Candida albicans-induzierte Genexpression in primären ... - OPUS

3.7 Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA)
Zum Nachweis von CXCL8 im Zellkulturüberstand verschiedener Zellen wurden
enzymgekoppelte Immunnachweise durchgeführt. Dafür wurde der
Zellkulturüberstand nach Ablauf der Stimulationszeit in ein Mikrozentrifugenröhrchen
überführt, zur Abtrennung von eventuell enthaltenen Zellen und Zellbestandteilen bei
5000 rpm zentrifugiert und bis zur weiteren Verwendung bei -20°C gelagert. Die
Konzentration von CXCL8 in diesen Proben wurde mit dem kommerziell erhältlichen
BD OptEIA human IL-8 ELISA Set (BD Pharmingen, Franklin Lakes, USA) nach den
Angaben des Herstellers gemessen. Dabei wurde CXCL8 von spezifischen
Antikörpern auf der Oberfläche einer Mikrotiterplatte gebunden und durch einen
Detektionskomplex nachgewiesen. Der Komplex wurde mit Hilfe einer Farbreaktion
am ELISA-Reader quantitativ über den Vergleich mit einer internen
Standardkonzentrationsreihe ausgewertet. Das gleiche Prinzip wurde zur
Quantifizierung von CCL20 (MIP-3α) in Totalzelllysaten mittels Duo Set human MIP-
3α ELISA Development System (R&D, Minneapolis, USA) angewendet. Die durch
ELISA erhaltenen Werte wurden auf den Proteingehalt der Proben normiert.
Alle Proben wurden immer mindestens in Doppelbestimmungen analysiert und die
erhaltenen Werte auf unstimulierte Kontrollen bezogen dargestellt.
3.8 Protein-Aktivierungsassay (Immunkomplex-Kinaseassay)
Prinzip: Kinasen übertragen γ-Phosphatreste von Adenosintriphosphat (ATP) auf
Zielmoleküle. Die enzymatische Aktivität von Kinasen lässt sich messen, indem man
die Übertragung von radioaktiv markiertem [γ 32 -P-] ATP auf spezifische Substrate
quantitativ bestimmt. In der Praxis wird die zu untersuchende Kinase zunächst mit
spezifischen Antikörpern aus den Zelllysaten immunpräzipitiert. Nach der
Präzipitation wird die Kinase dann in Anwesenheit von radioaktivem [γ 32 -P-] ATP mit
einem spezifischen Substrat inkubiert und die Einbaurate von radioaktivem 32 P in das
Substratmolekül durch Autoradiographie gemessen.
Durchführung: HUVEC wurden bis zum Erreichen eines Konfluenzgrades von
70-80 % kultiviert. Dann wurden sie wie in Abschnitt 3.1.4 beschrieben mit
C. albicans bzw. TNFα für die angegebenen Zeitperioden stimuliert. Anschließend
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