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Physikalische Chemie
- Grundmodul -
Konfokale Einzelmolekülmikroskopie
Version: November 2011
Verfasser: PD Dr. Gerald Hinze

Konfokale Einzelmolekülmikroskopie
Zusammenfassung
In diesem Versuch wird das optische Auflösungsvermögen eines konfokalen
Fluoreszenzmikroskops bestimmt. Anhand zeitabhängiger Fluoreszenzintensitätsmessungen
an einzelnen Molekülen wird deren Triplettkinetik berechnet.
Grundlagen: Optik, Detektoren, Fluoreszenz, Jablonski Diagramm, Korrelationsfunktionen
Lernziele
• konfokale Fluoreszenzmikroskopie
• Einzelmolekülspektroskopie
• optische Auflösungsvermögen
• zeitabhängige Messungen
• Korrelationsfunktionen
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Konfokale Einzelmolekülmikroskopie
0 Inhalt
0 Inhalt .................................................................................................................... 3
1 Die Fluoreszenz einzelner Moleküle – Vergleich zu konventionellen
Ensemblemessungen ................................................................................................. 5
1.1 Homogene und inhomogene Linienform ...................................................... 5
1.2 Zeitabhängige Fluoreszenz .......................................................................... 6
2 Experimentelle Voraussetzungen für Fluoreszenzuntersuchungen an einzelnen
Molekülen ................................................................................................................... 7
2.1 Anzahl der Moleküle im Detektionsvolumen ................................................. 7
2.2 Fluoreszenzmessung an einzelnen Farbstoffmolekülen ............................... 8
3 Konfokale Fluoreszenzmikroskopie ................................................................... 10
3.1 Das Prinzip der konfokalen Mikroskopie .................................................... 10
3.1.1 Auflösungsvermögen .............................................................................. 10
3.1.2 Vergrößerung .......................................................................................... 12
3.1.3 Fluoreszenzmikrokopie ........................................................................... 13
3.1.4 Konfokale Mikroskopie ............................................................................ 14
3.2 Experimenteller Aufbau des Fluoreszenzmikroskopes (Praktikum) ............ 16
3.2.1 Anregungsstrahlengang .......................................................................... 16
3.2.2 Scanner .................................................................................................. 18
3.2.3 Detektionsstrahlengang .......................................................................... 18
4 Bedienungsanleitung.......................................................................................... 19
4.1 Wichtig ! ..................................................................................................... 19
4.2 Übersicht der Komponenten und Funktionen ............................................. 20
4.3 Mikroskopsteuerung ................................................................................... 22
4.3.1 Hardware ................................................................................................ 22
4.3.2 Softwaresteuerung des Mikroskops ........................................................ 23
4.4 Einzelnen Operationen ............................................................................... 24
4.4.1 Probenwechsel ....................................................................................... 24
4.4.2 Aufnahme eines Fluoreszenzbilds .......................................................... 26
4.4.3 Aufnahme von Fluoreszenzzeitspuren .................................................... 27
4.5 Datenauswertung ....................................................................................... 28
4.5.1 Analyse der Fluoreszenzbilder ................................................................ 28
4.5.2 Analyse der Zeitspuren ........................................................................... 29
5 Aufgabenstellung ............................................................................................... 32
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Konfokale Einzelmolekülmikroskopie
5.1 Bestimmung des räumlichen Auflösungsvermögen .................................... 32
5.2 Untersuchung von Terrylendiimid (TDI)...................................................... 33
6 Fragen zur Vorbereitung .................................................................................... 37
7 Literatur: ............................................................................................................. 38
8 Gefährdungsbeurteilung des Versuches ............................................................ 39
9 Tabellen für die Messwerte ................................................................................ 40
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Konfokale Einzelmolekülmikroskopie
1 Die Fluoreszenz einzelner Moleküle – Vergleich zu
konventionellen Ensemblemessungen
Bei der konventionellen Fluoreszenzspektroskopie wird eine hinreichend große
Anzahl (ein Ensemble) von Molekülen auf ihr Fluoreszenzverhalten hin untersucht.
Die gemessene Fluoreszenz entsteht durch Überlagerung der Beiträge einzelner
Moleküle in dem Probenvolumen. Wenn alle Moleküle zeitlich und spektral genau
gleiches Verhalten zeigen, wird die Messung an einem einzelnen Molekül genau die
gleichen Ergebnisse liefern wie Ensemblemessungen, allerdings mit einem deutlich
ungünstigerem Signal-zu-Rausch Verhältnis.
In den meisten Systemen unterscheiden sich jedoch die Fluoreszenzeigenschaften
der Moleküle untereinander. Dabei sind Unterschiede sowohl in den spektralen
Eigenschaften wie auch im zeitlichen Verhalten möglich. Nimmt beispielsweise die
Fluoreszenz einer Farbstofflösung mit zunehmender Bestrahlungsdauer ab, kann
nicht ohne weiteres entschieden werden, ob nun jedes einzelne Farbstoffmolekül
weniger abstrahlt oder aber ob ein zunehmender Anteil der Moleküle überhaupt nicht
mehr fluoresziert – oder ob beide Effekte gleichzeitig auftreten.
Viele spektroskopische Eigenschaften von Farbstoffmolekülen können erst durch die
Untersuchung einzelner Moleküle bestimmt werden. Im folgenden werden Beispiele
für die beiden wichtigen Aspekte – spektrale Eigenschaften und zeitliches Verhalten
– skizziert.
1.1 Homogene und inhomogene Linienform
Die Farbstoffmoleküle liegen typischerweise in einer Lösung oder eingebettet in eine
feste Matrix vor. Je nach Art der Umgebungsmoleküle und deren räumlicher
Anordnung um einen Farbstoff werden dessen spektrale Eigenschaften beeinflusst.
Als Beispiel werden die Emissionsspektren des Farbstoffs Terrylendiimid gezeigt. Es
sind deutliche Unterschiede in den Spektren zu sehen. Je nach lokaler Umgebung
werden die Maxima der Spektra verschoben. In einer Ensemblemessungen würde
man nur ein Gesamtspektrum erhalten, die lokale Information wäre nicht zugänglich.
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O
O
I / [a.u.]
N
O
N
O
0
650
700
λ / nm
750
800
Abbildung 1 : Emissionspektren von
einzelnenn Terrylendiimid Molekülen (angeregt
@647nm), eingebettet in einen PMMA-Film.
Je nach lokaler Umgebungg unter-
scheiden sich die
Spektren der einzelnen Moleküle.
