Candida albicans-induzierte Genexpression in primären ... - OPUS

der Luciferaseaktivität gemäß den Angaben des Herstellers unter Verwendung des
Dual-Glo Luciferase Assay Systems von Promega (Madison, USA). Aus den bei der
luminometrischen Messung der Luciferaseaktivitäten erhaltenen Werten wurde
jeweils der Quotient 6xκB-Firefly-Luciferase/Ubiquitin-Renilla-Luciferase berechnet.
Dieser Quotient stellt den normierten Wert für die NF-κB-Aktivierung in den Zellen
des jeweiligen 96er-Wells dar. Alle Werte wurden mindestens im Triplett ermittelt.
3.10 Durchflußzytometrie
Zur durchflußzytometrischen Analyse von Toll-like Rezeptoren auf HUVEC oder
HEK 293-Zellen wurden die Zellen mit 1 x Trypsin/EDTA von der Kulturplatte gelöst,
gewaschen und für 30 min mit 1 % BSA in PBS geblockt. Anschließend wurden sie
zunächst mit den jeweiligen Primärantikörpern bzw. der IgG-Isotypkontrolle inkubiert,
danach mit einem Cy5-gekoppelten Sekundärantikörper (jeweils 45 min bei RT). Alle
Antikörper wurden in 1 % BSA in PBS verdünnt. Zwischen den Färbeschritten
wurden die Zellen dreimal mit 1 % BSA in PBS gewaschen, nach der zweiten
Färbung dreimal mit PBS. Für die danach erfolgende FACS-Analyse wurden die
Zellen in einem geeigneten Volumen an PBS resuspendiert. Die Fluoreszenz des
Cy5-konjugierten Farbstoffs wurde im vierten Kanal (FL-4) detektiert.
Für die Färbung von ICAM-1 auf stimulierten HUVEC wurde eine 3-Schritt-Methode
angewendet. Dafür wurden die Zellen zunächst 30 min auf Eis mit 1 % BSA in PBS
geblockt und anschließend mit Primärantikörper gegen ICAM-1 bzw. mit IgG-
Isotypkontrolle inkubiert (45 min auf Eis). Der verwendete Sekundärantikörper war
bei dieser Methode Biotin-gekoppelt, für die Farbreaktion wurde dann Streptavidin-
PE-Cy5 eingesetzt, das im dritten Kanal (FL-3) gemessen wurde. Zwischen den
einzelnen Färbeschritten wurden die Zellen je dreimal mit einer Lösung von 1 % BSA
in PBS gewaschen. Alle Färbeschritte dauerten 45 min und wurden auf Eis
durchgeführt. Nach der Farbreaktion wurden die Zellen in PBS gewaschen und für
die folgende FACS-Analyse in einem adäquaten Volumen an PBS resuspendiert.
Zellen, die durch Transfektion oder retrovirale Infektion das grün fluoreszierende
Protein GFP (green fluorescent protein) exprimierten, wurden ohne vorherige
Färbung im ersten Kanal (FL-1) des FACS-Gerätes gegen nichtfluoreszierende
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