Candida albicans-induzierte Genexpression in primären ... - OPUS

wurde das Medium vollständig abgesaugt und die Zellen in normalem Kulturmedium
bis zur Weiterverwendung kultiviert.
3.2.3 Kalziumphosphat-Transfektion
Für die Kalziumphosphat-Transfektion von Zellen in einer 10 cm-Petrischale nach
einem modifizierten Protokoll nach Graham und van der Eb (Graham and van der
Eb, 1973) wurde folgendermaßen vorgegangen: Am Morgen der Transfektion wurde
das Kulturmedium durch 10 ml antibiotikafreies Medium ersetzt. Am Nachmittag
wurde zunächst das DNA-Präzipitat hergestellt. Dafür wurde in einem
Mikrozentrifugenröhrchen die DNA (10-12 µg) vorgelegt, das Volumen mit sterilem
dd H 2 O auf 450 µl aufgefüllt und 50 µl CaCl 2 -Lösung (2,5 M) dazugegeben. Nach
Vortexen wurden 500 µl 2 x HBS vorsichtig mit kreisenden Bewegungen vom Boden
des Röhrchens nach oben dazupipettiert und zur Vermischung noch einige
Luftblasen durch die Pipette gedrückt. Zur Bildung des Präzipitats wurde der Ansatz
15 min bei Raumtemperatur stehen gelassen und anschließend tropfenweise zu den
Zellen gegeben. Die Schale wurde dann vorsichtig geschwenkt und bei 37°C und
5 % CO 2 kultiviert. Nach 24 h erfolgte nach einmaligem Waschen mit PBS ein
Mediumwechsel.
3.2.4 Oligofectamine-Transfektion
Für die Transfektion von HUVEC und UTA6-Zellen mit chemisch hergestellten
small interfering RNA (siRNA)-Oligonukleotiden wurden verschiedene Transfektionsmethoden
getestet und optimiert. Verwendet wurden die Lipid-basierten
Transfektionsreagenzien Lipofectamine 2000, HiPerFect, Effectene, FuGENE 6,
PromoFectin-HUVEC und Oligofectamine, sowie die Elektroporation und die
Magnet-unterstützte Transfektion. Bei allen diesen Methoden wurde nach den
Angaben des Herstellers verfahren, es wurden jedoch bis auf eine Ausnahme keine
zufriedenstellenden Transfektionsraten in HUVEC erreicht. Als einziges
Transfektionsreagenz führte Oligofectamine zu einer guten Rate an transfizierten
siRNA-Oligonukleotiden.
Dazu wurden HUVEC am Tag nach der Aussaat in 6 Loch-Platten (100.000
HUVEC/Well) mit einer Mischung aus einer siRNA-Lösung (10 µl siRNA (20 µmol)
und 90 µl OptiMEM) und einer Oligofectamine-Lösung (6 µl Oligofectamine und
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