1.2 Zeitabhängige Fluoreszenz
Trotz zeitlich konstanter Anregung kann die Intensität des emittierten Lichts sehr
stark schwanken. Hierfür kann es sehr unterschiedliche
Gründe geben. Häufig führt
ein Übergang eines Farbstoffs in einen Triplettzustand zu einem kurzzeitigen
Verschwinden der Emission, die nach dem Übergang
in den Grundzustand aber
wieder sichtbar wird. Andere Möglichkeiten sind
dynamische Vorgänge wie Rotation
oder Translation
der beobachteten Farbstoffmoleküle, die auch zur Fluktuation der
detektierten Intensität führen können.
Abbildung 2 : Beispiel einer Zeitspur: zeitabhängige Fluoreszenz eines Moleküls
In einem Ensemble-Experiment wird eine mittlere Fluoreszenz
gemessen, d.h.
Intensitätsfluktuationen einzelner Moleküle sind dort nicht sichtbar.
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2 Experimentelle Voraussetzungen für
Fluoreszenzuntersuchungen an einzelnen Molekülen
Einzelmolekülmikroskopie ist mittlerweile in vielen wissenschaftlichen Bereichen
etabliert. In diesem Abschnitt werden die Voraussetzungen diskutiert, die für die
Detektion einzelner Farbstoffmoleküle notwendig sind. Neben einem speziellen
experimentellen Aufbau müssen auch die zu untersuchende Farbstoffe bestimmte
Bedingungen erfüllen.
2.1 Anzahl der Moleküle im Detektionsvolumen
Bei konventionellen Fluorometern wird das erfasste Volumen in einer Küvette durch
den Anregungs- und den Emissionsstrahlengang bestimmt (siehe Abbildung 3).
Abbildung 3 : Strahlengang in einer Fluoreszenzküvette
Nur die Photonen aus einem Teilvolumen in der Mitte der Küvette gelangen auf den
Detektor. Die Größe dieses Teilvolumens ist von der genauen Geometrie der
Strahlengänge abhängig. Eine Abschätzung der Anzahl von fluoreszierenden
Molekülen kann mit typischen Werten durchgeführt werden:
Detektionsvolumen : Kugel mit Radius
r = 1mm
V
Det
4
3
3 . −9
3
= πr
= 4.2 10 m
(1)
Konzentration einer Farbstofflösung :
c
Farbstoff
= 10
−4
mol L
−1
=
0.1mol m
−3
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. 23 −1
Mit NA
= 6.02210 mol lässt sich die Anzahl der Farbstoffmoleküle N
Farbstoff
in dem
Volumen V
Det
berechnen:
N
.
.
. 14
Farbstoff
NA
c
Farbstoff
VDet
≈ 2.5 10
= (2)
2.2 Fluoreszenzmessung an einzelnen Farbstoffmolekülen
Um die Fluoreszenzeigenschaften einzelner Moleküle untersuchen zu können,
werden oft extrem stark verdünnte Proben untersucht. Die Konzentration der zu
untersuchenden Spezies wird so gewählt, dass sich immer nur maximal ein Molekül
im Fokus des Mikroskopobjektivs befindet. Außer bei Messungen in der Gasphase
befinden sich die Fluorophore in einer festen oder flüssigen Matrix. Als feste Matrix
können amorphe (z.B. Polymere) oder Kristalle verwendet werden.
Abbildung 4: Bei genügend gro0em Abstand können zueinander können einzelne
Fluorophore getrennt betrachtet werden
Oft zeigt die Matrix auch eine schwache Fluoreszenz, die durch Verunreinigungen
verursacht wird. Daneben treten Streueffekte (Rayleigh- und Ramanstreuung) an den
Molekülen der Matrix auf. Reflexionen an den Phasengrenzflächen sind eine weitere
Ursache für ungewünschte Effekte. Daher ist es vorteilhaft, möglichst kleine
Anregungs- und Detektionsvolumina zu verwenden. Je kleiner das beleuchtete
Volumen ist, in dem sich der Fluorophor befindet, desto signifikanter kann das
Fluoreszenzsignal auf dem Lichtuntergrund detektiert werden. Ausschlaggebend ist
dabei nicht die Höhe des Untergrundes selbst, sondern die zeitliche Änderung
(Fluktuation) des Untergrundes (Signal/Rausch-Verhältnis). Je kleiner das
Detektionsvolumen ist, desto geringer wird auch das Hintergrundrauschen bei einer
Messungen sein
Neben einer sehr empfindlichen Photonendetektion müssen auch die Fluorophore
bestimmten Anforderungen genügen, damit signifikante Messergebnisse resultieren
können:
(A) Der Absoptionsquerschnitt σ
B
eines Moleküls B muss bei der verwendeten
Anregungswellenlänge λ
ex
möglichst groß sein, damit der fluoreszenzfähige Zustand
von dem Molekül effizient besetzt werden kann. Im Zusammenhang mit Einzel-
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moleküluntersuchungen ist es zweckmäßig, anstelle der molaren Größe ε B
den
Absoptionsquerschnitt σ
B
zu verwenden, der sich auf ein einzelnes Molekül bezieht :
ε
B
σ
B
= ln10 ⋅
(3)
NA
N
A
ist die Avogadrische Konstante und ε B
der molare dekadische Extinkionskoeffizient.
Daraus folgt, dass σ
B
die Dimension einer Fläche hat.
(B) Die Fluoreszenzquantenausbeute des Moleküls sollte groß sein, damit aus fast
jedem Absorptionsprozess eine Emission resultiert.
(C) Die Besetzungswahrscheinlichkeit für langlebige Molekülzustände sollte klein
sein. In diesem Zusammenhang spielen bei Farbstoffmolekülen die langlebigen
Triplettzustände eine Rolle. Die Moleküle sollten also ein kleine Intersystemcrossing-
Rate besitzen.
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3 Konfokale Fluoreszenzmikroskopie
Diese experimentelle Methode hat sich in den letzten Jahren als Standardmethode
für Fluoreszenzmesungen an einzelnen Moleküle etabliert. Die Beschreibung des
experimentellen Aufbaus ist in zwei Teile untergliedert.
In den folgenden Abschnitten wird schrittweise das Prinzip der konfokalen
Fluoreszenzmikroskopie beschrieben (3.1.) , danach folgt der im Praktikum
verwendete Aufbau (3.2.).
