Candida albicans-induzierte Genexpression in primären ... - OPUS

2.9 Plasmide
Für Promoter-Reporter-Assays (Luciferaseassays) wurden ein 6xκB-abhängiges
Firefly-Luciferase Konstrukt und ein Ubiquitin-abhängiges Renilla-Luciferase
Konstrukt verwendet (freundlicherweise zur Verfügung gestellt von B. Baumann,
Universität Ulm).
Für die retrovirale Infektion einer Kinase-toten Mutante von IKK2 (IKK2KD, (Denk et
al., 2001)) und dominant-negativer Mutanten von IRAK1 (IRAK(83-544), (Cao et al.,
1996)) und von MyD88 (MyD88(152-296), (Wesche et al., 1997)) wurde der
retrovirale Vektor pCFG5-IEGZ genutzt. Dieser Vektor verfügt über eine multiple
cloning side, in die die Konstrukte kloniert wurden, und über ein Zeozin-
Resistenzgen. Zusätzlich enthält das MyD88dn-Konstrukt ein Myc-Tag, über welches
der Expressionsnachweis mittels Western Blot möglich war, da zwei getestete
Antikörper gegen MyD88 selbst keine zufriedenstellenden Ergebnisse lieferten. Der
IRAK1-Antikörper erkennt zwar das endogene Protein, nicht aber die kürzere IRAK1-
DD-Mutante, sodass zu deren Nachweis mittels Western Blot ein enthaltenes HA-
Tag diente.
Verschiedene dsDNA-Oligonukleotide, die für small hairpin RNA (shRNA) gegen
MyD88 oder IRAK1 kodierten, wurden mit der iRNAi 2.0 Software (NKI, Nederlands
Kanker Instituut) entworfen und von Sigma Genosys synthetisiert. Die Konstrukte
wurden zur Testung und für eine retrovirale Infektion in den Vektor pRetroSuper
(pRS) kloniert (Brummelkamp et al., 2002). Dieser Vektor verfügt neben der multiple
cloning side über ein Puromycin-Resistenzgen.
2.10 siRNAs (Doppelstrang-Oligonukleotide)
Zur Herunterregulation einzelner Proteine in HUVEC wurden folgende bei der Firma
Qiagen (Hilden) kommerziell erworbenen siRNAs verwendet:
siRNA MyD88
Hs_MYD88_5_HP Validated siRNA (# SI00300909)
Targetsequenz AACTGGAACAGACAAACTATC
siRNA TLR3
Hs_TLR3_8_HP Validated siRNA (# SI02655156)
Targetsequenz AAGAACTGGATATCTTTGCCA
siRNA TLR4
Hs_TLR4_1 (# SI00151004)
Targetsequenz CTCGATGATATTATTGACTTA
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