Candida albicans-induzierte Genexpression in primären ... - OPUS

3.6 Western Blot
3.6.1 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE)
Zur Analyse von Proteinen wurde das Proteinlysat zunächst durch eindimensionale
Gelelektrophorese unter denaturierenden Bedingungen fraktioniert, wobei die
einzelnen Proteine entsprechend ihrem Molekulargewicht aufgetrennt wurden. Die
dazu benutzten SDS-Polyacrylamidgele setzten sich zu ca. 1/3 aus einem 3 %igen
Sammelgel und ca. 2/3 aus einem Trenngel mit abweichendem pH-Wert zusammen.
Der Acrylamidgehalt des Trenngels (8 % bis 12 %) richtete sich dabei nach der
Größe der zu untersuchenden Proteine. Die nachfolgende Tabelle enthält die
Pipettierschemata, nach denen die einzelnen Gele gegossen wurden, sowie die
Auftrennungsoptima der einzelnen Trenngele. Die Zusammensetzung der Vormixe
für Trenngel und Sammelgel sind in Abschnitt 2.2.1 beschrieben.
Konzentration des Sammelbzw.
Trenngels
3 % 8 % 10 % 12 %
30 % Acrylamid 1 ml 2.66 ml 3.33 ml 4 ml
Trenngel-Vormix - 5 ml 5 ml 5 ml
Sammelgel-Vormix 5 ml - - -
dd H2O 4 ml 2.33 ml 1.66 ml 1 ml
Ammoniumpersulfat (APS) 150 µl 100 µl 100 µl 100 µl
Temed 10 µl 4 µl 4 µl 4 µl
Auftrennungsoptimum - > 90 kDa 40-90 kDa < 40 kDa
Das polymerisierte Gel wurde in eine Vertikalapparatur eingesetzt und das Reservoir
mit Laufpuffer (Abschnitt 2.2.1) aufgefüllt. Anschließend wurden die mit SDS-
Probenpuffer versetzten Proben auf das Sammelgel gegeben. Pro Geltasche wurden
dabei bis zu 30 µg Protein geladen. Die Proteingemische wurden dann bei einer
konstanten Stromstärke von 35-50 mA aufgetrennt.
38