3.1 Das Prinzip der konfokalen Mikroskopie
3.1.1 Auflösungsvermögen
Um tatsächlich nur einzelne Moleküle optisch anzuregen, muss das Anregungslicht
sehr stark fokussiert werden. Allerdings sind der Fokussierung von Licht, z.B. mit
einem Mikroskopobjektiv, durch das Beugungslimit Grenzen gesetzt. Der laterale
Durchmesser (senkrecht zur Ausbreitungsrichtung) der erreichbaren Strahltaille w
(Stelle im Strahlengang mit dem geringsten Durchmesser) ist abhängig von der
Wellenlänge λ des Lichtes, von dem Brechungsindex n des Mediums (in dem sich
das Licht ausbreitet) und vom Öffnungswinkel 2 α des Lichtkegels.
Die radiale Ortsabhängigkeit der Intensitätsverteilung I ( x)
in der Taille, beschrieben
durch die Koordinate x, ist näherungsweise gaußförmig,
2
⎛ x ⎞
I − . (4)
( x) ∝ exp
⎜
⎟ 2
⎝ w ⎠
Der Öffnungswinkel hängt mit der Strahltaille über die Beziehung
NA
λ
= n sin α =
(5)
π w
zusammen. Dabei bezeichnet NA die numerische Apertur. Hohe numerische
Aperturen werden mit extrem kurzbrennweitigen Objektiven erreicht, deren
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Öffnungswinkel
2 α sehr groß ist. Prinzipiell ist der Öffnungswinjkel von der
Brennweite und dem Frontlinsendurchmesser des verwendeten Objektives abhängig.
Abbildung 5 : Gaußsche Strahltaille und laterale Intensitätsverteilung
Ein sehr gutes Immersionsölobjektiv besitzt z.B. eine NA = 1 .4 . Bei einer
Wellenlänge von
λ = 6000 nm ergibt sich daraus eine Breite der Gaußschen
Strahltaille von w = 136nm
. Dies ist sehr groß im Vergleich zu molekularen
Abmessungen.
Zur Erinnerung:
typische C-C
Bindungslängen
betragen
0.12
−
0 .15nm . Befinden sich also mehrere Moleküle innerhalb
der Strahltaille,
könnenn sie nicht mehr voneinander getrennt werden. Diese wellenlängenabhängige
Abbildungsgrenzee wird daher auch als Auflösungsvermögen
des Mikroskops
bezeichnet. Je kürzer die
verwendete Wellenlänge ist, desto feinere Strukturen
könnenn aufgelöst
werden.
Die Halbwertsbreite der Intensitätsverteilung HWB wird berechnet durch
HWB lateral
0. 53
= nsin
λ
α
.
(6)
Für die Anregung von Farbstoffen in einem Mikroskop werden sehr
Intensitäten benötigt. Ist P die Leistung (Energie pro Zeit), die mit
kleine
einem
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Leistungsmeter
in dem Strahlungsgang gemessen wird, lässt sich daraus die
Anregungsintensität I (Energie pro Zeit und Fläche) mittels der Beziehung
I =
(
HWB la
P
2
ateral
1. 177)
) ⋅ π
(7)
berechnen. Mit einem typische Wert von z.B. P = 2μ
W , direkt vor dem Objektiv
gemessen, ergibt sich (Annahme: NA = 1.4 , λ = 600nm
) eine Anregungsintensität
von I = 1.7
⋅10 7 2
W m
− !
3.1.2 Vergrößerung
Ein typischer Strahlengang eines modernen Mikroskops wird in der folgenden
Abbildung gezeigt, schematisch dargestellt bestehend aus zwei Linsen (tatsächlich
bestehen schon Mikroskopobjektive aus mehreren Linsen). Das Objekt befindet sich
in der Brennebene des Mikroskopobjektives mit der Brennweite f 1 , so dass das Bild
des Objekts im Unendlichen liegt. Zwischen dem Mikroskopobjektiv und der
Tubuslinse
liegt der Infinity-Bereich,
in dem die
Strahlen
parallel
zur
Verbindungsachse der beiden Linsen sich
ausbreiten. Dies hat den
ganz
entscheidenden Vorteil, dass der Abstand zwischen diesen beiden Linsen verändert
werden
kann, ohne dass es sich auf
die Abbildungsschärfe oder die Vergrößerung
auswirkt.
Abbildung 6 : Schematischer Aufbau eines optischen Mikroskops
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Werden
in den Infinity-Bereich weitere optische Elemente wie Filter, Polarisatoren
oder Strahlteile eingefügt, so wird die Abbildungsqualität dadurch weit weniger
beeinträchtigt, als wenn die Strahlenbündel in diesem Bereich konvergent (nicht
parallel) wären.
Die Tubuslinse
mit der Brennweitee f 2 erzeugt ein reales Zwischenbild
in der
Brennebene der Tubuslinse. Die Vergrößerung dieses Systems ist durch das
Verhältnis der beiden Brennweitenn f 2 /f 1 gegeben. Die
auf Mikroskopobjektiven
aufgedruckte Vergrößerungg macht also nur in Kombinatio
n mit einer
Tubuslinse Sinn.
Als möglicher Detektor kann z.B. der CCD-Chip erhält dann ein scharfes Bild, wenn sich das
einer Videokamera genau im
Abstand f 2 positioniert werden. Mannn
Objekt im Abstand f 1 vom Mikroskopobjektiv befindet.
3.1.3
Fluoreszenzmikroskopie
Die
Fluoreszenzmikroskopie
biete
gegenüber
reinen
Transmissions- und
Reflektionsmethoden den Vorteil, das
Anregungslicht, mit dem die Probe beleuchtet
wird, mittels optischen Filtern sehr effektiv vom Fluoreszenzlicht
abzutrennen. Ein
sehr einfacher Aufbau dafür kann mit einem farbteilenden (dichroitischen)
Spiegel
realisiert werden.
Abbildung 7 : schematischer Strahlengang eines Fluoreszenzmikroskops mit
Weitfeldbeleuchtung
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3.1.4
Konfokale
Mikroskopie
Das kürzerwellige Anregungslicht wird an dem
farbteilenden Spiegel reflektiert. In
unserem Beispiel wurde es
außerdem
derart fokussiert,
das in der
Objektebene ein
weites Feld beleuchtet wird (Weitfeldmikroskopie). Das längerwellige Fluoreszenz-
fokussiert. Von der Probe rückgestreutes Anregungsl
licht (keine Änderung der
licht kann den farbteilenden Spiegel passieren
und wird
in der Zwischenbildebene
Wellenlänge) wird
von dem farbteilenden Spiegel abgetrennt.
Mit dem
konfokalen Prinzip
kann im Vergleich zur konventionellenn Mikroskopie das
axiale Auflösungsverhalten
wesentlich verbessert werden, zudem erhöht sich auch
das laterale Auflösungsvermögen (in der Objektebene).
