Candida albicans-induzierte Genexpression in primären ... - OPUS

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Abbildung 4.18 Mit C. albicans konditionierte Medien induzieren keine CXCL8-Expression in HUVEC. Konditioniertes Medium wurde generiert, indem HUVEC für vier bzw. acht Stunden mit C. albicans (MOI=1) oder nur mit Medium in gleichem Mediumvolumen kultiviert wurden. Der Zellkulturüberstand wurde anschließend mittels 0,45 µm-Filter von eventuell darin vorkommenden Zellen, Zellbestandteilen oder Blastosporen gereinigt. Die filtrierten Überstände wurden dann für weitere acht Stunden auf HUVEC gegeben, parallel dazu wurden HUVEC mit C. albicans (MOI=1) bzw. Medium kultiviert. Die durch ELISA erhaltenen CXCL8-Werte der Zellkulturüberstände wurden jeweils auf die Mediumkontrolle bezogen. Die Werte der konditionierten Medien sind Differenzen aus den CXCL8-Werten vor und nach der letzten achtstündigen Kultivierung. Dargestellt sind Mittelwerte und Standardfehler (± SEM) aus drei unabhängigen Versuchen. 70
4.4 C. albicans aktiviert die p38 MAP Kinase 4.4.1 Stimulation mit C. albicans führt zur Aktivierung von p38 Es ist bekannt, dass die Induktion verschiedener Gene der Kooperation von unterschiedlichen Signalkaskaden bedarf (Goebeler et al., 2001; Viemann et al., 2004). Beispielsweise erfordert eine effiziente Induktion von CXCL8 neben der Regulation durch NF-κB auch die Aktivierung der p38 MAP Kinase (Hippenstiel et al., 2000; Hoffmann et al., 2002; Holtmann et al., 1999). Es sollte deshalb zunächst untersucht werden, ob C. albicans in HUVEC nicht nur den NF-κB-Signalweg, sondern auch p38 aktiviert. Dazu wurden Immunkomplex-Kinaseassays durchgeführt unter Verwendung von 3pK und ATF-2 als Substrat für p38 (Abbildung 4.19). Candida aktivierte endotheliales p38 innerhalb von 2-4 h nach dem Beginn der Co- Kultur, während die maximale Aktivität von p38 durch TNFα innerhalb von 20 min erreicht wurde. Abbildung 4.19 C. albicans führt zu p38-Aktivierung in HUVEC. HUVEC wurden entweder mit C. albicans (MOI=1, links) oder mit TNFα (2 ng/ml, rechts) über verschiedene Zeiten stimuliert. Zu den angegebenen Zeitpunkten wurden Lysate der Endothelzellen hergestellt und diese im Immunkomplex- Kinaseassay auf Phosphorylierung von 3pK bzw. ATF-2 (beides Substrate von p38) untersucht. Zur Kontrolle der gleichmäßigen Beladung wurden die Lysate im Western Blot auf p38 gefärbt. 4.4.2 Die Candida-induzierte Expression ausgewählter Gene unterliegt der Co- Regulation durch p38 Um die funktionelle Relevanz von p38 für die C. albicans-induzierte Chemokinexpression zu untersuchen, wurden HUVEC mit dem pharmakologischen p38-Inhibitor SB202190 in verschiedenen Konzentrationen präinkubiert. Dies führte bei der anschließenden Stimulation zu einer dosisabhängigen Hemmung der C. albicans-induzierten CXCL8-Expression. Die Auswertung mittels Western Blot und ELISA ergab, dass die Konzentrationen an p38-Inhibitor, die für einen 50 %igen Hemmeffekt (IC 50 ) nötig waren, für C. albicans wie auch für TNFα in einem Bereich zwischen 1 und 0,1 µM lagen (Abbildung 4.20 (A) und (B)). 71
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