Candida albicans-induzierte Genexpression in primären ... - OPUS

unterschiedlicher Antikörper im Western Blot nicht gelang, konnte der Hemmeffekt
der Depletion auf die read-out-Moleküle CXCL8 und CCL20 nach Stimulation der
HUVEC durch IL-1β (Positivkontrolle) und C. albicans im Western Blot und im ELISA
beobachtet werden (Abbildung 4.30 (A) und (B)). Die Stimulation mit TNFα diente als
Negativkontrolle und führte unabhängig von der transfizierten siRNA zu einer
gleichbleibend hohen CXCL8-Expression (Abbildung 4.30 (A)).
Abbildung 4.30 Die Depletion von MyD88 durch siRNA hemmt die C. albicans-induzierte
Expression von CXCL8 und CCL20 in HUVEC. (A) HUVEC wurden unter Verwendung des
Transfektionsreagenzes Oligofectamine mit einer validierten siRNA gegen MyD88 oder einer
unspezifischen siRNA (scrambled siRNA) transfiziert und 48 Stunden später für acht Stunden mit
IL-1β (10 U/ml), TNFα (2 ng/ml) oder C. albicans (MOI=1) stimuliert. Die daraus gewonnenen
Totalzelllysate wurden mittels Western Blot auf CXCL8 untersucht. Als Ladekontrolle diente eine
Färbung von ERK2. Gezeigt ist ein repräsentativer Versuch von drei unabhängigen Versuchen.
(B) HUVEC wurden wie in (A) beschrieben transfiziert und stimuliert. Die Zellkulturüberstände wurden
mittels ELISA auf CXCL8 untersucht. Der Gehalt an CCL20 in den Totalzelllysaten wurde mittels
ELISA ermittelt und unter Berücksichtigung der Proteinkonzentrationen der einzelnen Proben
berechnet. Dargestellt sind die Mittelwerte und Standardfehler aus drei (links) bzw. zwei (rechts)
unabhängigen Versuchen.
Als weiterer Beleg für die Beteiligung von MyD88 und IRAK1 an der C. albicansvermittelten
Aktivierung von HUVEC wurden zwei Konstrukte verwendet, die für
dominant-negative Mutanten dieser Proteine kodieren (MyD88dn-Myc und
IRAK1-DD-HA). Beide Konstrukte wurden dafür in den retroviralen Vektor
pCFG5-IEGZ kloniert und anschließend über die Verpackerzelllinie ΦNX ampho in
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