Anders
als bei dem Aufbau in Abbildung 7 wird hier das Anregungslicht auf einen
Punkt in der Probe fokussiert. Damit konzentriert
sich die Anregungswahr-
scheinlichkeit in dem kleinen Bereich der Strahltaille: nur hier ist die Anregungs-
(pro
intensität hoch genug, um eine detektierbare Anzahl von Absorptionsprozessen Zeiteinheit) zu ermöglichen.
Abbildung 8 : Anregungsstrahlengang in einem
Fluoreszenz-Mikroskop
Zusätzlich
wird in dem
Detektionsstrahlengang
eine Lochblende
in der
Zwischenbildebene eingefügt. Befindet sich ein Objekt (Molekül) genau in dem
Fokus
in der Objektebene, wird dessen Abbildung die Lochblende in der Zwischenbildebene
passieren können. Objekte an anderen Positionen werden von der Lochblende
geblockt.
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Abbildung 9 : Ortsabhängige Lichtunterdrückung durch eine Lochblende in der
Zwischenbildebene. Der Anregungsstrahlengang wurde hier weggelassen.
Die Kombinationn beider Prinzipien führt im Vergleich zu einem
herkömmlichen
Mikroskop zu wesentlich gesteigertem
lateralen Auflösungsvermögen.
Unter der Annahme, dass Anregungs- und Emissionswellenlängen gleich sind
( λ = λ
ab
= λ em
) , ergibt sich folgendes (optimales) Auflösungsvermögen :
0.4λ
HWB lateral
= und HWB ax
NA
xial
=
0,45λ
NA
(8)
Meistens liegen aber Anregungs-
eine gesonderte Betrachtung
jeweils für die
und Emissionswellenlänge mehr als 10 nm
auseinander, so
dass eigentlich
Absorption und die Emission vorgenommenn werden müsste. NA ist hier die
numerische Apertur des verwendetenn Mikroskopobjektives
(siehe Abbildung 4).
Bisher wurde genau ein Punkt der Probe angeregt und dessen Emission beobachtet.
Um ein
zwei- oder drei-dimensionaless Bild der Probe zu erhalten, wird die Probe mit
Hilfe eines Piezoscanners vor dem Objektiv bewegt, d.h. abgerastert.
Die konfokale
Fluoreszenzmikroskopie hat sich als Schlüsseltechnologie zur
spektroskopischen Untersuchung einzelner Moleküle erwiesen. Sind sie in einer
Probe weiter als das oben angegebene Auflösungsvermögen voneinander entfernt,
könnenn einzelne Moleküle unterschieden werden: man erhält einzelne Leuchtobjekte.
Neben der Intensität können prinzipiell alle möglichen spektroskopischen Parameter
einzelner Moleküle bestimmt werden wie Fluoreszenzlebensdauern, Emissions- und
Absorptionsspektren, Polarisationseigenschaften, Triplettkinetik,
photochemische
Prozesse etc. .
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3.2 Experimenteller Aufbau des Fluoreszenzmikroskopes
(Praktikum)
Nach dem in den vorhergehenden Abschnitten der prinzipielle Aufbau eines
konfokalen Fluorezenzmikroskops gezeigt wurde, wird hier der aktuelle, im Praktikum
verwendete Aufbau beschrieben.
3.2.1 Anregungsstrahlengang
Zur Zeit (Stand Oktober 2011) wird für Anregung ein Diodenlaser mit einer mittleren
Wellenlänge von 638nm verwendet
Generell werden die Lichtquellen in eine Glasfaser eingekoppelt. Zusätzlich sind
noch folgende optische Elemente in dem Anregungsstrahlengang eingebaut:
- kontinuierlichen Abschwächer: hier wird die Anregungsintensität eingestellt
- Laserlinienfilter: unerwünschte Laserlinien werden abgeblockt. Nur die
gewünschten Laserlinien können den Filter passieren (=Bandpassfilter)
- Polarisationsfilter (optional): die Anregung erfolgt mit linear polarisiertem
Licht
- Shutter / Verschluss : die Probe wird nur während einer Messung angeregt
Über eine Linse wird das Anregungslicht in eine Glasfaser eingekoppelt. Prinzipiell ist
die Faser nicht notwendig, sie bietet aber deutliche Vorteile:
- die Anregungslichtquellen können ausgetauscht werden, ohne dass der
Anregungsstrahlengang im Mikroskop verändert werden muss
- die Anregungslaser können räumlich vom Mikroskop getrennt werden
- bei geeigneten Fasern erhält man an der Austrittsöffnung eine ideale
punktförmige Lichtquelle
Über einen teildurchlässigen Spiegel wird das Anregungslicht in das Objektiv gelenkt.
Die punktförmige Anregungslichtquelle wird also in der Objektebene wieder als Punkt
abgebildet.
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LF
A
P
SH
L
GF
DS
: Laserlinienfilter (nur die gewünschten Wellenlängen werden durchgelassen)
: optischer Abschwächer (Einstellen der Anregungsleistung)
: Polarisator
: Shutter (Verschluss)
: Linsen
: Glasfaser
: teildurchlässiger Spiegel (ca. 10% des Anregungslicht werden umgelenkt,
90% des emittierten können passieren)
S
LP
: Spiegel
: Langpassfilter (ab einer bestimmten Wellenlänge kann längerwelliges Licht
den Filter passieren)
PS
D1
: polarisationsabhängiger Strahlteiler
: hochempfindlicher Detektor (APD, avalanche photo diode)
D2 : “ “ “ “
Abbildung 10: Experimenteller Aufbau des konfokalen Fluoreszenzmikroskops im
Praktikum
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3.2.2 Scanner
Durch das konfokale Prinzip bedingt, wird immer nur ein Punkt der Probe in der
Objektebene beleuchtet bzw. auch detektiert. Um eine Abbildung der Probe zu
erhalten, muss die Probe vor dem Objektiv abgerastert werden. Dazu befindet sich
die Probe auf einem Verschiebetisch, der über Piezoaktuatoren in alle drei
Raumrichtungen verschoben werden kann. Der im Praktikum verwendet Scanner hat
eine Auflösung von ca. 20-50 nm. Die Steuerung erfolgt über einen Computer, der
auch die detektierten Intensitäten registriert und auswertet.
