Candida albicans-induzierte Genexpression in primären ... - OPUS

(IRAK1), um in eine Aktivierung von NF-κB zu münden. MyD88 und IRAK1 sind also
funktionell am „Flaschenhals“ der TLR-abhängigen Signaltransduktion lokalisiert. Zur
Klärung der Rolle dieses Signalweges bei der Candida-induzierten Aktivierung von
Endothelzellen sollten daher diese beiden Moleküle mittels RNA-Interferenz
ausgeschaltet werden bzw. deren Funktion durch die retroviral vermittelte Expression
von dominant-negativen Mutanten gehemmt werden (vgl. Abbildungen 1.2 und 3.3).
Zunächst sollten MyD88 oder IRAK1 über small hairpin RNA (shRNA), vermittelt
durch den retroviralen Vektor pRetroSuper (pRS), ausgeschaltet werden. Dafür
wurden mehrere Konstrukte für unterschiedliche shRNA in den Vektor kloniert und
zur funktionellen Testung in U2OS-Testzellen transfiziert. Durch routinemäßige
Knock-down-Kontrollen mittels Western Blot gelang es, unter diesen
shRNA-Konstrukten eine funktionell zufriedenstellende shRNA zu finden, die einen
guten Knock-down des IRAK1-Proteins in den U2OS erreichte (Daten nicht gezeigt).
Parallel wurde eine funktionelle Testung der shRNA durchgeführt, indem der für die
shRNA gegen IRAK1 codierende Vektor (pRS-IRAK1) bzw. der leere Vektor
(pRS LV) in HEK293-hTLR1/2 und in HEK293-hTLR4 transfiziert wurden. Im
6xκB-abhängigen Promoter-Reporter-Assay konnte beobachtet werden, dass
pRS-IRAK1-transfizierte und mit Pam3CSK4-stimulierte HEK293-hTLR1/2 deutlich
weniger κB-abhängige Transkriptionsaktivität zeigten als solche, die mit pRS LV
transfiziert und ebenso mit Pam3CSK4 stimuliert worden waren (Abbildung 4.28,
links). Die gleiche Beobachtung konnte für LPS-stimulierte HEK293-hTLR4 gemacht
werden. Auch hier zeigten die pRS-IRAK1-transfizierten Zellen eine deutlich
verringerte Transkriptionsaktivität gegenüber pRS LV-transfizierten Zellen (Abbildung
4.28, rechts). Wie schon zuvor gezeigt (Abbildung 4.26 (B)), konnte in keiner der
beiden Zelllinien mit C. albicans eine gesteigerte Transkriptionsaktivität induziert
werden.
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