Candida albicans-induzierte Genexpression in primären ... - OPUS

94 µl OptiMEM) versetzt. Beide Lösungen wurden bei Raumtemperatur zunächst 10
min einzeln, anschließend 30 min zusammengemischt stehen gelassen. Im Anschluß
an diese Inkubationszeiten wurden 800 µl OptiMEM dazugegeben. Nach
zweimaligem Waschen der Zellen mit OptiMEM wurde der siRNA-Oligofectamine-
Ansatz zu den Zellen gegeben. Die HUVEC wurden vier Stunden mit dieser
Mischung bei 37°C und 5 % CO 2 kultiviert, bevor die Mischung durch normales
Kulturmedium ersetzt wurde.
3.2.5 Weitere Transfektionsmethoden
Lipofectamine 2000 und FuGENE 6 wurden nach den Angaben der Hersteller für die
stabile Transfektion von retroviralen Vektoren in die Verpackerzelllinien ΦNX ampho
und FLYRD-18 verwendet.
3.3 Oligonukleotid-Mikroarray-Analyse
Für die vorliegende Arbeit wurden die Genexpressionsanalysen unter Verwendung
von Affymetrix GeneChips ® Human Genome U133A (Affymetrix, Santa Clara, USA)
durchgeführt. Diese Chips decken ungefähr 13.000 humane Transkripte ab, die
genaue Liste der enthaltenen Gene ist unter www.affymetrix.com einzusehen.
Ein Affymetrix GeneChip ® ist in kleine quadratische Flächen, sogenannte
Sondenzellen (probe cells oder features) unterteilt, die jeweils Millionen von gleichen
Sonden enthalten. Sonden sind 25 Basen lange, für ein Gen spezifische und zur
codierenden Region des Gens komplementäre Oligonukleotide. Zwei Sondenzellen
bilden ein Sondenpaar (probe pair). Es besteht jeweils aus einer perfect match-Zelle
(Sonde ist komplementär zur entsprechenden Sequenz des Gens) und einer
mismatch-Zelle (Sonde ist nicht vollständig komplementär zur entsprechenden
Sequenz des Gens, da hier ein Nukleotid ausgetauscht wurde). Die miss match-
Zellen dienen der Kontrolle auf nicht-spezifische Bindungen. Jedes Gen wird durch
bis zu 20 unterschiedliche Sondenpaare repräsentiert, die zusammen eine
Sondengruppe (probe set) bilden. Durch die mehrfache Vertretung eines Gens auf
einem Chip wird der Array weniger störanfällig (vgl. Abbildung 3.1).
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