3.2.3 Detektionsstrahlengang
Von der Probe emittierte Photonen werden über das Objektiv wieder eingesammelt
und können zu ~93% den teildurchlässigen Spiegel passieren. Nach einem Spiegel
wird mit einem hochwertigen Langpassfilter das längerwellige Fluoreszenzlicht von
dem unveränderten Streulicht getrennt. Ein polarisationsabhängiger Strahlteilerwürfel
lenkt die Photonen polarisationsabhängig auf den Detektor D1 oder D2. Anstelle der
in Abbildung 8 gezeigten Lochblende wird die räumlich begrenzte, photoempfindliche
Detektionsfläche der Photodioden verwendet. Dadurch können einige optische
Elemente vermieden werden, die immer einen bestimmten Verlust an Photonen
durch Reflexion bedeuten würden. Die Detektoren sind empfindlich genug, um
einzelne Photonen detektieren zu können. Ein Computer zählt die ankommenden
Photonen. Aus dem Intensitätsverhältnis von D1 zu D2 kann die Polarisation der
emittierten Photonen ermittelt werden.
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4 Bedienungsanleitung
In den folgenden Abschnitten wird die Bedienung des im Praktikum eingesetzten
Mikroskops und der Auswertungssoftware beschrieben.
(Stand 28.Mai 2010)
4.1 Wichtig !
Einige der im Mikroskop verwendeten Komponenten sind sehr teuer und können
durch Bedienungsfehler zerstört werden. Hier sind die beiden ‚gefährdetsten’
Komponenten beschrieben :
Als Detektoren werden Avalanche Photodioden (APD) verwendet, die durch einen zu
hohen Photonenstrom zerstört werden können. Findet keine Messung statt, müssen
sie daher immer ‚ausgeschaltet’ sein.
Abbildung 11: Handsteuerung für das Mikroskop mit Funktionsleuchten
Der Probenwechsel muss äußerst vorsichtig durchgeführt werden, da ansonsten das
Mikroskopobjektiv beschädigt werden könnte. Niemals die Linsen des Objektivs
berühren!
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Mikroskopobjektiv
Abbildung 12: Probenhalter des invertierten Mikroskops: Die Probe wird von unten
betrachtet
4.2 Übersicht der Komponenten und Funktionen
Die Ansteuerung und Datenerfassung des konfokalen Mikroskops wird vollständig mit
einem zentralen Computer durchgeführt. Er erfüllt dabei drei verschiedene Aufgaben:
a) Monitor für die angeschlossene CCD-Kamera (Justage des Objektiv-Focus)
b) Vollständige Steuerung (LABVIEW-Routinen) des Mikroskops (Kontrolle des
Piezoscanners, Datenerfassung)
c) Datenauswertung mit Hilfe von MATLAB-Routinen
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Probe
. . .
.
. .
XY-Piezoscanner
Shutter
Objektiv
teildurchlässiger
Spiegel
klappbarer Spiegel
D1
(APD)
CCD
Kamera
L
L
LP
S
D2
(APD)
Abbildung 13: Schematischer Aufbau der Mikroskopsteuerung und Datenerfassung
Abbildung 14 : konfokales Laserscanningmikroskop
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4.3 Mikroskopsteuerung
4.3.1 Hardware
Die folgenden Komponenten können gesteuert werden:
- XY Piezoscanner (erfolgt vom Hauptcomputer)
- APD ‚Gate’ : aktivieren/deativieren der hochempfindlichen Detektoren
(erfolgt vom Hauptcomputer bzw. auch per Handsteuerung)
- SHUTTER : öffnen / schließen des Shutters im Anregungsstrahlengang
(erfolgt vom Hauptcomputer bzw. auch per Handsteuerung)
- MIRROR : Spiegel für die Justage des Fokus in den Strahlengang drehen
(erfolgt per Handsteuerung)
Abbildung 15 : Handsteuerung des Mikroskops
Während einer Messung übernimmt der Hauptcomputer die Kontrolle der einzelnen
Komponenten.
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4.3.2 Softwaresteuerung des Mikroskops
Eine Messung wird vollständig über eine Software gesteuert (Labview-Routinen).
Über eine Maske können die verschiedenen Parameter für z.B. Scanbereich,
Scangeschwindigkeit etc. eingestellt werden. Anschließend können die gemessenen
Daten (Bilder oder Zeitspuren) auf der Festplatte gespeichert werden. Details der
Eingabemöglichkeiten werden in den folgenden Abschnitten beschrieben.
Abbildung 16 : Eingabemaske der Steuerungssoftware
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4.4 Einzelne Operationen
4.4.1 Probenwechsel
Ein Probenwechsel muss mit äußerster Sorgfalt durchgeführt werden, da ansonsten
das Mikroskopobjektiv beschädigt werden könnte. Zuerst muss der Deckel des
Probenraumes entfernt werden, er wird einfach abgehoben. Wichtig ist hierbei, dass
keine Messung läuft und dass die Detektoren (APD) ausgeschaltet sind. Ansonsten
könnten sie durch den Lichteinfall zerstört werden.
Magnetische Folie
Metallring
Manuelle Fokuseinstellung
Abbildung 17 : Probenraum (Deckel wurde entfernt)
Die Probe besteht aus einem Objektdeckgläschen, auf das die eigentliche Probe als
dünner Film aufgebracht wurde. Das Gläschen liegt auf einem runden silberfarbenen
Metallring und wird durch eine magnetische Folie festgehalten.
Nachdem eine neue Probe eingebaut wurde, muss das Objektiv neu fokussiert
werden. Dazu gibt es zwei Möglichkeiten:
- über den Drehknopf ‚manuelle Fokuseinstellung’ wird das Objektiv hoch- oder
runterbewegt (siehe Abbildung 16).
- Der Piezoscanner kann auch in Z-Richtung bewegt werden. Dies erfolgt über
einen Controller, der in der Abbildung 17 gezeigt wird
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Konfokale Einzelmolekülmikroskopie
Abbildung 18 : Controller für die Z-Achse des Piezoscanners (Fokuseinstellung
desObjektivs)
Die Einstellung des Fokus wird über die Reflexion an der Glas-Luft-Grenzfläche des
Probengläschen durchgeführt. Dazu muss der motorisierte Spiegel in den
Strahlengang eingedreht werden. Dies wird durch die Handsteuerung (Abbildung 3)
durchgeführt. Auf Tastendruck (‚ON’) dreht der Spiegel und gleichzeitig wird der
Shutter des Anregungsstrahls geöffnet. Nun fällt das an der Grenzfläche reflektierte
Licht auf eine CCD-Kamera (siehe Abbildung 1), die an den Hauptcomputer
angeschlossen ist. Mit der Software ’CCD-Kamera’ wird das von der Kamera
aufgenommene Bild auf dem Monitor angezeigt.
Nun wird der Fokus so eingestellt, dass sich ein möglichst kleiner und heller Punkt
ergibt. Der Brennpunkt des Objektivs liegt nun genau bei der Glas/Luft-Grenzfläche.
