zu einer
gleichbleibend hohen CXCL8-Expression (Abbildung 4.30 (A)).
Abbildung 4.30 Die Depletion von MyD88 durch siRNA hemmt die C. albicans-induzierte
Expression von CXCL8 und CCL20 in HUVEC. (A) HUVEC wurden unter Verwendung des
Transfektionsreagenzes Oligofectamine mit einer validierten siRNA gegen MyD88 oder einer
unspezifischen siRNA (scrambled siRNA) transfiziert und 48 Stunden später für acht Stunden mit
IL-1β (10 U/ml), TNFα (2 ng/ml) oder C. albicans (MOI=1) stimuliert. Die daraus gewonnenen
Totalzelllysate wurden mittels Western Blot auf CXCL8 untersucht. Als Ladekontrolle diente eine
Färbung von ERK2. Gezeigt ist ein repräsentativer Versuch von drei unabhängigen Versuchen.
(B) HUVEC wurden wie in (A) beschrieben transfiziert und stimuliert. Die Zellkulturüberstände wurden
mittels ELISA auf CXCL8 untersucht. Der Gehalt an CCL20 in den Totalzelllysaten wurde mittels
ELISA ermittelt und unter Berücksichtigung der Proteinkonzentrationen der einzelnen Proben
berechnet. Dargestellt sind die Mittelwerte und Standardfehler aus drei (links) bzw. zwei (rechts)
unabhängigen Versuchen.
Als weiterer Beleg für die Beteiligung von MyD88 und IRAK1 an der C. albicansvermittelten
Aktivierung von HUVEC wurden zwei Konstrukte verwendet, die für
dominant-negative Mutanten dieser Proteine kodieren (MyD88dn-Myc und
IRAK1-DD-HA). Beide Konstrukte wurden dafür in den retroviralen Vektor
pCFG5-IEGZ kloniert und anschließend über die Verpackerzelllinie ΦNX ampho in
83

HUVEC transfiziert. Infizierte HUVEC wurden vor der achtstündigen Stimulation mit
IL-1β oder C. albicans für drei Tage mit 250 µg/ml Zeozin selektioniert. Die
Zeozinresistenz der Zellen wurde über den transfizierten Vektor vermittelt.
Die durch die Stimuli in Leervektor-infizierten Zellen vermittelte Expression von
CXCL8 und CCL20 konnte durch die Überexpression der dominant-negativen
Mutanten annähernd komplett gehemmt werden (Abbildung 4.31 (A) und (B)).
Abbildung 4.31 Die retroviral vermittelte Expression von dominant-negativen Mutanten von
MyD88 bzw. IRAK1 hemmt die C. albicans-induzierte Expression von CXCL8 in HUVEC. HUVEC
wurden mit dem retroviralen Vektor pCFG5-IEGZ bzw. den durch diesen Vektor vermittelten Mutanten
von MyD88 (pCFG5-IEGZ MyD88dn-Myc) oder IRAK1 (pCFG5-IEGZ IRAK1-DD-HA) infiziert. Ein Teil
der über drei Tage mit Zeozin (250 µg/ml) selektionierten Zellen wurden zur Expressionskontrolle
lysiert und mittels Western Blot auf exprimiertes Myc-markiertes MyD88dn bzw. HA-markiertes
IRAK1-DD untersucht ((A) und (B), jeweils rechts oben). Die HUVEC wurden für acht Stunden mit
IL-1β (75 U/ml) oder C. albicans (MOI=1) stimuliert. Die Kulturüberstände wurden mittels
CXCL8-ELISA getestet (A), die Totalzelllysate wurden ebenfalls mittels ELISA auf CCL20
untersucht (B). Eine Basalaktivierung der Zellen, die vermutlich durch die retrovirale Infektion und die
lange Kultivierung hervorgerufen wurde, wurde zur besseren Vergleichbarkeit der Daten
herausgerechnet. Die dargestellten Werte sind Mittelwerte und Standardfehler aus drei unabhängigen
Versuchen.
84

Die deutliche Abhängigkeit der C. albicans-vermittelten, NF-κB-abhängigen
endothelialen Genexpression von MyD88 und IRAK1 lässt auf eine Signalerkennung
durch einen Toll-like Rezeptor schließen. Dieser Rezeptor scheint aber weder TLR2
noch TLR4 zu sein, die beide als beteiligte Rezeptoren an der Erkennung des
Candida-Signals in anderen Modellsystemen beschrieben wurden.
4.6 TLR3 ist an der C. albicans-induzierten CXCL8-Expression in HUVEC
beteiligt
Zur weiteren Klärung der Signalerkennung wurde im Folgenden die mögliche
Beteiligung anderer Rezeptoren untersucht. Es wurden dazu kommerziell erworbene,
validierte siRNA-Oligonukleotide gegen verschiedene Rezeptoren verwendet (TLR3,
TLR4, TLR9, NOD-1). Einen hemmenden Einfluss auf die C. albicans-induzierte
CXCL8-Expression konnte nur bei der Verwendung der siRNA gegen TLR3
beobachtet werden (Daten nicht gezeigt).
Kürzlich wurde von Morris et al. gezeigt, dass TLR3 eine proinflammatorische
Genexpression in Endothelzellen als Antwort auf den etablierten TLR3-Agonisten
Poly(I:C) vermittelt (Morris et al., 2006). Poly(I:C) (Polyinosin-polycytidylsäure) ist ein
synthetisches Analogon einer Doppelstrang-RNA und wurde als spezifischer Ligand
für TLR3 beschrieben. Poly(I:C) wurde daher für die Untersuchung verwendet, ob
unter den vorliegenden Kulturbedingungen funktionelle TLR3 in HUVEC vorhanden
sind. HUVEC wurden für acht Stunden mit verschiedenen Konzentrationen an
Poly(I:C) stimuliert. Als Positivkontrolle wurden HUVEC parallel auch mit IL-1β
stimuliert. Die Totalzelllysate dieser Zellen wurden im Western Blot auf ihren Gehalt
an CXCL8 untersucht, wobei eine konzentrationsabhängige CXCL8-Expression nach
Poly(I:C)-Stimulation beobachtet werden konnte (Abbildung 4.32). Dieses Ergebnis
bestätigt das Vorkommen funktioneller TLR3 in HUVEC.
85

Abbildung 4.32 HUVEC exprimieren funktionelle TLR3. HUVEC wurden für acht Stunden mit den
angegebenen Konzentrationen an Poly(I:C) bzw. mit IL-1β (100 U/ml) stimuliert. Die Totalzelllysate
wurden mittels Western Blot auf ihren Gehalt an CXCL8 untersucht. Eine Färbung von ERK2 diente
als Ladekontrolle. Gezeigt ist ein repräsentativer Versuch.
Zur Abhängigkeit der TLR3-Signaltransduktion von MyD88 gibt es in der Literatur
kontroverse Meinungen (reviewed in (Akira and Takeda, 2004)). Daher sollte für das
verwendete in vitro-System überprüft werden, ob die TLR3-vermittelte,
Poly(I:C)-induzierte CXCL8-Expression des Adaptermoleküls MyD88 bedarf. Durch
Transfektion der validierten siRNA gegen MyD88 wurde das MyD88-Protein
herunterreguliert und die Zellen anschließend mit C. albicans, Poly(I:C) oder LPS als
Positivkontrolle stimuliert. Die gleichen Stimulationen wurden bei Zellen durchgeführt,
die mit Kontroll-siRNA transfiziert worden waren. Alle Zellkulturüberstände und
Totalzelllysate wurden auf ihren Gehalt an CXCL8 untersucht (Abbildung 4.33 (A)
und (B)). Sowohl im ELISA als auch im Western Blot konnte eine deutlich niedrigere
CXCL8-Expression der siRNA MyD88-transfizierten Zellen nach Poly(I:C)-Stimulation
beobachtet werden. Wie erwartet resultierte in den MyD88-depletierten Zellen die
LPS-Stimulation in einer reduzierten CXCL8-Expression im Gegensatz zu den
Kontrollzellen. Auch die CXCL8-Expression nach Stimulation mit C. albicans war, wie
schon zuvor gezeigt (vgl. Abbildung 4.30), in diesen Zellen deutlich gehemmt.
86

Abbildung 4.33 Die Poly(I:C)-induzierte, TLR3-vermittelte Expression von CXCL8 ist teilweise
abhängig von MyD88. HUVEC wurden mittels Oligofectamine-Transfektionsreagenz mit einer siRNA
gegen MyD88 bzw. einer Kontroll-siRNA transfiziert. Nach 48 Stunden wurden die transfizierten Zellen
für acht Stunden mit C. albicans (MOI=1), Poly(I:C) (1 µg/ml) oder LPS (100 ng/ml) stimuliert. Die
Zellkulturüberstände wurden mittels CXCL8-ELISA untersucht (A). Der Gehalt an CXCL8 der
Totalzelllysate wurde im Western Blot überprüft, als Ladekontrolle diente eine ERK2-Färbung (B). Die
in (A) gezeigten Daten sind Mittelwerte und Standardfehler aus drei unabhängigen Versuchen, in (B)
ist ein repräsentativer Versuch von zwei unabhängigen Versuchen dargestellt.
Schließlich sollte untersucht werden, ob die Candida-induzierte proinflammatorische
Genexpression in HUVEC tatsächlich über TLR3 vermittelt wird. Während der
Knock-down von TLR3 durch Transfektion einer spezifischen siRNA keinen Effekt
auf die TNFα-induzierte CXCL8-Expression hatte (Negativkontrolle), konnte die
CXCL8-Expression nach Stimulation mit Poly(I:C) fast komplett gehemmt werden
(Positivkontrolle). Die Stimulation mit C. albicans führte in den TLR3-
herunterregulierten Zellen zu einer deutlich reduzierten CXCL8-Expression im
Vergleich zu den Kontrollzellen (Abbildung 4.34 (A) und (B)).
87

Abbildung 4.34 Der Knock-down von TLR3 in HUVEC hemmt teilweise die C. albicansinduzierte
CXCL8-Expression. HUVEC wurden mittels Oligofectamine mit siRNA gegen TLR3 bzw.
einer Kontroll-siRNA transfiziert. Die transfizierten Zellen wurden für acht Stunden mit C. albicans
(MOI=1), Poly(I:C) (1 µg/ml) oder TNFα (2 ng/ml) stimuliert. Anschließend wurden sowohl die
Zellkulturüberstände mittels ELISA (A), als auch die Totalzelllysate mittels Western Blot auf CXCL8
untersucht (B). Die Färbung der Western Blot-Membran auf ERK2 diente der Überprüfung einer
gleichmäßigen Beladung. In (A) sind die Ergebnisse von drei unabhängigen Versuchen
zusammengefasst (Mittelwerte und Standardfehler), (B) zeigt einen repräsentativen Versuch von zwei
unabhängigen Versuchen.
Zusammengefasst zeigen diese letzten Daten, dass die proinflammatorische Antwort
von HUVEC auf eine Infektion mit C. albicans zumindest teilweise von
Toll-like Rezeptor 3 abhängig ist.
88

