Candida albicans-induzierte Genexpression in primären ... - OPUS

Abbildung 3.1 Chipdesign eines Affymetrix GeneChips ® . Sondenpaare setzen sich aus zwei
einzelnen Sondenzellen, jeweils einer perfect match-Zelle und einer mismatch-Zelle, zusammen.
Verschiedene Sondenpaare, die das gleiche Gen repräsentieren, bilden Sondengruppen.
Der gesamte Human Genome U133A GeneChip ® von Affymetrix deckt etwa 13.000 Gene ab
(nach http://www.ohsu.edu/gmsr/amc/amc_technology.html).
Durchführung: Bei der Probenaufbereitung wurde aus den zu untersuchenden Zellen
mittels RNeasy Kit (Qiagen, Hilden) die mRNA gewonnen. Für eine Oligonukleotid-
Mikroarray-Analyse wurden jeweils 5 µg mRNA eingesetzt. Die mRNA wurde durch
reverse Transkriptase unter Verwendung eines Oligo(dT)-Primers in cDNA
umgeschrieben. Als nächstes diente diese cDNA als Template für eine in vitro-
Transkriptionsreaktion, bei der biotinylierte Nukleotide eingesetzt wurden und deren
Produkt amplifizierte, Biotin-markierte Antisense-cRNA war. Nach der
Fragmentierung dieser cRNA unter Verwendung von Mg 2+ und Hitze in Fragmente
von 25-200 Basen erfolgte die Hybridisierung auf den Chip durch eine 16-stündige
Inkubation bei 45°C. Die Färbung der auf die Sonden hybridisierten Fragmente
wurde mit einem biotin-bindenden Fluoreszenzfarbstoff (Phycoerythrin-gekoppeltes
Streptavidin) durchgeführt. Nach dem Waschen der Mikroarrays wurden die
Fluoreszenzsignale anschließend mittels HP G2500A Gene Array Scanner
(Affymetrix, Santa Clara, USA) detektiert.
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