Candida albicans-induzierte Genexpression in primären ... - OPUS

Abbildung 4.28 Eine shRNA gegen IRAK1 hemmt die TLR2- und TLR4-vermittelte κB-abhängige
Transkription. HEK293-hTLR1/2 und HEK293-hTLR4 wurden transient mit dem retroviralen Vektor
pRetroSuper (pRS) bzw. dem Vektor mit der shRNA gegen IRAK1 (pRS-IRAK1) zusammen mit einem
6xκB-Promoter-abhängigen Firefly-Luciferasekonstrukt und einem Ubiquitin-abhängigen Renilla-
Luciferasekonstrukt transfiziert. Nach 48 Stunden wurden die transfizierten HEK293-hTLR1/2 für acht
Stunden mit Pam3CSK4 (200 ng/ml), C. albicans (MOI=1) oder nur mit Medium als Kontrolle
behandelt (links). Die transfizierten HEK293-hTLR4 wurden mit LPS (100 ng/ml), C. albicans oder
Medium behandelt. Anschließend wurden die Zellen lysiert und ihre Lumineszenz gemessen. Die
erhaltenen Firefly-Luciferasewerte wurden mittels der Renilla-Luciferasewerte auf gleiche Zellzahlen
normiert und das Ergebnis auf die Werte der unstimulierten Kontrollen bezogen. Die dargestellten
Daten sind Mittelwerte und Standardfehler aus drei unabhängigen Versuchen.
Diese funktionell getestete shRNA gegen IRAK1 wurde für weitere Untersuchungen
in die retrovirale Verpackerzelllinie FLYRD-18 transfiziert, die einen besonders hohen
Virustiter erzielt. Durch retrovirale Infektion wurde die shRNA dann stabil in HUVEC
exprimiert. Nach Selektion der infizierten Zellen wurden diese mit IL-1β, TNFα und
C. albicans stimuliert. Die Expression der shRNA führte in HUVEC zu einem nahezu
kompletten Knock-down des IRAK1-Proteins. Wie erwartet war die IL-1β-induzierte
CXCL8-Expression nach dem Knock-down von IRAK1 größtenteils gehemmt,
wohingegen die unabhängig von IRAK1 regulierte, TNFα-induzierte Expression des
Chemokins nicht beeinflusst wurde. Der Knock-down von IRAK1 in C. albicansstimulierten
HUVEC bewirkte, dass die Candida-induzierte CXCL8-Synthese fast
vollständig unterblieb (Abbildung 4.29 (A)). Ähnliche Beobachtungen wie im Western
Blot konnten für die CXCL8-Expression auch mittels ELISA gemacht werden
(Abbildung 4.29 (B), links). Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass auch die
Expression von CCL20 in den IRAK1-herunterregulierten HUVEC gehemmt war
(Abbildung 4.29 (B), rechts).
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