Candida albicans-induzierte Genexpression in primären ... - OPUS

Abbildung 4.29 Ein Knock-down von IRAK1 durch shRNA hemmt die C. albicans-induzierte
Expression von CXCL8 und CCL20 in HUVEC. (A) HUVEC wurden mit dem retroviralen Vektor
pRetroSuper (pRS) bzw. dem Vektor mit dem shRNA-Konstrukt gegen IRAK1 (pRS-IRAK1) infiziert.
Nach dreitägiger Selektion wurden die Endothelzellen mit IL-1β (10 U/ml), TNFα (2 ng/ml) oder
C. albicans (MOI=1) stimuliert oder als Kontrolle nur mit Medium behandelt. Die Zellen wurden nach
acht Stunden Stimulation lysiert und im Western Blot untersucht. Die Expression von IRAK1 und
CXCL8 wurde mit den entsprechenden Antikörpern untersucht, zur Überprüfung einer gleichen
Beladung der Banden wurde der Blot gegen ERK2 gefärbt. (B) Die Zellkulturüberstände von mit
pRS scrambled bzw. pRS-IRAK1 infizierten HUVEC, die wie unter (A) beschrieben stimuliert worden
waren, wurden mittels ELISA auf CXCL8 untersucht (links). Parallel zu den Überständen wurden die
Totalzelllysate mittels CCL20-ELISA getestet (rechts). Dargestellt ist jeweils ein repräsentativer
Versuch von drei unabhängigen Versuchen.
MyD88 wurde mit Hilfe eines kommerziell erhältlichen, validierten siRNA-
Oligonukleotids herunterreguliert. Dafür wurde diese siRNA bzw. als Kontrolle eine
unspezifische, Alexa Fluor 488-gekoppelte siRNA (scrambled siRNA) in HUVEC
transfiziert. Zwei Tage nach der Transfektion wurden zur Transfektionskontrolle die
mit scrambled siRNA transfizierten Zellen im Fluoreszenzmikroskop untersucht. Eine
deutliche, intrazelluläre Fluoreszenz konnte in mehr als 90 % der Zellen beobachtet
werden (Daten nicht gezeigt). Anschließend wurden die HUVEC mit IL-1β, TNFα
oder C. albicans stimuliert. Sowohl die Kulturüberstände als auch die Totalzelllysate
wurden nach achtstündiger Stimulationsdauer gewonnen und ausgewertet. Obwohl
eine zufriedenstellende Färbung des MyD88-Proteins trotz Verwendung
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