Nun den Spiegel über die Handsteuerung wieder aus den Strahlengang entfernen
(‚OFF’).
Zusammenfassung:
(1) Prüfen, dass keine Messung läuft (APD ausgeschaltet!)
(2) Deckel des Probenraum öffnen
(3) Magnetische Folie entfernen
(4) Objektdeckgläschen vorsichtig mit Pinzette austauschen
(5) Mit Folie befestigen
(6) Deckel des Probenraums einsetzen
(7) Spiegel für die Fokussierung eindrehen
(8) CCD-Software aktivieren
(9) Fokussieren
(10) Spiegel wieder rausdrehen.
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4.4.2 Aufnahme eines Fluoreszenzbilds
Für die Aufnahme eines Fluoreszenzbildes müssen einige Parameter in der
Bildschirmmaske der Softwaresteuerung eingestellt werden.
Abbildung 19 : Bedienelemente für die Aufnahme eines Fluoreszenzbildes
Beschreibung der wichtigsten Parameter:
range [μm] : Größe der zu scannenden Fläche (10 X, 10 Y bedeutet 10x10μm)
Der Mittelpunkt der Fläche ist 0/0, d.h. bei 10 μm wird von
-5...+5μm gescannt.
# of pixels : Anzahl der pixels (128 X, 128 Y bedeutet 128x128Pixel=16384Pixel)
offset [mm] : Der Mittelpunkt der zu scannenden Fläche. Maximal können 80x80μm
gescannt werden.
time/pixel [ms] : Zeitdauer für ein Pixel. Beispiel 128x128 Pixel, 3ms pro Pixel
-> die Messung dauert 128x128x3=49 Sekunden.
direction :
sollte immer auf ‚uni’ gestellt sein. Es wird immer nur in einer
Richtung gescannt.
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Sind die Parameter eingestellt, kann der start Knopf betätigt werden. APD und
Shutter werden automatisch aktiviert und nach einer Messung wieder ausgeschaltet.
Justage der Laserleistung
Übliche Laserleistungen für die Detektion einzelner
Farbstoffmoleküle liegen im Bereich von 1-2 μW,
direkt vor dem Objektiv gemessen. Da dies zur Zeit
nicht möglich ist, muss die Leistung indirekt
eingestellt werden. Typische Emissionszählraten
sind ~ 100-200 counts pro 5ms. Bei höheren
Zählraten muss die Anregungsleistung mit dem
Abschwächer (siehe Abbildung 2) verringert werden. Die Zählrate kann während
einer Messung in der oberen rechten Abbildung abgelesen werden.
Daten speichern
Ist ein Bild vollständig gescannt, müssen die Daten für
die weitere Bearbeitung gespeichert werden. Dazu
muss die save Taste gedrückt werden.
4.4.3 Aufnahme von Fluoreszenzzeitspuren
Nachdem ein Fluoreszenzbild aufgenommen wurde, können einzelne Moleküle
näher untersucht werden. Dazu muss der Cursor aktiviert sein und auf ein
Molekül positioniert werden. Über einen Tastendruck [goto
cursor] fährt nun der Piezoscanner tatsächlich an
die Position, d.h. das gewählte Molekül befindet sich
im Focus des Mikroskopobjektivs.
Eine Zeitspur der Fluoreszenz kann einfach aufgenommen werden. Dazu muss im
vornherein die Zeitauflösung (time bin) eingestellt werden. [time
bin = 1ms] bedeutet, das jede Millisekunde ein neuer Zählvorgang
gestartet wird. Die Zählergebnisse werden fortlaufend in
einem File gespeichert. Für eine höhere Zeitauflösung
muss der Fastcount-Modus verwendet werden. Hier ist eine Zeitauflösung
bis zu 10μs möglich. WICHTIG: Über den Kanalwähler wird bestimmt,
welche APD gespeichert wird!
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Beendet wird die Aufnahme einer Zeitspur durch nochmaliges Drücken des
entsprechenden Schalters. Während im Fastcount-Modus die Daten ‚on the fly’, also
schon während einer Messung gespeichert werden, müssen im
langsameren Modus die Daten manuell gespeichert werden.
Bei funktionierendem Betrieb sollten Laser und APD-Detektoren automatisch aktiviert
und auch wieder deaktiviert werden.
4.5 Datenauswertung
Die gemessenen Daten – Fluoreszenzbilder und Zeitspuren – werden mit speziellen
Software-Routinen (MATLAB) ausgewertet.
4.5.1 Analyse der Fluoreszenzbilder
Das Programm IMAGE1 muss aufgerufen werden.
Abbildung 20 : Oberfläche der Bildauswertungssoftware IMAGE1
Mit Hilfe der Maus wird eine gemessene Bild-Datei ausgewählt. Nach dem Einladen
werden die Daten der beiden verwendeten Detektoren APD1 und APD2 gleichzeitig
angezeigt. Als Achsenbeschriftung werden die Pixel angezeigt, dies muss bei der
Auswertung beachtet werden. Durch einfaches ‚Anklicken’ eines hellen Spots in D1
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oder D2 springt das Fadenkreuz auf diese Position. Durch Drücken der [FIT] Taste
wird ein zweidimensionaler Gauss-Fit des markierten Spots (Molekül)
durchgeführt. Standardmäßig wird dabei eine Fläche von 30x30 Pixeln
angefittet. Diese Größe kann aber mit den beiden Tasten [zoom +] und [zoom -]
verändert werden.
Die Fit-Ergebnisse erscheinen im unteren linken Fenster. Es werden beide Kanäle
unabhängig (hintereinander) angefittet mit:
I(x, y)
2
( x−x
) ( y−y
)
0
2
2
0
2
−
−
2σ
2σ
= amp ⋅ e ⋅ e
(9)
Als Ergebnis werden angegeben x0/y0, σ und amp für beide Kanäle.
4.5.2 Analyse der Zeitspuren
Das Programm TRACE1 muss aufgerufen werden.
Abbildung 21 : Oberfläche der Auswertungssoftware TRACE1. Damit können
zeitabhängige Signale statistisch ausgewertet werden.
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Die Daten einer Zeitspur werden durch einfaches Anklicken in dem Directory-Fenster
ausgewählt und geladen. Im Praktikum werden typischerweise zwei
Detektoren verwendet, zwischen diesen beiden Kanälen kann über die
Taste [ch x] umgeschaltet werden.
Wenn nicht die gesamte Zeitspur für die weitergehende Auswertung (Autokorrelation)
verwendet werden soll, muss ein Bereich gewählt werden. Dazu muss der Cursor auf
den Anfangs- bzw. Endpunkt gesetzt werden und jeweils eine
der Tasten [set start] bzw. [set end] gedrückt werden.