5 Diskussion
Die Interaktion von humanen Endothelzellen mit dem pathogenen Hefepilz
Candida albicans ist eines der frühesten Ereignisse im Rahmen einer Candidämie
beim Menschen. In einem in vitro-Modell wurde hier systematisch das zelluläre
Reaktionsmuster von HUVEC nach Exposition mit diesem fakultativ
krankheitserregenden Opportunisten analysiert. Zudem konnten die durch den Pilz
induzierten Signalwege und TLR3 als der für die Perzeption des Signals
verantwortliche Rezeptor identifiziert werden.
5.1 Das durch C. albicans induzierte Transkriptom primärer humaner
Endothelzellen
In der vorliegenden Arbeit wurde zum ersten Mal das globale Genexpressionsprofil
von primären humanen Endothelzellen nach Exposition mit C. albicans untersucht.
Dieser Zelltyp spielt im Verlauf von Candidämien und invasiven Candida-Mykosen
eine essentielle Rolle für die Immunantwort des Wirtes auf die Infektion.
Endothelzellen exprimieren nach Kontakt mit dem pathogenen Keim eine
bedeutende Anzahl von chemotaktischen Zytokinen und Oberflächenmolekülen, die
den weiteren Verlauf der spezifischen Abwehr des Pathogens beeinflussen.
Andererseits kann eine übermäßige Ausschüttung proinflammatorischer Stoffe zu
einer überschießenden Entzündungsreaktion (Sepsis) führen, die lebensbedrohlich
und in ungünstigen Fällen sogar letal sein kann.
Es gibt eine ganze Reihe von publizierten Mikroarray-Untersuchungen, die sich mit
der Charakterisierung des C. albicans-Genoms unter verschiedensten Bedingungen
befassen. Bisher wurden aber nur sehr wenige Studien veröffentlicht, die sich auf die
Veränderung des Genoms von Wirtszellen durch eine Candida-Infektion fokussieren.
Für einige dieser Untersuchungen wurden andere Stämme von C. albicans
verwendet (hier: Candida albicans SC3514), und keine dieser Untersuchungen
wurde mit Endothelzellen durchgeführt. Deren Beteiligung an der angeborenen
Immunabwehr gegen C. albicans ist auf der Ebene der Transkription kaum
untersucht.
Zu den wenigen Publikationen von Genexpressionsprofilen humaner Wirtszellen
nach Infektion mit C. albicans zählt eine Arbeit von Fradin et al. Darin wurde
89

untersucht, welche Auswirkungen die verschiedenen morphologischen Formen bzw.
UV-behandelte Blastosporen von C. albicans auf das Transkriptom von
polymorphonukleären Leukozyten haben (Fradin et al., 2007). Es wurde unter
anderem gezeigt, dass eine einstündige Co-Kultur mit UV-behandelten (abgetöteten)
Candida-Blastosporen kaum das Wirtsgenom der polymorphonukleären Leukozyten
verändert, wohingegen lebende Hyphen und Hefen zur Regulation einer großen
Anzahl von Genen führen. Diese Beobachtung ist trotz der unterschiedlichen
Versuchsbedingungen gleichläufig mit der in dieser Arbeit vorgestellten Aussage,
dass nur lebende, nicht aber tote C. albicans die proinflammatorische Antwort von
HUVEC verursachen.
Vor dem Hintergrund der diskutierten Beteiligung von TLR2 und TLR4 an der
Erkennung des Candida-vermittelten Signals durch die Wirtszelle ist interessant,
dass weder in der oben genannten Arbeit noch in der Studie von Kim et al. (Kim et
al., 2005), in der in einer Zeitkinetik das Transkriptom von humanen Monozyten nach
Co-Kultur mit C. albicans untersucht wurde, diese beiden Rezeptoren zu den
regulierten Genen gehörten. Auch befindet sich keines der beiden Gene unter den im
Rahmen der vorliegenden Arbeit gefundenen regulierten endothelialen Gene.
Allerdings wurde auch das Gen, das für TLR3 kodiert, nicht signifikant reguliert. Die
Signalvermittlung läuft also vermutlich auf posttranslationaler Ebene ohne eine
erhöhte Expression dieser Gene ab. Dafür spricht auch, dass in keiner der
genannten Untersuchungen die Genexpression von anderen Molekülen der NF-κB-
Kaskade, die eine wichtige Rolle bei der TLR-vermittelten Signaltransduktion spielt,
signifikant erhöht war.
Im untersuchten Zeitfenster von 18 Stunden fanden die Autoren Kim et al. eine große
Anzahl von positiv regulierten Genen, die für Zytokine und Chemokine kodieren.
Annähernd alle Gene zeigten eine maximale Expression zum Zeitpunkt sechs
Stunden. Der überwiegende Anteil dieser Gene findet sich ebenfalls unter den
hochregulierten Genen der vorliegenden Studie, was den hier gewählten Zeitpunkt
von fünf Stunden Co-Kultur von Endothelzellen und C. albicans als günstig bestätigt.
Mittels Oligonukleotid-Mikroarray-Analyse konnten 56 Gene identifiziert werden, die
während einer fünfstündigen Co-Kultur von HUVEC mit C. albicans deutlich
hochreguliert wurden. Daneben wurden 69 Gene gefunden, die unter den gleichen
90

Bedingungen in HUVEC herunterreguliert wurden (vgl. Tabellen 6.1 und 6.2 im
Anhang). Alle signifikant regulierten Gene wurden funktionellen Klassen zugeordnet,
um eine bessere Übersicht über die regulierten Prozesse zu erhalten
(Abbildung 4.1). Bei dieser Auswertung wird deutlich, dass ein großer Anteil der
induzierten Gene für Proteine kodiert, die im Zusammenhang mit der angeborenen
Immunantwort stehen. Die meisten Gene konnten der Gruppe
„Chemotaxis/Immunantwort“ zugeordnet werden. Mehr als die Hälfte der darin
zusammengefassten Gene sind Chemokine und Oberflächenrezeptoren. Ebenfalls
stark repräsentiert sind die Gruppen „Signaltransduktion“, „Apoptose/Zellproliferation“
und „Metabolismus“. In die gleiche Richtung wie die „manuelle“ Zuordnung weisen
die Ergebnisse der zusätzlichen bioinformatischen Auswertung. Hiermit konnten
diejenigen Gengruppen (GO (gene ontology)-Gruppen) identifiziert werden, deren
zugehörige Gene signifikant reguliert wurden. In Bezug auf die Gesamtheit der auf
dem Chip repräsentierten Gene wurden durch Candida überproportional viele Gene
der GO-Gruppen „Chemotaxis/Migration“, „Zelltod/Zellwachstum“ und „Signaling“
induziert (Abbildung 4.2).
Insgesamt wurden 6 hochregulierte Chemokine identifiziert, von denen 5 der
Rekrutierung von Neutrophilen an den Ort des Infektionsgeschehens dienen.
Neutrophile spielen eine Schlüsselrolle bei der Abwehr von Pilzinfektionen (Urban et
al., 2006). Somit deutet das ermittelte Chemokinexpressionsmuster stark darauf hin,
dass Endothelzellen am komplexen Zusammenspiel der Abwehr von pathogenen
Pilzen entscheidend beteiligt sind. Zu den durch C. albicans induzierten Chemokinen
gehören das bereits früher im Zusammenhang mit Pilzinfektionen beschriebene
CXCL8 (IL-8) (Orozco et al., 2000) ebenso wie CXCL1 (Groα), CXCL2 (Groβ),
CXCL3 (Groγ) und die durch quantitative real-time PCR gefundenen Chemokine
CXCL5 (ENA78) und CXCL6 (GCP-2). Die letztgenannten Chemokine waren bislang
nicht als Candida-regulierte Gene bekannt. Alle im Mikroarray gefundenen
Chemokine konnten durch die alternative Methode der quantitativen real-time PCR
bestätigt werden. Dieses Ergebnis unterstreicht die Verlässlichkeit der Mikroarray-
Daten und des gewählten Ansatzes der statistischen Auswertung. Die Anlockung von
Neutrophilen ist vor dem Hintergrund des raschen und invasiven Wachstums von
Candida von besonderer Bedeutung. Die Aufgabe von Neutrophilen im Rahmen der
angeborenen Immunabwehr besteht in der schnellen Bekämpfung von pathogenen
91

Erregern durch Phagozytose. Außerdem kommt es durch Exozytose zur
Ausschüttung u. a. von sauren Hydrolasen, Defensinen, Plasminogenaktivatoren und
neutralen Proteasen aus ihren Granula, die auf den invadierenden Keim toxisch
wirken. Über diese Mechanismen tragen Neutrophile erheblich zur wirtsspezifischen
Immunabwehr bei (Segal, 2005). Die zentrale Rolle der Neutrophilen bei der
Bekämpfung von invasiven Candida-Infektionen zeigt sich bei Patienten mit einer
krankhaft verminderten Anzahl von Neutrophilen im Blut, einer sogenannten
Neutropenie. Unabhängig von ihrer Ursache ist bei neutropenischen Patienten neben
anderen mikrobiellen Infektionen auch das Vorkommen von Candida-Infektionen
auffällig erhöht (Betts et al., 2006; Raman and Marik, 2006). Eine Neutropenie stellt
für Candidämie-Patienten immer einen Indikator für eine schlechte Verlaufsprognose
dar. Das sechste durch Candida induzierte Chemokin ist CCL20 (MIP-3α). Es gehört
zu einer Untergruppe von Chemokinen, die eine Defensin-artige antimikrobielle
Aktivität besitzen (Yang et al., 2003). Zudem ist CCL20 ein potentes chemotaktisch
wirkendes Zytokin für dendritische Vorläuferzellen und koppelt somit das angeborene
mit dem erworbenen Immunsystem (Dieu-Nosjean et al., 2000).
Neben den Chemokinen bilden in der Mikroarray-Analyse auch die
Oberflächenrezeptoren eine stark repräsentierte Gruppe innerhalb der
hochregulierten Gene. Oberflächenrezeptoren können bei entzündlichen Prozessen
vielfältige Aufgaben wahrnehmen und damit die Art und das Ausmaß der
Immunantwort mitbestimmen. Zu den hier gefundenen Oberflächenrezeptoren
gehören die Adhäsionsmoleküle ICAM-1 (intercellular adhesion molecule 1) und
VCAM-1 (vascular cell adhesion molecule 1). ICAM-1 und VCAM-1 werden bei
Aktivierung von Endothelzellen durch proinflammatorische Stimuli stark exprimiert.
Als Oberflächenrezeptoren dienen beide der Rekrutierung von Leukozyten
(insbesondere von Neutrophilen und Lymphozyten) und vermitteln zusätzlich deren
transendotheliale Migration, indem durch eine Reihe von intrazellulären Reaktionen
die Kapillarpermeabilität vergrößert wird (Hordijk, 2006). Daneben wurde
Gewebsthrombokinase (auch Thromboplastin oder Faktor III, engl. tissue factor)
hochreguliert. Zusammen mit Proconvertin katalysiert Gewebsthrombokinase die
Umwandlung des inaktiven Faktors X in den aktivierten Faktor Xa der
Gerinnungskaskade. Die Gewebsthrombokinase wird von Zellen exprimiert, die nur
bei Verletzungen von Blutgefäßen mit fließendem Blut in Verbindung stehen (z. B.
92

