Candida albicans-induzierte Genexpression in primären ... - OPUS

Klonierung: Für die vorliegende Arbeit wurden 2 bzw. 5 shRNA-Vektorplasmid-
Konstrukte gegen verschiedene Zielsequenzen in der mRNA von MyD88 oder IRAK1
kloniert und in transienten Transfektionsversuchen auf einen Knock-down des
Zielproteins untersucht. Keine der verwendeten Zielsequenzen zeigte Homologien zu
anderen publizierten cDNAs.
Zur Klonierung der Konstrukte wurden je zwei komplementäre Oligonukleotide
(64-mere) zu einem doppelsträngigen Fragment mit jeweils einem 5‘-Überhang
kondensiert. Die Überhänge waren so gewählt, dass sie sich in eine Bgl II- bzw. eine
Hind III-Schnittstelle einpassen konnten. Alle Oligonukleotide wurden mit Hilfe der
iRNAi 2.0 Software (NKI, Nederlands Kanker Instituut, Amsterdam, NL) entworfen
und von Sigma Genosys synthetisiert. Die Loopsequenz basierte auf Angaben von
Brummelkamp et al. (Brummelkamp et al., 2002). Die Oligonukleotide waren wie folgt
aufgebaut:
Vorwärtsprimer:
5‘- GATCCC (Präfix) - 19 nt (Sense-Targetsequenz) - TTCAAGAGA (Loopsequenz) -
19 nt (Antisense-Targetsequenz) - TTTTTGGAAAA (Suffix) -3‘
Rückwärtsprimer:
5‘- AGCTTTTCCAAAAA (Präfix) – 19 nt (Sense-Targetsequenz) - TCTCTTGAA
(Loopsequenz) - 19 nt (Antisense-Targetsequenz) – GGG (Suffix) -3‘.
Beide Oligonukleotide wurden jeweils in H 2 O zu 1 mM gelöst. Von beiden Lösungen
wurde je 1 µl in ein Mikrozentifugenröhrchen vorgelegt. Es wurden dann 48 µl eines
„Annealing Buffers“ (10 mM Kaliumacetat, 30 mM HEPES-KOH (pH 7,4), 2 mM
Magnesiumacetat) zugegeben und alles zusammen in einem Heizblock für 4 min auf
95°C erhitzt. Danach wurde der Heizblock ausgeschaltet und die Probe darin
langsam auf Raumtemperatur abgekühlt. Während dieser Zeit hybridisierten die
komplementären Oligonukleotide zu einem dsDNA-Fragment. Dieses Fragment
wurde dann in den Bgl II- und Hind III-verdauten Vektor pRetroSuper kloniert
(Brummelkamp et al., 2002). Zum Verdau des Vektors wurde folgender Ansatz
pipettiert und für 2 h bei 37°C inkubiert: 1 µl Bgl II, 1 µl Hind III, 5 µl Tango-Puffer,
5 µg Vektor pRS (1 µg/µl) und 13 µl H 2 O. Anschließend wurde der verdaute Vektor
über eine horizontale 1 %ige-Agarose-Gelelektrophorese aufgereinigt und mittels
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