Der Cursor wird durch einfaches Anklicken der gewünschten Position in der Zeitspur
gesetzt. Der angezeigte Ausschnitt der Zeitspur kann ausgewählt werden. Dabei
bedeuten :
nach links zoomen stauchen nach rechts
Eine Autokorrelation des ausgewählten Abschnittes wird durch Drücken der Taste
[correlate] gestartet. Je nach Länge der Zeitspur kann dieser Vorgang einige
Sekunden dauern.
Eine Zeitspur lässt sich durch Wertepaare t i
, c
i
darstellen, i = 1, K,
n . Die Breite
eines Punktes, die wir bei unserer Messung durch [timebin] eingestellt hatten, ist
Δ t = t i + 1
− ti
, die Anzahl der gezählten Photonen eines Zeitpunktes beträgt c
i
.
Allgemein wird bei einer Korrelation untersucht, in wieweit verschiedene Ereignisse
von einander abhängen. Dies können vollkommen unterschiedliche Dinge sein und
daher werden Korrelationen in sehr vielen Bereichen wie z.B. in der Medizin,
Wirtschaft etc. verwendet.
In den Naturwissenschaften basieren einige wichtige Messprinzipien auf dem
Aufstellen von Korrelationen. Ein Beispiel dafür ist die hier verwendete
Autokorrelation der gemessenen Intensitätsfluktuationen. Da die Intensitätsfluktuationen
als Funktion der Zeit untersucht werden, handelt es sich um eine
Zeitkorrelationsfunktion.
Bei einer Autokorrelation wird eine Größe mit sich selbst korreliert. Mit K wird ganz
allgemein der Mittelwert einer Funktion bezeichnet
() t c(t' )
F c
= c
(10)
Da unsere Messwerte diskret vorliegen, wird die Korrelationsfunktion mit dem
Software-Programm wie folgt berechnet:
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F
c
i= 1 j=
1
( Δt) = ci( ti
) c
j( t
j
) =
2
n
n
∑∑c c
n
⎛
⎜ ∑
i=
1
⎝
c
i
i
⎞
⎟
⎠
j
(11)
Die normierte Intensitätskorrelationsfunktion F c
( Δ t)
wird der Einfachheit halber nun
im folgenden als Funktion der Zeit geschrieben, F c
( t)
. Das Ergebnis wird in dem
oberen rechten Fenster angezeigt.
In einem weiteren Schritt kann an die berechnete Korrelationsfunktion entweder eine
Exponentialfunktion
F
−kt
c
() t A + B ⋅ e
= (12)
oder eine gestreckte Exponentialfunktion
F
c
−( kt )
() t A + B ⋅ e
b
= (13)
angepasst (gefittet) werden. Über die Tasten [fit start + -] bzw. [fit end + -] kann der
Bereich der Korrelationsfunktion bestimmt werden, an
den die analytische Funktion angefittet werden soll.
Das Ergebnis des Fits wird in dem Fenster unten rechts angezeigt. Mit der Taste
[save data] können die Korrelationsergebnisse (Korrelationsfunktion,
Fitkurve und Fitergebnisse) gespeichert werden. Es wird ein ASCII-File
mit dem Namen *_fiterg.dat erzeugt.
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5 Aufgabenstellung
Für die Durchführung der Aufgaben ist es notwendig, die vorhergehenden Kapitel
gelesen zu haben. Für die aktuellen Versuche wird als Anregungslichtquelle ein roter
Diodenlaser ( λ = 635nm)
verwendet. Die Aufgaben teilen sich in zwei unterschiedliche
Bereiche. Beachten Sie sämtliche Fragen und diskutieren Sie diese.
5.1 Bestimmung des räumlichen Auflösungsvermögen
Das laterale Auflösungsverhalten des Mikroskops lässt sich am einfachsten mit einer
Probe bestimmen, die stark fluoresziert und Strukturen aufweist, die kleiner sind als
die mögliche Auflösung des Mikroskops. Wir verwenden in dem Versuch
Polymerkugeln, die mit Farbstoffen markiert sind (Tetraspeck - Molecular Probes).
Die Kugeln befinden sich auf einem Deckgläschen ohne weitere Matrix und haben
einen Durchmesser von 100nm.
(a) Setzen Sie eine Probe mit Tetraspeck-Kugeln in das Mikroskop ein. Hier ist
äußerste Sorgfalt geboten, um das Mikroskopobjektiv nicht zu beschädigen.
(b) Fokussieren Sie das Objektiv (siehe Bedienungsanleitung).
(c) Scannen Sie die Probe so, dass Sie insgesamt mindestens 10 Polymerkugeln
vollständig erfasst haben. Beginnen Sie dafür zuerst mit sehr niedriger
Anregungsleistung und erhöhen Sie diese sukzessive, bis eine maximale Zählrate
von 200 cts/5ms gemessen wird. Die Daten der gescannten Bilder sollen
abgespeichert werden und mit der beschriebenen Software (IMAGE1) ausgewertet
werden.
Folgende Größen sollen bestimmt werden:
- maximale Intensität APD1 und APD2 (woher kann der Unterschied
herrühren?)
- Breite der Spots : Als Ergebnis soll die mittlere FWHM für beide Kanäle
und die Standardabweichung angegeben werden (Full Width at Half
Maximum)
Wie groß ist nun das optische Auflösungsvermögen des Mikroskops?
Welche Rolle spielt die Größe der untersuchten Teilchen bei der Berechnung der
Auflösung?
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5.2 Untersuchung von Terrylendiimid (TDI)
Dieser Farbstoff zeichnet sich u.a. durch seine sehr hohe Photostabilität aus.
Absorptions- und Emissionsspektren sind in der folgenden Abbildung gezeigt. In
dem Praktikumsversuch wird er mit einem Diodenlaser (nominell 635nm) angeregt.
Die Fluoreszenz wird über einen Bandpass von der Anregungswellenlänge getrennt.
Das emittierte Licht wird polarisationsaufgelöst mit zwei Detektoren aufgezeichnet
(siehe Bedienungsanleitung) .
(a) Setzen sie ein Probengläschen mit TDI in PMMA in das Mikroskop ein.
(b) Fokussieren sie das Objektiv.
(c) Stellen Sie die Laserleistung auf einen Wert ein, der vom Assistenten während
des Versuchs genannt wird. Die Leistung muss höher als bei der Untersuchung der
Polymerkugeln sein. Warum?