subendotheliale glatte Muskelzellen, Fibroblasten). Zusätzlich sind auch
Endothelzellen in der Lage, Gewebsthrombokinase zu exprimieren, wenn sie
proinflammatorischen Stimuli, zu denen auch eine Infektion mit C. albicans zählt,
ausgesetzt sind. Kommt es zum Kontakt von Gewebsthrombokinase mit
zirkulierendem Proconvertin im Blut, wird die extrinsische Koagulation eingeleitet.
Dadurch soll eine weitere Verletzung des Blutgefäßes schnellstmöglich unterbunden
werden. Hochreguliert wurde auch der membranständige Rezeptor CD24, der
Zelladhäsion vermittelt und Signaltransduktionseigenschaften aufweist. Der einzige
bislang bekannte Ligand von CD24 ist P-Selektin (Aigner et al., 1997). Über eine
CD24/P-Selektin-Interaktion kann die Adhäsion von Granulozyten und Monozyten an
Endothelzellen oder Thrombozyten vermittelt werden. Außerdem wurde der Rezeptor
CD74 in Candida-stimulierten HUVEC hochreguliert, der neben seiner Funktion als
MHC-Klasse II-Chaperon durch Aktivierung von NF-κB auch die Proliferation und das
Überleben von Zellen verbessert (Starlets et al., 2006). Zu den hochregulierten
Oberflächenrezeptoren gehörten auch CD69, dessen Expression vor allem auf
hämatopoetischen Zellen bekannt ist und in Verbindung mit deren Aktivierung
diskutiert wird (Sancho et al., 2005), und der Chemokinrezeptor CXCR7 (chemokine
orphan receptor 1), der auf aktivierten Endothelzellen exprimiert wird und durch die
Bindung seiner bisher bekannten Liganden SDF-1 (stromal cell-derived factor 1) und
I-TAC (interferon-inducible T cell alpha chemoattractant) zu einem Proliferations- und
Überlebensvorteil führt und den Zellen ein besseres Adhäsionsvermögen verleiht
(Burns et al., 2006).
Eine weitere Gruppe hochregulierter Gene sind Zinkfinger-Proteine, beispielsweise
KLF4, ZFP36, ZNF151 und Lin28. ZFP36 wird während Entzündungsprozessen
hochreguliert und nimmt dabei antiinflammatorische Aufgaben zur Beendigung der
Entzündung wahr, indem es die mRNA von Zytokinen wie TNFα destabilisiert
(Carballo et al., 1998). Von vielen Genen der Gruppe „Apoptose/Zellproliferation“ ist
bekannt, dass sie als negative Regulatoren der Zellproliferation wirken. Dies deutet
darauf hin, dass das Wachstum der Wirtszellen unter einer Candida-Infektion sistiert.
Die durch Exposition mit Candida reprimierten endothelialen Gene konzentrieren sich
in geringerem Maße auf einzelne funktionelle Gruppen. Hier gab es jedoch eine
bedeutende Anzahl von Genen, die im Zusammenhang mit „Metabolismus“ und
93

„Signaltransduktion“ stehen. Außerdem wurden relativ viele Gene herunterreguliert,
die für Plasmamembran-assoziierte Genprodukte kodieren. Dies könnte sich als ein
Zeichen der zerstörerischen Wirkung des Pilzes auf die Wirtszellen interpretieren
lassen. Unter den herunterregulierten Genen ist außerdem auffällig, dass mehrere
von ihnen den Glutamat-gesteuerten Kanälen und deren Signalwegen zugeordnet
werden können. Dazu zählen sowohl die Glutamatrezeptoren GRIK2 und GRID2 als
auch die Glutamatdecarboxylase 2 (GAD2). Die funktionelle Bedeutung dieser
Beobachtungen ist allerdings noch nicht geklärt und bedarf weiterer Untersuchungen.
Zusammenfassend betrachtet führt eine Infektion von Endothelzellen mit C. albicans
in vitro zu einer deutlichen proinflammatorischen Reaktion, die hauptsächlich durch
Ausschüttung von Chemokinen charakterisiert ist, die der Anlockung und Aktivierung
von Immunzellen (vorrangig von Neutrophilen) dienen. Weiterhin kommt es unter
dem Einfluss von C. albicans zur Expression von Oberflächenmolekülen, die die
Adhäsion von Immunzellen an den Ort der Entzündung vermitteln und somit die
Bekämpfung des Erregers durch Zellen der angeborenen und der adaptiven
Immunabwehr einleiten.
5.2 C. albicans aktiviert den NF-κB-Signaltransduktionsweg in Endothelzellen
In vorangegangenen Arbeiten konnten bereits verschiedene Signalwege von
humanen Endothelzellen identifiziert werden, die bei entzündlichen Prozessen die
Expression der regulierten Gene steuern. So konnte beispielsweise die Beteiligung
des NF-κB-Signalweges und des p38 MAP Kinase-Signalweges bei der Regulation
des TNFα-induzierten Transkriptoms gezeigt werden (Viemann et al., 2004),
während bei der Stimulation von Endothelzellen mit dem Kontaktallergen Nickel die
Signalwege von NF-κB und von HIF-1α aktiviert werden (Viemann et al., 2007).
Die Auswertung des Candida-induzierten Transkriptoms in HUVEC ergab, dass ein
beträchtlicher Anteil der hochregulierten Gene unter der Kontrolle des
Transkriptionsfaktors NF-κB steht. Dieser Transkriptionsfaktor reguliert sowohl
proinflammatorische als auch antiapoptotische Antworten vieler Zelltypen auf Stimuli
wie beispielsweise die Exposition mit den Zytokinen IL-1 und TNFα oder auch mit
pathogenen Mikroorganismen oder anderen Stressfaktoren (Karin et al., 2004).
94

Ausgehend von diesem Ergebnis konnte in der vorliegenden Arbeit zum ersten Mal
systematisch gezeigt werden, dass in humanen Endothelzellen nach einer
Stimulation mit C. albicans die verschiedenen Stufen der NF-κB-Signalkaskade
aktiviert werden. Es konnte sowohl die Aktivierung der IKK2 Kinase anhand der
Phosphorylierung von IκBα, als auch die anschließende Degradation von IκBα
dargelegt werden (Abbildung 4.11). Ebenso wurde die κB-abhängige
Gentranskription durch den aktivierten Transkriptionsfaktor demonstriert. Schließlich
konnte neben der Induktion von mRNA verschiedener NF-κB-Zielgene auch die
Expression der drei bekannten κB-Targets CXCL8, CCL20 und ICAM-1 auf
Proteinebene nachgewiesen werden. Durch Versuche mit HUVEC, in denen durch
stabile Expression einer dominant-negativen Mutante von IKK2 die NF-κB-
Signalkaskade unterbrochen wurde, konnte noch einmal im Umkehrschluss die
Bedeutung des NF-κB-Weges bestätigt werden. Nach Co-Kultur mit Candida wurde
eine ganze Reihe von Genen durch die Mutante deutlich gehemmt, und auch die
Expression der untersuchten κB-Targets CXCL8, CCL20 und ICAM-1 unterblieb in
den Zellen mit der mutierten IKK2 nach Stimulation mit dem Hefepilz weitestgehend
(vgl. Abbildungen 4.10 bis 4.16).
Mit den Untersuchungen zur Aktivierung der IKK/IκBα/NF-κB-Signalkaskade durch
C. albicans konnte klar bewiesen werden, dass dieser Signalweg tatsächlich aktiviert
wird und für die Induktion vieler Candida-regulierter Gene essentiell ist.
5.3 Eine Subgruppe C. albicans-induzierter Gene wird durch den p38 MAP
Kinase-Signalweg co-reguliert
Es konnte bereits früher gezeigt werden, dass die Expression von NF-κB-Zielgenen
in vielen Fällen der Co-Regulation durch mitogen-aktivierte Protein (MAP) Kinasen
unterliegt (Ashwell, 2006). Die Beteiligung insbesondere des p38 MAP Kinase-
Signalweges an der Induktion proinflammatorischer Chemokine wie beispielsweise
CXCL8 (IL-8) und CCL2 (MCP-1) in primären Endothelzellen durch verschiedene
Stimuli (TNFα und LPS) wurde schon detailliert beschrieben (Goebeler et al., 1999;
Hippenstiel et al., 2000). Ebenso wurde über die Beteiligung von p38 an der
Candida-vermittelten Induktion von Cyclooxygenase-2 in HeLa-Zellen berichtet
95

(Deva et al., 2003). In Einklang mit der letztgenannten Studie konnte in der
vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass in HUVEC der p38-Signalweg parallel zur
NF-κB-Signalkaskade nach Stimulation mit C. albicans aktiviert wird.
Bemerkenswerterweise konnten Unterschiede hinsichtlich der Regulation einzelner
Zielgene entdeckt werden. Die Anwesenheit eines pharmakologischen Inhibitors von
p38 während der Stimulation mit C. albicans ließ die Expression von CCL20
weitestgehend unbeeinflusst, wohingegen die Expression von CXCL8 deutlich und
dosisabhängig gehemmt wurde (Abbildung 4.20). Diese Daten zeigen, dass die
Expression von CXCL8 sowohl von NF-κB als auch von der p38-Aktivierung reguliert
wird, wohingegen p38 keinen Einfluss auf die Candida-induzierte CCL20-Expression
hat.
Es fällt auf, dass die Co-Regulation der NF-κB-vermittelten CXCL8-Expression durch
p38 in Endothelzellen nach Exposition mit unterschiedlichen Stimuli (z. B. LPS, TNFα
oder C. albicans) stattfindet (Hippenstiel et al., 2000; Müller et al.) und auch in
anderen Zelltypen beobachtet wurde (Vitiello et al., 2004; Wu et al., 1997). Eine
übersichtliche und umfassende Erklärung für die Modulation des Expressionslevels
von CXCL8 durch MAP Kinasen liefern die Autoren E. Hoffmann et al. Danach
enthält die Promotersequenz des CXCL8-Gens neben der NF-κB-Bindungsstelle
auch eine Bindungsstelle für AP-1. Bei nahezu allen entzündlichen Prozessen
spielen neben dem NF-κB-Signalweg auch stressaktivierte MAP Kinase Signalwege
(z.B. JNK- und p38-Signalwege) eine Rolle. Unter anderem führt dies zu Aktivierung
des heterogenen Transkriptionsfaktors AP-1. Die Bindung von AP-1 scheint zwar
nicht essentiell für die Induktion von CXCL8 zu sein, verstärkt aber in vielen Zellen
die Genexpression (Hoffmann et al., 2002). In Studien mit den p38-Inhibitoren
SB203580 und 202190 wurde beobachtet, dass die CXCL8-Expression in manchen
Zellen gehemmt werden konnte, in anderen dagegen nicht, und dass die Hemmung
nie ganz vollständig war (Manthey et al., 1998; Marin et al., 2001; Ridley et al., 1997;
Suzuki et al., 2000). Für p38 konnte ein posttranskriptioneller, stabilisierender Effekt
auf die ansonsten extrem instabile mRNA von CXCL8 gezeigt werden (Holtmann et
al., 2001; Holtmann et al., 1999; Winzen et al., 1999). p38 beeinflusst außerdem die
Genexpression auf der Ebene der Transaktivierung durch Wechselwirkungen mit
Komponenten des Enhanceosoms, beispielsweise mit dem transkriptionellen Co-
Aktivator CBP/p300 (Goebeler et al., 2001). Weiterhin wurde die mitogen- und
96

