Candida albicans-induzierte Genexpression in primären ... - OPUS

3.2.1 Retrovirale Infektion von HUVEC
Zur Überexpression dominant-negativer Mutanten von MyD88 und IRAK1 in HUVEC
kam der retrovirale Vektor pCFG5-IEGZ zum Einsatz. Plattierte HUVEC wurden
dreimal innerhalb von zwei Tagen (im Abstand von mindestens 6 h) mit filtriertem
Überstand (Porengröße des Filters 0,8 µm) der virusproduzierenden
Verpackerzelllinie ΦNX ampho, die diesen Vektor mit oder ohne Transgen
exprimierten, in Anwesenheit von 5 µg/ml Polybrene infiziert. 6 h nach der dritten
Infektion wurde das Infektionsmedium durch Kulturmedium ersetzt und die Zellen
normal kultiviert. Zur Selektion infizierter Klone wurde 48 Stunden nach der letzten
Infektion 250 µg/ml Zeozin in das Kulturmedium gegeben. Die überlebenden Klone
wurden 3 Tage unter Selektion kultiviert, 1 Tag in Medium ohne
Selektionsantibiotikum gehalten und anschließend für verschiedene Untersuchungen
verwendet.
Für die retrovirale Infektion von HUVEC mit small hairpin RNA (shRNA) wurden
Doppelstrang-Oligonukleotide in den retroviralen Vektor pRetroSuper kloniert
(Abschnitt 3.11.7). Dieser Vektor und der leere Kontrollvektor wurden jeweils in die
Verpackerzelllinie FLYRD-18 transfiziert und deren Zellkulturüberstände zur Infektion
von HUVEC genutzt (siehe oben). Zur Selektion infizierter HUVEC wurde bei diesen
Ansätzen dem Kulturmedium für 3 Tage 1 µg/ml Puromycin zugesetzt.
Die Verpackerzelllinien wurden mittels Lipofectamine 2000, FuGENE 6 oder
Kalziumphosphat-Methode transfiziert und sowohl unselektioniert als auch stabil
transfiziert zur Gewinnung von Kulturüberstand verwendet.
3.2.2 DEAE-Dextran-Transfektion
Die nachfolgende Methode ist für HUVEC in 10 cm-Petrischalen beschrieben. Zu
einmal mit HEPES/PBS (1 mM) gewaschenen Zellen wurde eine Lösung aus 4 ml
HEPES/PBS (1 mM), 100 µl DEAE-Dextran-Lösung (10 mg/ml) und 4 µg zu
transfizierender DNA gegeben. Dieser Ansatz wurde für 30 min bei 37°C und
5 % CO 2 inkubiert. Anschließend wurden 6 ml M199, supplementiert mit 10 % FBS
und 0,15 mM Chloroquine, dazupipettiert und die Zellen für weitere 3 h inkubiert.
Danach wurde das Medium entfernt, 3 ml serumfreies M199 mit 10 % DMSO
zugegeben und die Schalen 2,5 min bei Raumtemperatur geschwenkt. Anschließend
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