Candida albicans-induzierte Genexpression in primären ... - OPUS

3.1.2.4 ΦNX ampho und FLYRD-18
Die retroviralen Verpackerzelllinien ΦNX ampho und FLYRD-18 und deren stabile
Transfektanten wurden für die Dauerkultur alle 2-3 Tage mit frischem Medium
versorgt und zweimal pro Woche vor Erreichen der Konfluenz gesplittet. Dafür
wurden ebenso verfahren wie unter 3.1.2.2 beschrieben.
Zellkulturmedium: DMEM supplementiert mit 10 % FBS und 30 µg/ml Gentamicin.
3.1.3 Herstellung verschiedener Präparationen von Candida albicans
Für alle Untersuchungen wurde der C. albicans-Stamm SC5314 verwendet (Gillum et
al., 1984). Aus C. albicans-Kolonien auf einem Sabouraud-Glukose-Agar wurde nach
den Herstellerangaben in einem Microbank Kryoröhrchen (Mast Diagnostica,
Bootle, GB) eine Stammsuspension hergestellt und bei -80°C aufbewahrt.
3.1.3.1 Lebende Hefezellen
Um eine einheitliche morphologische Form der C. albicans-Zellen als Hefe zu
erreichen, wurden jeweils am Vorabend eines Versuches 20 ml Medium M199 (mit
HCl auf pH 4 eingestellt und sterilfiltriert) mit einer Impfperle aus der gefrorenen C.
albicans-Suspension geimpft. Dieser Ansatz wurde über Nacht bei 28°C mit 200 rpm
geschwenkt.
3.1.3.2 Hitze-inaktivierte Hefezellen
Zur Analyse von Hitze-inaktivierten C. albicans wurden über Nacht Hefezellen
generiert wie unter 3.1.3.1 beschrieben. Am Versuchstag wurde 1 ml der
Candida-Kultur entnommen und für 30 min bei 95°C inkubiert.
3.1.3.3 SB202190-vorbehandelte Hefezellen
SB202190-vorbehandelte Hefezellen wurden generiert, indem über Nacht eine
SB202190-Lösung (10 µM, in Medium M199 mit pH 4) als Anzuchtmedium
eingesetzt wurde.
3.1.4 Stimulation und Inhibitorinkubation
Für Stimulationen mit C. albicans wurde 24 Stunden vor Versuchsbeginn bei allen
Zellen das übliche Kulturmedium durch antibiotikafreies, ansonsten gleiches Medium
ersetzt. Soweit nicht anders angegeben, war das Medium während der Stimulation
für alle Zellen M199 supplementiert mit 7 % FBS. Zur Stimulation mit C. albicans
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