stress-aktivierte Protein-1 Kinase (MSK1) identifiziert, die unterhalb von p38 wirkt.
MSK1 phosphoryliert p65, ein Mitglied der NF-κB/Rel Familie, sowie Komponenten
des Chromatingerüstes, und beeinflusst dadurch die NF-κB-abhängige
Gentranskription (Schmitz et al., 2001; Vermeulen et al., 2003).
Interessanterweise war sowohl die κB- als auch die p38-Aktivierung nach Exposition
mit C. albicans im Vergleich mit dem prototypischen Aktivator der
Chemokinexpression in Endothelzellen, TNFα, deutlich verspätet und länger
anhaltend (Abbildungen 4.11 und 4.19). Diese verzögerte Kinetik lässt auf einen
alternativen, langsameren Aktivierungsweg schließen. Die nahe liegende Vermutung
einer indirekten, autokrinen Aktivierung über Candida-induzierte proinflammatorische
Zytokine oder andere lösliche Faktoren konnte hier ausgeschlossen werden. In einer
Untersuchung von Orozco et al. wurde für die C. albicans-vermittelte Expression von
CXCL8 und des Oberflächenrezeptors E-Selektin ein indirekter Mechanismus über
TNFα postuliert (Orozco et al., 2000). Im Widerspruch zu dieser Studie wurde aber in
der vorliegenden Arbeit klar gezeigt, dass die späte Expression von CXCL8 nach
Stimulation mit C. albicans nicht durch eine autokrine Wirkung der
proinflammatorischen Zytokine TNFα oder IL-1β bedingt ist. Ebenso wie TNFα
aktiviert auch IL-1β den IKK/IκBα/NF-κB-Signalweg innerhalb kürzester Zeit (Otkjaer
et al., 2007; Yan et al., 2006). Weder durch die Zugabe von löslichem TNF-Rezeptor,
noch eines IL-1-Rezeptor-Antagonisten konnte die Candida-induzierte CXCL8-
Expression gehemmt werden. Zudem wurde im Mikroarray keine Induktion von TNFα
beobachtet, wodurch dieses als indirekter κB-Aktivator weiter ausgeschlossen
werden kann. Auch eine indirekte Aktivierung der Endothelzellen über andere
Faktoren oder über lösliche Candida-Produkte konnte durch Versuche mit
konditionierten Medien klar widerlegt werden (Abbildungen 4.17 und 4.18).
Ähnlich verzögerte Aktivierungskinetiken wie mit C. albicans wurden zuvor schon bei
anderen Endothelaktivatoren beobachtet, beispielsweise bei Phorbolmyristatacetat,
Lipopolysaccharid (LPS) oder Nickel (Goebeler et al., 2001; Johnson et al., 1996;
Zen et al., 1998). Als mögliche Erklärung für die verzögerte Reaktion von
Endothelzellen auf eine Infektion mit C. albicans wäre die Notwendigkeit der
Hefe-Hyphe-Transition denkbar, die vom zeitlichen Verlauf gut mit der
Aktivierungskinetik von κB und p38 korreliert. Außerdem wurde beobachtet, dass
97

Hitze-inaktivierte Candida-Blastosporen nicht zur Aktivierung von κB führen, was die
aufgestellte Vermutung weiter stützt. In Abschnitt 5.6 wird diese Hypothese noch
ausführlicher diskutiert.
5.4 Die Bedeutung von TLR2 und TLR4 bei der Vermittlung der Candidainduzierten
Genexpression in HUVEC
Der Eigenschaft von Candida, in unterschiedlichen Morphen als Parasit oder
Kommensale zu wachsen, scheint ein komplexer antimykotischer
Abwehrmechanismus des Wirtes gegenüberzustehen. Um eine Infektion durch
C. albicans abzuwehren, müssen die Zellen des angeborenen Immunsystems den
Erreger erkennen und effektive Abwehrmaßnahmen einleiten. Dies geschieht über
evolutionär konservierte Muster-erkennende Rezeptoren (pattern-recognition
receptors, PRRs), zu denen unter anderen die signaltransferierenden Toll-like
Rezeptoren (TLRs) gehören (Medzhitov and Janeway, 1997).
Bisher wurde die Erkennung von C. albicans in verschiedenen humanen und
murinen Zelltypen hauptsächlich den Rezeptoren TLR2 und TLR4 zugeschrieben
(Bellocchio et al., 2004; Jouault et al., 2003; Netea et al., 2002; van der Graaf et al.,
2005). In Keratinozyten wurde zusätzlich der Mannose-Rezeptor als verantwortlicher
PRR für die Erkennung von C. albicans identifiziert (Szolnoky et al., 2001), in
dendritischen Zellen sowie in Monozyten und Makrophagen wurde der Lektin-
Rezeptor Dectin-1 als beteiligter Rezeptor diskutiert (Brown et al., 2003; Gantner et
al., 2003). Allerdings ist die biologische Bedeutung der genannten Rezeptoren nicht
unumstritten. Beispielsweise vertreten Gil und Gozalbo die These, dass nur TLR2,
nicht aber TLR4 am wirtseigenen Abwehrmechanismus gegen eine Infektionen mit
C. albicans beteiligt ist, und dass dieser Rezeptor die Candida-induzierte
Zytokinsekretion vermittelt (Gil and Gozalbo, 2006b). Andere Autoren berichten von
einer primär TLR4-vermittelten Immunreaktion gegen den Pilz und sogar von einer
TLR2-vermittelten Induktion antiinflammatorischer Zytokine, die es Candida
ermöglichen, den Abwehrmechanismen des Wirtes zu entgehen (Netea et al., 2004a;
Netea et al., 2004b). Erst kürzlich konnte diese Forschergruppe die Erkennung
einzelner Membranbestandteile von C. albicans durch murine Makrophagen
bestimmten Rezeptoren zuordnen (Netea et al., 2006a). Danach binden
O-verknüpfte Mannosylreste der äußeren Candida-Zellwand an TLR4 und
98

N-verknüpfte Mannosylreste an den Mannoserezeptor, während β-Glukan-
Komponenten aus der inneren Candida-Zellwand vom Dectin-1/TLR2-
Rezeptorkomplex erkannt werden.
Unter Berücksichtigung der in dieser Arbeit präsentierten Ergebnisse scheinen
jedoch in primären humanen Endothelzellen weder TLR2 noch TLR4 die NF-κBabhängige
Gentranskription nach einer C. albicans-Stimulation einzuleiten. Zum
einen konnte gezeigt werden, dass humane Endothelzellen unter den gewählten
Kulturbedingungen keine funktionellen TLR2 auf ihrer Oberfläche exprimieren, zum
anderen vermittelte transgen exprimierter TLR4 zwar Sensitivität gegenüber
Exposition mit dem etablierten TLR4-Agonisten LPS, nicht aber mit C. albicans.
Zudem konnte durch Knock-down von endogenen TLR4 durch siRNA in HUVEC die
C. albicans-induzierte CXCL8-Expression nicht gehemmt werden.
In zwei früheren Studien wurden gegensätzliche Aussagen über die basale
Expression von TLR2 auf Endothelzellen getroffen (Faure et al., 2000; Talreja et al.,
2004). Talreja et al. berichten von einer bestehenden Basalexpression, wohingegen
in der Studie von Faure et al. von einem kompletten Fehlen von TLR2 berichtet wird.
Durch Untersuchungen im Rahmen dieser Arbeit konnte eine basale TLR2-
Expression weder auf mRNA- und auf Proteinebene noch funktionell nachgewiesen
werden (Abbildungen 4.23, 4.24 und 4.25 (A)). Ein Vorkommen von TLR2 auf
HUVEC ist zumindest unter den hier vorliegenden Kulturbedingungen demnach sehr
unwahrscheinlich. In beiden oben zitierten Studien konnte mittels semiquantitativer
PCR und mittels Immunfluoreszenzfärbung auf mRNA- und Proteinebene belegt
werden, dass Endothelzellen basal TLR4 exprimieren. Im Rahmen der vorliegenden
Arbeit konnte dieses Ergebnis mit durchflusszytometrischen Färbungen nicht
bestätigt werden, was aber möglicherweise durch eine zu geringe Sensitivität der
Methode zu erklären ist (Daten nicht gezeigt). Dagegen bestätigten die Mikroarray-
Daten die Expression von TLR4 auf HUVEC (Abbildung 4.24). Dementsprechend
konnte bei einer funktionellen Testung von HUVEC durch Stimulation mit dem
synthetischen TLR1/2-Agonisten Pam3CSK4 weder eine NF-κB-Aktivierung noch
eine CXCL8-Expression festgestellt werden. Auch die TLR2/6-Agonisten MALP-2
und FSL-1 induzierten keine CXCL8-Expression in HUVEC. Der TLR4-Agonist LPS
stimulierte die Zellen hingegen stark (Abbildung 4.23). Die Effektivität der
99

Präparationen wurde jeweils anhand von TLR2- und TLR4-positiven THP-1-Zellen
überprüft.
Diese Ergebnisse bestätigen, dass im Gegensatz zu TLR4 keine funktionellen TLR2
auf der Zellmembran von HUVEC exprimiert werden. Da die Mikroarray-Daten
zeigen, dass keine transkriptionelle Hochregulation von TLR2 durch die Co-Kultur mit
C. albicans stattfindet, scheidet dieser Rezeptor als Vermittler des Candidainduzierten
Signals in HUVEC aus.
Weitere Erkenntnisse über die molekulare Erkennung von C. albicans wurden mit
HEK293-Zellen gesammelt. Die TLR2- und TLR4-negativen HEK293-Zellen
reagierten nach der stabilen Expression eines dieser beiden Rezeptoren auf den
jeweiligen Agonisten mit starker NF-κB-Aktivierung und CXCL8-Expression, während
sie durch C. albicans nicht stimulierbar waren (Abbildung 4.26). Aus diesen Daten
kann gefolgert werden, dass die Candida-induzierte endotheliale Genexpression
nicht durch TLR2 oder TLR4 vermittelt wird.
Abschließende RNA-Interferenz-Versuche, bei denen der endogene TLR4 in HUVEC
herunterreguliert wurde, bestätigten noch einmal, dass TLR4 nicht den vermittelnden
Rezeptor des Candida-induzierten Signals darstellt (Abbildung 4.27).
5.5 MyD88 und IRAK1 sind entscheidend an der C. albicans-induzierten
Signaltransduktion beteiligt, die zur Expression von CXCL8 und CCL20
führt
Da die Erkennung von Candida in humanen Endothelzellen offensichtlich nicht über
TLR2 und TLR4 vermittelt wird, wurden in weiterführenden Studien die in Betracht
kommenden Rezeptoren weiter eingegrenzt. Dazu wurden das Adaptermolekül
MyD88 und die stromaufwärts vom IKK/IκBα/NF-κB-Signalweg gelegene Kinase
IRAK1 untersucht, die eine Konvergenzstelle für unterschiedliche Rezeptoren der
Toll/IL-1R-Superfamilie sowie des IL-18 Rezeptors darstellen.
Durch die retroviral vermittelte Expression einer small hairpin RNA gegen IRAK1 in
HUVEC konnte ein nahezu vollständiger Knock-down des IRAK1-Proteins erreicht
werden. In diesen Zellen war die C. albicans-vermittelte Expression der
NF-κB-Zielgene CXCL8 und CCL20 deutlich verringert. Ebenso hemmte die
Herunterregulation von MyD88 durch eine siRNA die Candida-induzierten CXCL8-
und CCL20-Expressionen. Weitere Versuche, die in HUVEC mit stabil exprimierten
100

