Candida albicans-induzierte Genexpression in primären ... - OPUS

3 Methoden
3.1 Zellkultur
Alle Zellkulturarbeiten wurden unter sterilen Bedingungen (unter Laminar Air Flow,
Verwendung steriler Lösungen und Medien, steriles Verbrauchsmaterial)
durchgeführt. Sämtliche primären Zellen und Zelllinien wurden bei 37°C, 5 % CO 2
und hoher Luftfeuchtigkeit kultiviert.
3.1.1 Lagerung, Einfrieren und Rekultivierung von Zellen
Die Langzeitlagerung aller Zellen erfolgte in flüssigem Stickstoff. Zum Einfrieren der
Zellen wurden diese durch Inkubation mit 1 x Trypsin/EDTA von der Kulturplatte
gelöst, die Wirkung des Trypsins mit gleichem Volumen an 10 %igem FBS in PBS
abgestoppt, die Zellen pelletiert und in 1 ml Einfriermedium bestehend aus 10 %
DMSO, 20 % FBS und 70 % des jeweiligen Kulturmediums aufgenommen. Je nach
Bedarf wurden die Zellen in kleinere Portionen aufgeteilt und über Nacht bei -80°C in
einem Styroporständer eingefroren. Am nächsten Tag wurden die Aliquots in
flüssigen Stickstoff überführt. Zur Rekultivierung der Zellen wurden diese in einem
Wasserbad bei 37°C aufgetaut, in vorgewärmtem Medium suspendiert und auf
Kulturgefäße verteilt. Am folgenden Tag wurde zur Entfernung von DMSO-Resten
das Medium gewechselt.
3.1.2 Zellkultur
3.1.2.1 HUVEC
Die primären humanen Nabelschnurendothelzellen wurden bei den Firmen Cambrex
(East Rutherford, USA) und Promocell (Heidelberg) erworben. Die Stockaliquots
wurden bis zur Passage 3 vermehrt und zur Lagerung in flüssigen Stickstoff
überführt. Bei Bedarf wurden HUVEC mit einer Dichte von mindestens 3500
Zellen/cm 2 auf Zellkulturgefäße ausgesät. Bis zum Erreichen der gewünschten
Konfluenz wurde alle 2-3 Tage das Medium gewechselt.
Zellkulturmedium: Mischung aus 1 Teil EBM Basal Medium mit EGM-SingleQuot
Supplements and Growth Factors (500 ml Basalmedium werden supplementiert mit
10 ml Fetal Bovine Serum (FBS), 0,5 ml human Endothelial Growth Factor (hEGF),
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