Candida albicans-induzierte Genexpression in primären ... - OPUS

IκBα-Phosphorylierung innerhalb von 2-4 h (Abbildung 4.11 (A), links). Dagegen
erfolgte die TNFα-induzierte IκBα-Phosphorylierung auffallend schneller, mit einer
maximalen Aktivierung nach 20 min (Abbildung 4.11 (A), rechts), was mit bereits
publizierten Daten korrelierte (Goebeler et al., 2001). Die Kinetik der induzierten
IKK2-Aktivität wurde dann mit dem Zeitverlauf der IκBα-Degradation verglichen, der
mittels Western Blot-Analyse untersucht wurde. Bei beiden Stimuli verlief die
Degradation von IκBα ähnlich zu den Aktivitätsmustern von IKK2 (Abbildung 4.11
(B)).
Abbildung 4.11 Aktivierung von IKK2 und Degradation von IκBα in HUVEC nach Stimulation
mit C. albicans. HUVEC wurden mit C. albicans (MOI=1) (links) oder TNFα (2 ng/ml) (rechts)
stimuliert und zu verschiedenen Zeitpunkten lysiert. Der zeitliche Verlauf der Phosphorylierung von
IκBα wurde mittels Immunkomplex-Kinaseassay untersucht. Als Kontrolle für eine gleiche Beladung
der Banden wurden dieselben Lysate im Western Blot auf IKK2 gefärbt (A). Die Degradation von IκBα
wurde analysiert, indem unter gleichen Bedingungen gewonnene Lysate im Western Blot untersucht
wurden. Als Ladekontrolle wurden die Membranen gestrippt und mit einem Anti-ERK2 Antikörper
gefärbt (B).
4.3.2 Stimulation mit C. albicans führt zu NF-κB-abhängiger Genexpression
Da beide Stimuli die Phosphorylierung und die Degradation von IκBα induzierten,
sollte nun die NF-κB-Transkriptionsaktivität mittels Promoter-Reporter-Assays
(Luciferase-Assay) untersucht werden. HUVEC wurden dafür mit einem
6xκB-Promoter-abhängigen Firefly-Luciferasekonstrukt und einem Ubiquitin-
Promoter-abhängigen Renilla-Luciferasekonstrukt transfiziert und 48 Stunden später
mit C. albicans oder TNFα stimuliert.
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