dominant-negativen Mutanten beider Moleküle durchgeführt wurden, zeigten die
gleichen Ergebnisse (Abbildungen 4.29 bis 4.31).
Zusammengefasst zeigen all diese Daten klar eine notwendige Beteiligung von
MyD88 und IRAK1 an der Transduktion des Candida-induzierten Signals in
Endothelzellen. Die Abhängigkeit von diesen beiden Molekülen impliziert, dass ein
Toll-like Rezeptor die Erkennung von C. albicans vermittelt und zu einer Aktivierung
proinflammatorischer Signalwege führt.
5.6 Das C. albicans-induzierte Signal wird zumindest teilweise über TLR3
vermittelt
Die Ergebnisse aus den Versuchen mit siRNA-TLR3 legen die Vermutung nahe,
dass TLR3 der gesuchte Rezeptor ist. Für den typischerweise intrazellulär
vorkommenden TLR3 wurden in der Literatur sowohl eine MyD88-unabhängige
Signalkaskade beschrieben, die zur Aktivierung von Interferon-regulatory factor
(IRF3) und zur Induktion von Typ I Interferon-Genen führt, als auch eine MyD88-
abhängige Signalkaskade, die durch Aktivierung von NF-κB und MAP Kinasen
nachfolgend die Expression proinflammatorischer Zytokine bewirkt (Akira and
Takeda, 2004; Alexopoulou et al., 2001; Jiang et al., 2003; Yamamoto et al., 2003).
In der vorliegenden Arbeit konnte die Abhängigkeit der Poly(I:C)-induzierten, TLR3-
vermittelten CXCL8-Expression von dem Adaptermolekül MyD88 gezeigt werden.
TLR3 dient als intrazellulärer Rezeptor für doppelsträngige Virus-RNA und endogene
RNA-Spezies, die bei Zellschädigung freigesetzt werden (Brentano et al., 2005;
Kariko et al., 2004; Marshak-Rothstein, 2006). Der genaue Mechanismus der
Candida-induzierten TLR3-Aktivierung bleibt allerdings bisher unklar. Eine mögliche
Erklärung wäre eine Schädigung der Endothelzellen durch den Pilz, bei der RNA-
Spezies freigesetzt werden, die über TLR3, MyD88 und IRAK1 zu Aktivierung des
NF-κB- und des p38-Signalweges führen können. Die Arbeitsgruppe um Scott G.
Filler konnte demonstrieren, dass C. albicans eine Schädigung der Wirtszelle
verursacht, nachdem der Pilz durch Phagozytose bzw. Endozytose inkorporiert
wurde. Sowohl lebende als auch tote C. albicans konnten dabei zwar endozytiert
werden, jedoch schädigte danach nur der lebende, sprossende Pilz die
Endothelzellen und stimulierte deren proinflammatorische Antworten (Filler et al.,
1996; Filler et al., 1995).
101

Es wurde zudem gezeigt, dass Candida-Hyphen besser von Endothelzellen
phagozytiert werden als Blastosporen (Phan et al., 2000). Die Bindung von Candida-
Hyphen, nicht aber von Blastosporen, wird über N-Cadherin auf der Zellmembran
von Endothelzellen und über Als3 als beteiligtem Invasin auf der Candida-Zellwand
vermittelt. C. albicans nutzt diesen Mechanismus für eine Invasion der Wirtszellen
(Phan et al., 2005; Phan et al., 2007).
Für das hier verwendete in vitro-Modell bieten sowohl die Hyphenbildung von
C. albicans als auch die nachfolgend verursachten Zellschäden, die eine
Voraussetzung für eine Aktivierung von HUVEC über TLR3 sind, eine plausible
Begründung für die verzögerte Kinetik der Candida-induzierten Signaltransduktion.
Ausserdem könnte damit erklärt werden, warum Hitze-inaktivierte C. albicans keine
NF-κB-abhängige Signaltransduktion verursachen.
Eine Beteiligung von TLR3 an der Vermittlung der C. albicans-induzierten
Genexpression in HUVEC konnte mit den hier vorgestellten Ergebnissen deutlich
gezeigt werden. Da mit der siRNA gegen TLR3 jedoch keine komplette Hemmung
der CXCL8-Expression erreicht werden konnte, kann die Beteiligung eines oder
mehrerer anderer Rezeptoren nicht mit Sicherheit ausgeschlossen werden.
Intrazellulär lokalisierte Toll-like Rezeptoren wie TLR7 oder TLR9 erkennen
einzelsträngige Virus-RNA, CpG-reiche unmethylierte DNA von Bakterien und Viren
oder auch verschiedene synthetische Produkte (Akira and Takeda, 2004), doch
bisher ist nicht bekannt, dass auch molekulare Bestandteile von Candida über diese
Rezeptoren binden. NOD2, ein intrazellulär lokalisierter PRR für verschiedene
mikrobielle Pathogene, kann zwar die NF-κB-Signalkaskade aktivieren (Meylan et al.,
2006), scheint aber nicht an der Erkennung von C. albicans beteiligt zu sein (van der
Graaf et al., 2006). Weitere Rezeptoren, die für die Erkennung von pathogenen
Pilzen in anderen Zelltypen diskutiert wurden, sind der Mannose-Rezeptor und die
C-Typ Lektin-Rezeptoren Dectin-1 und DC-SIGN (Cambi et al., 2003; Dostert and
Tschopp, 2007; Gantner et al., 2003; Szolnoky et al., 2001; Taylor et al., 2007). Sie
sind nach dem heutigen Wissensstand aber nicht auf HUVEC exprimiert oder nicht
an der Transduktion des Candida-induzierten Signals beteiligt (Groger et al., 2000;
Saijo et al., 2007). Die fehlende Expression der beiden erstgenannten Rezeptoren in
HUVEC konnte auch im Rahmen dieser Arbeit bestätigt werden. Sie scheiden somit
als potentielle weitere Rezeptoren bei der Vermittlung des Candida-Signals aus.
102

5.7 Ausblick
In dieser Arbeit konnte die endotheliale Antwort auf den pathogenen Stimulus
C. albicans auf molekularer Ebene genauer charakterisiert werden. Ohne Zweifel ist
die proinflammatorische Immunantwort des Wirtes auf eine Infektion mit dem
Hefepilz, bei der die Endothelzellen maßgeblich beteiligt sind, eine
überlebenswichtige Reaktion. Häufig kommt es aber während eines
Infektionsgeschehens mit C. albicans zu einer Sepsis, die sehr schwerwiegende
Folgen für den Patienten haben kann. Die hier gezeigten Ergebnisse könnten daher
für die zukünftige Therapie der unkontrollierten, überschießenden Entzündung im
Rahmen einer Candida-Sepsis von Bedeutung sein. Neben der essentiellen Therapie
der manifesten Pilzinfektion durch Antimykotika könnte eine gleichzeitige, Candidabedingte
und häufig lebensbedrohliche Sepsis durch Unterdrückung oder
Abschwächung der überschießenden proinflammatorischen Prozesse günstig
beeinflußt werden. Generell stellt dabei die Inhibition sowohl der NF-κB-
Signalkaskade als auch des p38 MAP-Signalweges eine mögliche sinnvolle Strategie
dar.
Zahlreiche bereits zur Verfügung stehende Wirkstoffe greifen in unterschiedlicher
Weise hemmend in den NF-κB-Signalweg ein, beispielsweise einige nichtsteroidale
antiinflammatorische Substanzen (NSAIDs), Sulfasalazin, manche Glukokortikoide
oder verschiedene Immunsuppressiva (Gilmore and Herscovitch, 2006; Olivier et al.,
2006). Allerdings hat der Transkriptionsfaktor NF-κB neben der proinflammatorischen
Wirkung noch zahlreiche andere Wirkungen, sodass es bei der Anwendung von
Inhibitoren der NF-κB-Signalkaskade auch zu unerwünschten Nebeneffekten
kommen kann. Vor allem aber würde die Hemmung des NF-κB-Signalwegs auch
eine beeinträchtigte Fähigkeit zur Beseitigung des Pathogens aus dem
Wirtsorganismus mit sich bringen. Da die angeborene Immunabwehr sowohl die
Pathogenclearance kontrolliert als auch die proinflammatorische Antwort, die die
Pathophysiologie des septischen Schocks verursacht, sind diese beiden Aspekte eng
miteinander verbunden. Zurzeit ist es noch nicht möglich, eine Funktion ohne
Beeinflussung der anderen zu hemmen. Eine mögliche, zukünftige Strategie wäre
hierfür die zelltypspezifische Hemmung der NF-κB-Aktivität, beispielsweise in
Endothelzellen. Diese Zellen spielen eine maßgebliche Rolle bei der Pathologie der
103

Sepsis. Sollte die endotheliale NF-κB-Aktivität keinen Einfluss auf die Immunabwehr
des Wirtes haben, so könnten durch diesen zelltypspezifischen Ansatz die
proinflammatorische Antwort von der Immunabwehr abgekoppelt werden (Liu and
Malik, 2006).
Für die Hemmung des p38-Signalwegs werden derzeit unterschiedliche Substanzen
in der klinischen Phase getestet (Peifer et al., 2006). Ihre Anwendung könnte ein
großer Fortschritt für die Therapie der Sepsis bedeuten. Doch auch hier wird es
aufgrund der zentralen Rolle von p38 bei vielen verschiedenen Prozessen zu
unerwünschten Nebenwirkungen dieser Inhibitoren kommen können.
Als neuer vielversprechender therapeutischer Angriffspunkt bei einer
überschießenden Entzündungsreaktion im Rahmen einer Candida-Sepsis wäre
daher der für die Erkennung von C. albicans durch Endothelzellen verantwortliche
Rezeptor denkbar. Die Identifizierung von TLR3 als zumindest beteiligtem Rezeptor
bei der Perzeption des Pilzes könnte den ersten Schritt in Richtung einer selektiven
Behandlung oder Prävention der lebensbedrohlichen Candida-Sepsis darstellen.
Zusammengefasst unterstreicht die vorliegende Arbeit die Bedeutung der
Endothelzellen als Teil der angeborenen Immunität bei der Erkennung und der
Abwehr des pathogenen Hefepilzes Candida albicans im Rahmen einer Candidämie.
Außerdem bietet sie neue Einblicke in den molekularen Mechanismus, über den
C. albicans entzündliche Immunantworten auslöst, die beim Menschen unter
ungünstigen Bedingungen zu lebensbedrohlicher Sepsis führen können.
104

