Candida albicans-induzierte Genexpression in primären ... - OPUS

Nach 8 Stunden konnte für Candida eine 3-4fach erhöhte transkriptionelle Aktivität
gemessen werden, wohingegen mit TNFα eine 15-20fache Induktion des
Reporterkonstrukts beobachtet wurden (Abbildung 4.12).
Abbildung 4.12 Untersuchung der κB-abhängigen Transkription in HUVEC nach Stimulation
mit C. albicans mittels Promoter-Reporter-Assay. HUVEC wurden mit einem 6xκB-Promoterabhängigen
Firefly-Luciferasekonstrukt und einem Ubiquitin-Promoter-abhängigen Renilla-
Luciferasekonstrukt transfiziert. 48 Stunden nach der Transfektion wurden sie für acht Stunden mit
C. albicans (MOI=1, links) oder TNFα (2 ng/ml, rechts) stimuliert. Als Kontrolle dienten transfizierte
und mit Medium inkubierte HUVEC. Die Lysate der Endothelzellen wurden im Luminometer auf ihre
Luciferaseaktivität untersucht. Die erhaltenen Firefly-Luciferasewerte wurden durch Bezug auf die
Werte der Renilla-Luciferaseaktivität auf die gleiche Anzahl transfizierter Zellen normiert. Die
gezeigten Daten sind Mittelwerte aus drei unabhängigen Versuchen, die Fehlerbalken stellen die
Standardfehler dar.
4.3.3 Die C. albicans-vermittelte Genexpression hängt von der Aktivierung des
NF-κB-Signalweges ab
Es sollte im Folgenden geklärt werden, inwieweit der NF-κB-Signalweg tatsächlich
für die C. albicans-induzierte Stimulation von HUVEC verantwortlich ist. Dafür wurde
der Einfluss einer stabil exprimierten Kinase-inaktivierten Mutante von IKK2
(IKK2KD) in Endothelzellen auf die Induktion von Chemokinen nach
Candida-Exposition untersucht. Diese dominant-negative Mutante von IKK2 wurde
über den retroviralen Vektor pCFG5-IEGZ vermittelt, als Kontrolle kam der Vektor
ohne Transgen zum Einsatz. HUVEC wurden mit den Zellkulturüberständen der
virusproduzierenden Verpackerzellen ΦNX ampho infiziert und durch die
Vektor-vermittelte Zeozin-Resistenz selektioniert. Über die ebenfalls durch den
Vektor vermittelte GFP-Expression konnte die Rate der erfolgreich infizierten Zellen
im Durchflusszytometer quantifiziert werden (Abbildung 4.13). Nach drei Tagen
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