Candida albicans-induzierte Genexpression in primären ... - OPUS

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3.6 Western Blot 3.6.1 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) Zur Analyse von Proteinen wurde das Proteinlysat zunächst durch eindimensionale Gelelektrophorese unter denaturierenden Bedingungen fraktioniert, wobei die einzelnen Proteine entsprechend ihrem Molekulargewicht aufgetrennt wurden. Die dazu benutzten SDS-Polyacrylamidgele setzten sich zu ca. 1/3 aus einem 3 %igen Sammelgel und ca. 2/3 aus einem Trenngel mit abweichendem pH-Wert zusammen. Der Acrylamidgehalt des Trenngels (8 % bis 12 %) richtete sich dabei nach der Größe der zu untersuchenden Proteine. Die nachfolgende Tabelle enthält die Pipettierschemata, nach denen die einzelnen Gele gegossen wurden, sowie die Auftrennungsoptima der einzelnen Trenngele. Die Zusammensetzung der Vormixe für Trenngel und Sammelgel sind in Abschnitt 2.2.1 beschrieben. Konzentration des Sammelbzw. Trenngels 3 % 8 % 10 % 12 % 30 % Acrylamid 1 ml 2.66 ml 3.33 ml 4 ml Trenngel-Vormix - 5 ml 5 ml 5 ml Sammelgel-Vormix 5 ml - - - dd H2O 4 ml 2.33 ml 1.66 ml 1 ml Ammoniumpersulfat (APS) 150 µl 100 µl 100 µl 100 µl Temed 10 µl 4 µl 4 µl 4 µl Auftrennungsoptimum - > 90 kDa 40-90 kDa < 40 kDa Das polymerisierte Gel wurde in eine Vertikalapparatur eingesetzt und das Reservoir mit Laufpuffer (Abschnitt 2.2.1) aufgefüllt. Anschließend wurden die mit SDS- Probenpuffer versetzten Proben auf das Sammelgel gegeben. Pro Geltasche wurden dabei bis zu 30 µg Protein geladen. Die Proteingemische wurden dann bei einer konstanten Stromstärke von 35-50 mA aufgetrennt. 38
3.6.2 Proteintransfer Für den immunologischen Nachweis der in der SDS-PAGE aufgetrennten Proteine wurden diese mittels einer Blotting-Apparatur im Nass-Blot-Verfahren je nach Empfehlung der Antikörperhersteller auf eine Nitrozellulosemembran (0,2 µm, Schleicher und Schüll, Dassel) bzw. eine methanolaktivierte Polyvinyldifluorid- Membran (Immobilon ® , Millipore, Schwalbach) übertragen. Dafür wurde für 90 min eine Stromstärke von 400 mA an die Blotting-Apparatur angelegt. 3.6.3 Immundetektion Zur Absättigung unspezifischer Bindungen wurde die Membran nach dem Blotvorgang für 1 h bei Raumtemperatur (RT) in Milchpulver-Blockingpuffer (Abschnitt 2.2.1) geschwenkt. Zum Nachweis einzelner Proteine wurde die Membran dann mit dem entsprechenden Primärantikörper, verdünnt in frischem Milchpulver- Blockingpuffer, bei 4°C über Nacht inkubiert. Nach viermaligem Waschen mit TBST (je 7 min) erfolgte die Inkubation mit dem jeweiligen Meerrettich-Peroxidase (horseradish peroxidase, HRP)-gekoppelten Sekundärantikörper für 1 h bei RT. Die Membran wurde zur Entfernung von unspezifisch gebundenem Sekundärantikörper erneut viermal 7 min lang mit TBST gewaschen. Der gebundene HRP-gekoppelte Sekundärantikörper wurde nach dem Prinzip der verstärkten Chemolumineszenz (enhanced chemoluminescence, ECL) mit Reagenzien (ECL Western Blotting Detection Reagents) und Röntgenfilmen der Firma Amersham (Buckinghamshire, GB) dem Herstellerprotokoll entsprechend nachgewiesen. Alternativ wurde auch selbst hergestelltes ECL-Reagenz verwendet (0,1 M Tris-HCl (pH 8,5), 2,5 mM Luminol, 0,4 mM para-Hydroxycoumarinsäure und 0,02 % H 2 O 2 in dd H 2 O). 3.6.4 Stripping Um einen Blot ein zweites Mal für eine Antikörper-Inkubation zu verwenden, wurden die zuvor gebundenen Antikörperkomplexe durch 30-minütige Inkubation bei 50°C in Strippingpuffer (Abschnitt 2.2.1) entfernt. Anschließend wurde die Membran erneut mit Blockingpuffer und Antikörper-Verdünnungen wie in Abschnitt 3.6.3 beschrieben inkubiert. 39
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Ausgehend von diesem Ergebnis konnt
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lectin DC-SIGN (CD209) is an antige
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interleukin-8 synthesis integrates
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