6 Anhang
6.1 Endotheliale Gene, die durch C. albicans hochreguliert wurden
Affymetrix
identifier
genes
n-fold
change
p-value
gene
symbol
accession
number
202768_at
204363_at
209189_at
FBJ murine osteosarcoma viral
oncogene homolog B
coagulation factor III
(thromboplastin, tissue factor)
v-fos FBJ murine osteosarcoma
viral oncogene homolog
28.8 0.00000246 FOSB NM_006732
15.1 0.00628858 F3 NM_001993
14.2 0.00322235 FOS BC004490
205476_at chemokine (C-C motif) ligand 20 13.8 0.00899427 CCL20 NM_004591
201531_at
zinc finger protein 36, C3H type,
homolog (mouse)
9.0 0.00067896 ZFP36 NM_003407
207850_at chemokine (C-X-C motif) ligand 3 8.0 0.00787529 CXCL3 NM_002090
204621_s_at
nuclear receptor subfamily 4,
group A, member 2
7.2 0.00387928 NR4A2 AI935096
209774_x_at chemokine (C-X-C motif) ligand 2 5.3 0.00688056 CXCL2 M57731
216290_x_at
222162_s_at
CDNA FLJ10002 fis, clone
HEMBA1000046
a disintegrin-like and
metalloprotease (reprolysin type)
with thrombospondin type 1 motif,
1
5.1 0.01507968 AK000864
4.8 0.00002115 ADAMTS1 AK023795
221841_s_at Kruppel-like factor 4 (gut) 4.6 0.00021637 KLF4 BF514079
209619_at
209772_s_at
212641_at
216248_s_at
CD74 antigen (invariant
polypeptide of major
histocompatibility complex, class II
antigen-associated)
CD24 antigen (small cell lung
carcinoma cluster 4 antigen)
human immunodeficiency virus
type I enhancer binding protein 2
nuclear receptor subfamily 4,
group A, member
4.4 0.02499724 CD74 K01144
4.2 0.00808744 CD24 X69397
4.2 0.03381727 HIVEP2 AL023584
4.1 0.02292551 NR4A2 S77154
105

218839_at
214014_at
216171_at
204470_at
219908_at
hairy/enhancer-of-split related with
YRPW motif 1
CDC42 effector protein (Rho
GTPase binding) 2
CDNA: FLJ21618 fis, clone
COL07487
chemokine (C-X-C motif) ligand 1
(melanoma growth stimulating
activity, alpha)
dickkopf homolog 2 (Xenopus
laevis)
4.1 0.02511365 HEY1 NM_012258
4.0 0.04698867 CDC42EP2 W81196
4.0 0.01475491 AK025271
3.8 0.01502754 CXCL2 NM_001511
3.8 0.04518165 DKK2 NM_014421
210538_s_at baculoviral IAP repeat-containing 3 3.7 0.04550961 BIRC3 U37546
205439_at glutathione S-transferase theta 2 3.6 0.04686281 GSTT2 NM_000854
211527_x_at vascular endothelial growth factor 3.6 0.01183370 VEGF M27281
202638_s_at
intercellular adhesion molecule 1
(CD54), human rhinovirus receptor
3.5 0.01649636 ICAM1 NM_000201
206224_at cystatin SN 3.3 0.02907794 CST1 NM_001898
203868_s_at vascular cell adhesion molecule 1 3.3 0.04312769 VCAM1 NM_001078
210415_s_at outer dense fiber of sperm tails 2 3.2 0.00176435 ODF2 AF053970
202672_s_at activating transcription factor 3 3.1 0.00008507 ATF3 NM_001674
202859_x_at interleukin 8 3.1 0.01978867 IL8 NM_000584
213575_at Transformer-2 alpha 3.0 0.04775573 TRA2A
AA831170 :
AW978896
209795_at
CD69 antigen (p60, early T-cell
activation antigen)
3.0 0.04647100 CD69 L07555
216598_s_at chemokine (C-C motif) ligand 2 3.0 0.00485405 CCL2 S69738
205081_at cysteine-rich protein 1 (intestinal) 3.0 0.03870936 NM_001311
206027_at S100 calcium binding protein A3 2.9 0.01140019 S100A3 NM_002960
207461_at
chromodomain helicase DNA
binding protein 3
2.9 0.04424403 CHD3 NM_001272
208078_s_at SNF1-like kinase 2.8 0.00019965 TCF8 NM_030751
201170_s_at
basic helix-loop-helix domain
containing, class B, 2
2.8 0.00139303 BHLHB2 NM_003670
213580_at HCF-binding transcription factor 2.8 0.00549044 ZF AA521272
106

212803_at
Zhangfei
NGFI-A binding protein 2 (EGR1
binding protein 2)
2.8 0.02263762 NAB2 BF337329
201502_s_at
nuclear factor of kappa light
polypeptide gene enhancer in B-
cells inhibitor, alpha
2.7 0.00810844 NFKBIA
AI078167 :
NM_020529
212230_at
210471_s_at
207201_s_at
phosphatidic acid phosphatase
type 2B
potassium voltage-gated channel,
shaker-related subfamily, beta
member 1
solute carrier family 22 (organic
cation transporter), member 1
2.7 0.00160759 PPAP2B AV725664
2.7 0.01107326 KCNAB1 U33428
2.7 0.01356267 SLC22A1 NM_003057
215587_x_at BTB (POZ) domain containing 14B 2.6 0.02326212 AK023891
202388_at
regulator of G-protein signalling 2,
24kDa
2.6 0.00419042 RGS2 NM_002923
204499_at ATP/GTP binding protein 1 2.6 0.01714130 AGTPBP1
AB028958 :
NM_015239
212977_at
chemokine orphan receptor 1
(CXCR7)
2.6 0.01514438 CMKOR1 AI817041
219823_at lin-28 homolog (C. elegans) 2.6 0.02664023 LIN28 NM_024674
204748_at
prostaglandin-endoperoxide
synthase 2 (prostaglandin G/H
synthase and cyclooxygenase)
2.6 0.00152356 PTGS2 NM_000963
201473_at jun B proto-oncogene 2.6 0.00243452 JUNB NM_002229
205289_at bone morphogenetic protein 2 2.5 0.00075237 BMP2 AA583044
213556_at similar to R28379_1 2.5 0.00082574 BE673445
215599_at SMA4 2.5 0.01508687 SMA3 X83300
212865_s_at
202644_s_at
203601_s_at
collagen, type XIV, alpha 1
(undulin)
tumor necrosis factor, alphainduced
protein 3
zinc finger and BTB domain
containing 17
2.5 0.03907762 COL14A1 BF449063
2.5 0.00813404 TNFAIP3 NM_006290
2.5 0.03181358 ZNF151 AW574837
Tabelle 6.1 Liste der durch C. albicans in Endothelzellen hochregulierten Gene. Aufgeführt sind
die Ergebnisse einer Mikroarray-Untersuchung von HUVEC, die mit C. albicans-Blastosporen (Stamm
SC5314, MOI=1) für 5 Stunden co-inkubiert wurden. Als Einschlusskriterien wurden eine mindestens
2,5-fachen Induktion des Mittelwertes aus vier Oligonukleotid-Mikroarray-Analysen im Vergleich zu
unstimulierten HUVEC und ein p-Wert von ≤ 0,05 gewählt.
107

6.2 Endotheliale Gene, die durch C. albicans herunterreguliert wurden
Affymetrix
identifier
genes
n-fold
change
p-value
gene
symbol
accession
number
219552_at
Chromosome 9 open reading
frame 13
9.8 0.00563630 C9orf13 NM_024500
221182_at hypothetical protein FLJ23550 8.8 0.01587540 FLJ23550 NM_025063
215655_at
Glutamate receptor, ionotropic,
kainate 2
6.3 0.01983784 GRIK2 AU156204
220872_at hypothetical protein PRO2964 6.0 0.02536887 PRO2964 NM_018547
215028_at
216462_at
sema domain, transmembrane
domain (TM), and cytoplasmic
domain, (semaphorin) 6A
synovial sarcoma, X breakpoint 2
[BLAST]
5.6 0.01753944 SEMA6A AB002438
5.5 0.00019731 SSX2 X79200
208586_s_at synovial sarcoma, X breakpoint 4 5.5 0.00769917 SSX4 NM_005636
219947_at
216406_at
206155_at
C-type lectin domain family 4,
member A
Consensus includes gb:AL390237
/DEF=Human DNA sequence from
clone RP11-278J20 on
chromosome 6. Contains ESTs,
STSs and GSSs. Contains an
RBBP4 (retinoblastoma-binding
protein 4) pseudogene and a ...
ATP-binding cassette, sub-family
C (CFTR/MRP), member 2
5.3 0.00587998 CLECSF6 NM_016184
5.0 0.03749767 AL390237
4.8 0.00115486 ABCC2 NM_000392
220878_at hypothetical protein PRO0800 4.3 0.03926871 NM_018592
221364_at
glutamate receptor, ionotropic,
delta 2
4.1 0.04232953 GRID2 NM_001510
216987_at interferon regulatory factor 4 4.1 0.02737984 IRF4 D78261
221441_at goosecoid-like 4.1 0.01455014 NM_005315
213953_at keratin 20 4.1 0.02538935 KRT20 AI732381
207262_at apolipoprotein F 4.0 0.00169603 STAT2 NM_001638
207407_x_at
cytochrome P450, family 4,
subfamily A, polypeptide 11
4.0 0.00823100 CYP4A11 NM_000778
108

221795_at
neurotrophic tyrosine kinase,
receptor, type 2
3.9 0.00690562 NTRK2
AA707199 :
AI346341
210108_at
calcium channel, voltagedependent,
L type, alpha 1D
subunit
3.8 0.01863041 CACNA1D BE550599
206112_at ankyrin repeat domain 7 3.7 0.02955938 ANKRD7 NM_019644
204721_s_at
DnaJ (Hsp40) homolog, subfamily
C, member 6
3.7 0.04638897 DNAJC6 NM_014787
217169_at IgM VDJ-region 3.7 0.03746786 M31949
216951_at
Fc fragment of IgG, high affinity Ia,
receptor (CD64)
3.6 0.02675323 FCGR1A X14355
207611_at histone 1, H2bl 3.6 0.03756317 HIST1H2BL NM_003519
207155_at T-box 5 3.5 0.01748668 TBX5 NM_000192
206780_at
219902_at
217575_s_at
glutamate decarboxylase 2
(pancreatic islets and brain,
65kDa)
betaine-homocysteine
methyltransferase 2
son of sevenless homolog 2
(Drosophila)
3.4 0.02664630 GAD2 NM_000818
3.4 0.01862500 BHMT2 NM_017614
3.3 0.04191596 SOS2 BF692958
206999_at interleukin 12 receptor, beta 2 3.3 0.04860055 IL12RB2 NM_001559
220098_at hydrocephalus inducing 3.3 0.00168780 HYDIN NM_017558
206727_at complement component 9 3.3 0.02874772 C9 K02766
215355_at
POU domain, class 2, transcription
factor 3
3.2 0.02087841 POU2F3 AI686582
217514_at Hypothetical protein LOC147343 3.2 0.04854285 BF509345
219233_s_at gasdermin-like 3.2 0.00959721 GSDML NM_018530
202833_s_at
serine (or cysteine) proteinase
inhibitor, clade A (alpha-1
antiproteinase, antitrypsin),
member 1
3.2 0.00894442 SERPINA1 NM_000295
214122_at PDZ and LIM domain 7 (enigma) 3.1 0.03776573 PDLIM7 AA086229
208396_s_at
phosphodiesterase 1A,
calmodulin-dependent
3.1 0.03754329 PDE1A NM_005019
215943_at KIAA1661 protein 3.1 0.03083915 KIAA1661 AB051448
109

206189_at unc-5 homolog C (C. elegans) 3.1 0.02945630 UNC5C NM_003728
215922_at
214206_at
RALBP1 associated Eps domain
containing 1
sphingomyelin phosphodiesterase
2, neutral membrane (neutral
sphingomyelinase)
3.0 0.02363395 REPS1 AL049259
3.0 0.02172582 SMPD2 AI739480
204876_at zinc finger protein 646 2.9 0.01445240 KIAA0296 NM_014699
210072_at chemokine (C-C motif) ligand 19 2.9 0.04912384 CCL19 U88321
205666_at
222277_at
220088_at
flavin containing monooxygenase
1
Homo sapiens, clone
IMAGE:4429946, mRNA
complement component 5 receptor
1 (C5a ligand)
2.9 0.02070017 FMO1 NM_002021
2.9 0.04837558 BG032839
2.9 0.04619069 GPR77 NM_001736
220117_at zinc finger protein 659 2.9 0.01808409 FLJ22419 NM_024697
221086_s_at zinc finger protein 312 2.8 0.00769146 FEZL NM_018008
208543_at
olfactory receptor, family 10,
subfamily H, member 2
2.8 0.02663062 OR10H2 NM_013939
213783_at manic fringe homolog (Drosophila) 2.8 0.04347593 MFNG AI760053
205185_at
serine protease inhibitor, Kazal
type 5
2.8 0.04902098 SPINK5 NM_006846
215225_s_at G protein-coupled receptor 17 2.8 0.03361849 GPR17 Z94154
206480_at leukotriene C4 synthase 2.8 0.00565122 LTC4S NM_000897
219695_at
207632_at
sphingomyelin phosphodiesterase
3, neutral membrane (neutral
sphingomyelinase II)
muscle, skeletal, receptor tyrosine
kinase
2.8 0.04101403 SMPD3 NM_024703
2.7 0.03828284 MUSK NM_005592
206371_at folate receptor 3 (gamma) 2.7 0.00338038 FOLR3 NM_000804
222197_s_at Similar to RIKEN 4933439F11 2.7 0.01705308 LOC388389 AF131813
217587_at
208455_at
Heterogeneous nuclear
ribonucleoprotein F
poliovirus receptor-related 1
(herpesvirus entry mediator C;
nectin)
2.7 0.01737048 AI274196
2.7 0.01051868 PVRL1 NM_002855
110

217683_at hemoglobin, epsilon 1 2.6 0.04602192 HBE1 AA115963
214614_at homeo box HB9 2.6 0.02502267 HLXB9 AI738662
211436_at
gb:AF130053.1 /DEF=Homo
sapiens clone FLB4228 PRO1095
mRNA, complete cds.
/FEA=mRNA /PROD=PRO1095
/DB_XREF=gi:11493412
/UG=Hs.302145 Homo sapiens
clone FLB4228 PRO1095 mRNA,
complete cds /FL=gb:A ...
2.6 0.00804745 AF130053
217123_x_at pro-melanin-concentrating
hormone-like 1
2.6 0.03622296 PMCHL1 S64288
216934_at
Consensus includes gb:X81637.1
/DEF=H.sapiens clathrin light
chain b gene. /FEA=mRNA
/DB_XREF=gi:963046
/UG=Hs.73919 clathrin, light
polypeptide (Lcb)
2.6 0.04883313 X81637
219647_at popeye domain containing 2 2.6 0.04425998 POPDC2 NM_022135
215552_s_at estrogen receptor 1 2.5 0.04432944 ESR1 AI073549
208317_at
xylulokinase homolog (H.
influenzae)
2.5 0.04248382 XYLB NM_005108
1405_i_at chemokine (C-C motif) ligand 5 2.5 0.02605786 CCL5 M21121
210343_s_at
solute carrier family 22 (organic
anion transporter), member 6
2.5 0.01479391 SLC22A6 AF124373
Tabelle 6.2 Liste der durch C. albicans in Endothelzellen herunterregulierten Gene. Aufgeführt
sind die Ergebnisse einer Mikroarray-Untersuchung von HUVEC, die mit C. albicans-Blastosporen
(Stamm SC5314, MOI=1) für 5 Stunden co-inkubiert wurden. Als Einschlusskriterien wurden eine
mindestens 2,5-fachen Repression des Mittelwertes aus vier Oligonukleotid-Mikroarray-Analysen im
Vergleich zu unstimulierten HUVEC und ein p-Wert von ≤ 0,05 gewählt.
111

112

7 Zusammenfassung
Endothelzellen sind ein aktiver Bestandteil der angeborenen Immunabwehr des
Menschen gegen mikrobielle Pathogene. Unter ungünstigen Bedingungen kann die
Abwehrreaktion sogar zu einer lebensbedrohlichen Sepsis führen. Hier wurde die
bislang wenig bekannte Endothelantwort auf den fakultativ humanpathogenen
Hefepilz Candida albicans, einem der häufigsten Verursacher von letaler Sepsis
beim Menschen, näher untersucht.
Mittels Oligonukleotid-Mikroarray-Analyse von HUVEC nach Exposition mit C.
albicans konnten 56 hochregulierte Gene identifiziert werden, während 69 Gene
herunterreguliert wurden. Ein bedeutender Anteil der regulierten Gene ist an
Prozessen der angeborenen Immunantwort beteiligt und dient hauptsächlich der
Rekrutierung von Neutrophilen. Weitere Untersuchungen ergaben eine zentrale Rolle
des proinflammatorischen NF-κB-Weges bei der Regulation des Candida-induzierten
Transkriptoms von Endothelzellen. Es konnte gezeigt werden, dass C. albicans
diesen Signalweg sequenziell aktiviert. Zusätzlich konnte durch die Expression einer
dominant-negativen Mutante einer Signalkomponente des NF-κB-Signalwegs die
Candida-vermittelte Induktion von κB-abhängigen Genen gehemmt werden. Mit
einem pharmakologischen Ansatz wurde der p38 MAP Kinase-Signalweg als
weiterer bedeutsamer Signalweg identifiziert, der die Expression einzelner Candida-
Zielgene wie CXCL8/IL-8 moduliert. Schließlich wurde gezeigt, dass die Candidainduzierte
NF-κB-Aktivierung im untersuchten endothelialen Zellsystem unabhängig
von den Toll-like Rezeptoren TLR2 und TLR4 geschieht, die üblicherweise an der
Erkennung mikrobieller Pathogene beteiligt sind. Durch RNA-Interferenz-
Experimente konnte jedoch dargelegt werden, dass das Adaptermolekül MyD88 und
die Kinase IRAK1, die beide entscheidend an der TLR-vermittelten
Signaltransduktion beteiligt sind, essentiell für die Weiterleitung des Signals in
Endothelzellen sind. Nachfolgend konnte mit TLR3 zumindest einer der
signaltransduzierenden Rezeptoren identifiziert werden.
Als erste umfassende Untersuchung der endothelialen Antwort auf Candida albicans
erlaubt die vorliegende Arbeit neue Einblicke in die komplexen Signalmuster von
Endothelzellen, die dieser klinisch bedeutende Krankheitserreger auslöst.
113

114

8 Summary
Endothelial cells (ECs) actively participate in the innate defence against microbial
pathogens. Under unfavourable conditions defence reactions can even turn into lifethreatening
responses resulting in sepsis. Here the so far largely unknown EC
reaction patterns to Candida albicans were studied. C. albicans is a facultative
human pathogenic fungus and a major cause of lethality in septic patients.
Oligonucleotide microarray analysis revealed 56 genes that were transcriptionally upregulated
and 69 that were suppressed upon exposure of ECs to C. albicans. A
major portion of these genes is involved in defence mechanisms of the innate
immune system with a high representation of genes serving the recruitment of
neutrophils to sites of infection. Further examination of candidate signalling cascades
established a central role of the proinflammatory NF-κB pathway in the regulation of
the Candida-modulated transcriptome of ECs. It was shown that the NF-κB signalling
pathway becomes activated at various levels. In addition, expression of a dominant
negative mutant of a NF-κB signalling pathway compound blocked the Candidainduced
κB-dependent gene expression. Using a pharmacological approach the
stress-activated p38 mitogen-activated protein (MAP) kinase pathway was identified
as a second major regulatory pathway which critically contributes to the regulation of
selected Candida target genes such as CXCL8/IL-8. Candida-induced NF-κB
activation is mediated independently of Toll-like receptors (TLR) 2 and 4 that
commonly have been implicated with microbial pattern recognition. Nevertheless,
knock-down of the adapter molecule MyD88 and the essential downstream kinase of
TLR-, IL-1R- and IL-18R-signalling, IRAK1, suggested that recognition and signalling
via a TLR apart from TLR2/TLR4 is crucial for Candida-induced gene expression in
primary ECs. Finally, RNAi experiments indicate that most likely TLR3 represents this
receptor.
These data provide the first comprehensive analysis of endothelial gene responses
to Candida albicans and present novel insights into the complex signalling patterns
triggered by this important pathogen.
115

116

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the interleukin-8 promoter. The role of Oct-1 as a transcriptional repressor. J
Biol Chem, 272, 2396-2403.
178. Wyllie, D.H., Kiss-Toth, E., Visintin, A., Smith, S.C., Boussouf, S.,
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protein function for Toll-like receptor 1 in anti-bacterial responses. J Immunol,
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179. Yamamoto, M., Sato, S., Hemmi, H., Hoshino, K., Kaisho, T., Sanjo, H.,
Takeuchi, O., Sugiyama, M., Okabe, M., Takeda, K. and Akira, S. (2003) Role
of adaptor TRIF in the MyD88-independent toll-like receptor signaling
pathway. Science, 301, 640-643.
180. Yamaoka, S., Courtois, G., Bessia, C., Whiteside, S.T., Weil, R., Agou,
F., Kirk, H.E., Kay, R.J. and Israel, A. (1998) Complementation cloning of
NEMO, a component of the IkappaB kinase complex essential for NF-kappaB
activation. Cell, 93, 1231-1240.
181. Yan, S.R., Joseph, R.R., Wang, J. and Stadnyk, A.W. (2006)
Differential pattern of inflammatory molecule regulation in intestinal epithelial
cells stimulated with IL-1. J Immunol, 177, 5604-5611.
182. Yang, D., Chen, Q., Hoover, D.M., Staley, P., Tucker, K.D., Lubkowski,
J. and Oppenheim, J.J. (2003) Many chemokines including CCL20/MIP-
3alpha display antimicrobial activity. J Leukoc Biol, 74, 448-455.
183. Yang, R.B., Mark, M.R., Gray, A., Huang, A., Xie, M.H., Zhang, M.,
Goddard, A., Wood, W.I., Gurney, A.L. and Godowski, P.J. (1998) Toll-like
receptor-2 mediates lipopolysaccharide-induced cellular signalling. Nature,
395, 284-288.
184. Zen, K., Karsan, A., Eunson, T., Yee, E. and Harlan, J.M. (1998)
Lipopolysaccharide-induced NF-kappaB activation in human endothelial cells
134

involves degradation of IkappaBalpha but not IkappaBbeta. Exp Cell Res, 243,
425-433.
185. Zeuke, S., Ulmer, A.J., Kusumoto, S., Katus, H.A. and Heine, H. (2002)
TLR4-mediated inflammatory activation of human coronary artery endothelial
cells by LPS. Cardiovasc Res, 56, 126-134.
135

136

10 Abkürzungen
M
molar
mA Milliampere
MCS multiple cloning site
min Minuten
ml Milliliter
nt
Nukleotid
OD optische Dichte
p.a. pro analysi
BSA bovines Serumalbumin
bzw. beziehungsweise
C
Celsius
ca. circa
Ci Curie
dd H2O bidestilliertes Wasser
DMEM Dulbecco’s modified
Eagle’s medium
DMSO Dimethylsulfoxid
DNA Desoxyribonukleinsäure
ds doppelsträngig
DTT Dithiothreithol
dn dominant negativ
EC Endothelzelle
E. coli Escherichia coli
ECL enhanced
chemiluminescence
EDTA Ethylendiaminteraessigsäure
ERK extracellular-signal
regulated kinase
FBS fetal bovine serum
FITC Fluoreszein Isothiocyanatgekoppelt
h
Stunden
HRP Meerettich-Peroxidase
(horseradish peroxydase)
I.E. internationale Einheit
IL
Interleukin
kDa Kilodalton
LPS Lipopolysaccharid
PAGE Polyacrylamid-
Gelelektrophorese
PBS phosphate buffered saline
PFA Paraformaldehyd
PMB Polymyxin B sulfat
pmol picomol
PVDF Polyvinyldifluorid
RNA Ribonukleinsäure
RT Raumtemperatur
SDS Natriumdodecylsulfat
SEM Standardfehler (standard
error of the mean)
ss einzelsträngig
TBS Tris buffered saline
TBST Tris buffered saline
Tween 20
TLB Triton Lysispuffer
ü.N. über Nacht
V
Volt
z. B. zum Beispiel
µg Mikrogramm
µl Mikroliter
µm Mikrometer
137

138

11 Danksagung
Die vorliegende Arbeit wurde in der Zeit von September 2003 bis Oktober 2007 in
den Kliniken für Dermatologie, Venerologie und Allergologie des
Universitätsklinikums Würzburg und ab April 2005 des Universitätsklinikums
Mannheim der Universität Heidelberg unter der Leitung von Herrn Prof. Dr. Matthias
Goebeler durchgeführt. Sie wurde im November 2003 an der Fakultät für Pharmazie
und Chemie der Universität Würzburg als externe Promotion zugelassen.
An dieser Stelle möchte ich allen Personen herzlich danken, die mich während
meiner Promotionszeit durch tatkräftige Hilfe und wertvolle Ratschläge unterstützt
und somit einen Beitrag zum Gelingen dieser Arbeit geleistet haben.
Herrn Prof. Dr. M. Goebeler gilt mein ganz besonderer Dank für die Überlassung des
sehr interessanten Themas, die kompetente wissenschaftliche Betreuung, das
entgegengebrachte Vertrauen und die guten Arbeitsbedingungen.
Herrn Prof. Dr. Claus Herdeis vom Institut für Lebensmittelchemie und Pharmazie
der Universität Würzburg danke ich herzlich für die Übernahme des Korreferates.
Bei Herrn Dr. Marc Schmidt bedanke ich mich ganz herzlich für seine
Hilfsbereitschaft, für die besonders gute und enge Betreuung der experimentellen
und schriftlichen Arbeit, für sein immer offenes Ohr für Fragen, Probleme und
Diskussionen und für die Korrektur der Dissertation.
Bei Herrn Prof. Dr. Martin Leverkus von der Universitätshautklinik in Magdeburg
(vormals Würzburg) möchte ich mich für die Anregung und Planung des Projektes,
für viele hilfreiche Diskussionen und nicht zuletzt für seinen motivierenden
Optimismus bedanken.
An Frau Dr. Dorothee Viemann und Herrn Prof. Dr. Johannes Roth vom Institut für
Experimentelle Dermatologie der Universität Münster geht mein Dank für die
Durchführung der Mikroarray-Analysen und der real-time RT-PCRs.
139

Herrn Prof. Dr. Stephan Ludwig vom Institut für Molekulare Virologie der Universität
Münster gilt mein Dank für die Durchführung der Immunkomplex-Kinaseassays und
die angenehme Zusammenarbeit.
Herrn Dr. Alexei Gratchev danke ich für hilfreiche Ratschläge und motivierende
Gespräche beim Verfassen der Dissertation.
Meinen ehemaligen und jetzigen Kolleginnen und Kollegen im Labor danke ich für
eine wirklich tolle Zeit - für die gute Zusammenarbeit, die angenehme
Arbeitsatmosphäre, die Hilfsbereitschaft und das freundschaftliche Verhältnis über
die Arbeit hinaus, allen voran Nicole Endres, Nils Ohnesorge, Kerstin Sels, Tobias
Czymai, Ludmila Wagner, aber auch den Kolleginnen in Würzburg Sybille Schmid,
Atiye Toksoy, Sigrid Lempert und Martina Cimander.
Besonderer Dank gilt meinen Eltern, meiner Schwester und Steffen Flierl, die mich
durch ihr Verständnis und den uneingeschränkten Rückhalt im privaten Bereich
immer unterstützt und motiviert haben.
VIELEN DANK!
140

12 Lebenslauf
Persönliche Daten
Vorname, Name
Geburtsdatum, -ort
Staatsangehörigkeiten
Familienstand
Verena Müller
7. Februar 1977 ,Troisdorf-Sieglar
deutsch und französisch
ledig
Schulausbildung
1983-1987 Grundschule Saarbrücken-Dudweiler
1987-1996 Marienschule Saarbrücken, Abitur 1996
Pharmaziestudium
10/1996 - 03/2001 Universität Freiburg im Breisgau
1996-1998 Grundstudium, 1. Staatsexamen August 1998
1998-2001 Hauptstudium, 2. Staatsexamen März 2001
2001-2002 Praktisches Jahr
06/2002 3. Staatsexamen und Approbation
Promotion
09/2003 - dato Externe Promotion (Dr. rer. nat.) am Institut für Pharmazie
und Lebensmittelchemie der Universität Würzburg
Berufliche Tätigkeiten
05/2001 - 10/2001 Praktikum, Apotheke am Koppenplatz, Berlin
11/2001 - 04/2002 Praktikum, Apotheke des Universitätsklinikums, Freiburg
07/2002 - 08/2003 Tätigkeit als Apothekerin, Europa-Apotheke, Saarbrücken
09/2003 - dato Promotion, Hautklinik des Universitätsklinikums Würzburg
und Hautklinik des Universitätsklinikums Mannheim
141

142

13 Publikationsliste
13.1 Publikationen
Viemann, D., Schmidt, M., Tenbrock, K., Schmid, S., Müller, V., Klimmek, K., Ludwig,
S., Roth, J. and Goebeler, M. (2007) The Contact Allergen Nickel Triggers a Unique
Inflammatory and Proangiogenic Gene Expression Pattern via Activation of NF-κB
and Hypoxia-Inducible Factor-1α. J Immunol, 178, 3198-3207.
Müller, V., Viemann, D., Schmidt, M., Endres, N., Ludwig, S., Leverkus, M., Roth, J.
and Goebeler, M.; Candida albicans triggers activation of distinct signaling pathways
to establish a proinflammatory gene expression program in primary human
endothelial cells. J Immunol, in press
Toksoy, A., Müller, V., Gillitzer, R. and Goebeler, M. (2007) Biphasic expression of
stromal cell-derived factor-1 during human wound healing. Br J Dermatol
143

13.2 Publizierte Abstracts
Müller, V., Viemann, D., Schmidt, M., Tenbrock, K., Schmid, S., Klimmek, K., Ludwig,
S., Roth, J. and Goebeler, M. (2006) Nickel triggers a unique inflammatory and
proangiogeneticgene expression pattern via activation of NF-κB and HIF-1α. J Invest
Dermatol, 126, Supplement 3, s93
Viemann, D., Schmid, S., Tenbrock, K., Klimmek, K., Müller, V., Schmidt, M., Roth, J.
and Goebeler, M. (2006) Dissection of nickel-induced intracellular signal transduction
pathways and identification of novel target genes in primary human endothelial cells.
Exp Dermatol, 15, 257
Müller, V., Viemann, D., Schmidt, M., Leverkus, M., Roth, J. and Goebeler, M. (2005)
Gene expression profiling of human primary endothelial cells after infection with
Candida albicans. J Invest Dermatol, 125, Supplement 1s, A83
Müller, V., Ossadnik, M., Toksoy, A., Viemann, D., Roth, J., Ludwig, S., Bröcker,
E.B., Goebeler, M. and Leverkus, M. (2005) Differential roles of IKK1 and IKK2 for C.
albicans-induced NF-κB activation. Arch Dermatol Res, 296, 431 (A)
Müller, V., Schmid, S., Viemann, D., Roth, J., Ludwig, S., Bröcker, E.B., Leverkus, M.
and Goebeler, M. (2004) C. albicans activates human primary endothelial cells by
IKK2/IκBα/NF-κB- and p38-MAP Kinase-dependent intracellular signalling pathways.
J Invest Dermatol, 123, A71
144

14 Erklärung
Hiermit erkläre ich an Eides statt, dass ich die vorgelegte Dissertation
„Candida albicans-induzierte Genexpression in primären humanen
Endothelzellen - Mechanismen der Signaltransduktion und Möglichkeiten der
Intervention“
selbständig angefertigt und keine anderen als die angegebenen Quellen und
Hilfsmittel verwendet habe.
Ich erkläre außerdem, dass diese Dissertation weder in gleicher oder ähnlicher Form
bereits in einem anderen Prüfungsverfahren vorgelegen hat.
Ich habe früher außer den mit dem Zulassungsgesuch urkundlich vorgelegten
Graden keine weiteren akademischen Grade erworben oder zu erwerben versucht.
Mannheim, den 24.10.2007
Verena Müller
145