(d) Scannen Sie ein Bild, wählen Sie dazu einen geeigneten Ausschnitt. Als günstige
Zeit pro Pixel (bin time) können 5ms gewählt werden. Warum ist das Signal-zu-
Rausch-Verhältnis hier deutlich ungünstiger als bei den farbstoffmarkierten
Polymerkugeln?
(e) Werten Sie 2 Moleküle analog zu den Kugeln aus (Teil 1). Warum gibt es hier
deutlich größere Unterschiede in den detektierten Intensitäten zwischen den beiden
Detektoren APD1 und APD2? Was ist der Unterschied zwischen APD1 und APD2?
(f) Nehmen Sie für 10 Moleküle eine Zeitspur mit einer Zeitauflösung von 10μ s auf.
Die notwendige Anregungsintensität und die Länge der Zeitspuren werden vom
Assistenten angegeben. Bestimmen Sie mit Hilfe der Software TRACE1 die
Triplettlebensdauern der TDI-Moleküle (Mittelwert, Standardabweichung).
A bzw. Ψ em
/ willk. Einheiten
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
Absorption
Emission
(λ ex
= 600 nm)
TDI in Toluol
O
O
N
N
O
O
0.0
500 600 700 800
λ / nm
Abbildung 22 : Absorptions- und Emissionsspektren von Terrylendiimid (TDI)
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Theoretische Grundlagen :
In der folgenden Abbildung ist das Drei-Niveau-System des TDI mit den wichtigsten
Übergängen gezeigt. Nach einer Anregung vom Grundzustand S 0
in den ersten
angeregten Singulettzustand S 1
kann mit einer kleinen Wahrscheinlichkeit auch der
Triplettzustand T
1
populiert werden. Während die Lebensdauer des S 1
Zustandes
−9
nur etwas 3.5 ⋅ 10 s beträgt, ist der Triplettzustand mit einer Lebensdauer von
−6
50 − 100 ⋅10
s wesentlich stabiler.
Abbildung 23 : Das Drei-Niveau-System
Für die weiteren Betrachtungen ist es notwendig, die zeitliche Entwicklung der
Besetzungswahrscheinlichkeiten des angeregten Zustandes ρ
2
zu kennen.
Folgendes Gleichungssystem beschreibt die zeitliche Entwicklung
d
dt
ρ ρ
(14)
1
= −k12ρ1
+ k
21ρ
2
+ k
31
3
d
dt
2
= + k12ρ1
− k
21ρ
2
− k
23
ρ ρ
(15)
2
d
dt
ρ = + ρ − ρ
(16)
3
k
23 2
k
31
3
mit ρ + ρ + ρ 1.
1 2 3
=
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Nach Lösen des Gleichungssystems (gekoppelte Differentialgleichungen) erhält man
ρ
−ατ −βτ
[ − ( + C ) e + C e 1]
2
∝ 1
m
m
+
(17)
mit
α ≈ k
12
+ k 21
(18)
k
k
12 23
β ≈ k
31
+
(19)
k12
+ k
21
C
k
k
12 23
≈ (20)
k
31( k12
+ k
21)
Wie aus den Gleichungen zu erkennen ist, liefern die Zerfallskonstante β und der
molekulare Kontrast C Informationen über die Intersystem-Crossing Rate k 31
und
damit über die Triplett-Lebensdauer.
Man nennt den Zustand, in dem ein Molekül in der Lage ist zu fluoreszieren, einen
‚An’-Zustand. Im ‚Aus’-Zustand befindet sich das Molekül im Triplett-Zustand und
kann nicht fluoreszieren. Der Wechsel zwischen ‚An’ und ‚Aus’-Zuständen ist in den
Zeitspuren als Wechsel zwischen Helligkeits- und Dunkelperioden zu sehen. Die
Photonen werden nicht kontinuierlich, sondern meist in Bündeln, ’bunches’ emittiert.
Der Einfachheit halber werden die Übergangsraten in diese Zustände mit k on
und
k
off
bezeichnet. Die Rate, mit der der Triplettzustand verlassen wird, ist k
on
= k31
.
Der ‚Aus’-Zustand wird aus dem Grundzustand S 0
über den ersten angeregten
k12
Zustand S
1
erreicht, koff
= k23
, wobei angenommen wurde, dass die
k21
+ k12
Anregungsrate wesentlich kleiner ist als die Fluoreszenzrate, k
12

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Hierbei wurde angenommen, dass die Intensitäten im ‚An’-Zustand wesentlich größer
sind als im ‚Aus’-Zustand, I
on
>> Ioff
. Mit der Annahme, dass die Zeitauflösung einer
Messung deutlich kleiner (geringer 1 ) als die Fluoreszenzlebensdauern ist, erhält man
aus der Autokorrelation einer Zeitspur
( ) −βτ
()
g 2 τ = 1+
Ce
(23)
(Es handelt sich um eine Korrelationsfunktion 2. Ordnung)
1 Fluoreszenzlebensdauern liegen bei einigen ns, die Zeitauflösung der Messung beträgt einige μs
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6 Fragen zur Vorbereitung
• Wodurch wird das räumliche Auflösungsvermögen eines Mikroskops
bestimmt?
• Wie vergleicht sich ein konfokales Mikroskop mit einem (‚herkömmlichen‘)
Weitfeldmikroskop?
• Was sind die Voraussetzungen, um einzelne Moleküle untersuchen zu
können?
• Warum könnten Einzelmoleküluntersuchungen interessant sein?
• Welche Parameter können prinzipiell an einzelnen Farbstoffen untersucht
werden?
• Welche Detektoren sind für die optische Einzelmolekülmikroskopie geeignet?
• Welche Informationen erhält man aus Korrelationsfunktionen?
• Welche Art von Korrelationsfunktion wird in dem vorliegenden Versuch
bestimmt?
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7 Literatur:
Die folgende Liste wurde übernommen von
http://www.olympusfluoview.com/books/index.html, Stand September 2011
- Handbook of Biological Confocal Microscopy - James B. Pawley (editor),
Publisher: Springer; 2nd edition (March 31, 1995) , ISBN: 0306448262
- Confocal Microscopy for Biologists - Alan R. Hibbs, Springer; 1 edition
(August 4, 2004), ISBN: 0306484684
- Cell Biological Applications of Confocal Microscopy - Brian Matsumoto (editor),
Academic Press; 2 edition (December 24, 2002) , ISBN: 0125804458
- Confocal Microscopy: Methods and Protocols - Stephen W. Paddock (editor),
Humana Press; 1st edition (January 15, 1999) , ISBN: 0896035263
- Confocal Laser Scanning Microscopy - Colin J. R. Sheppard and David M.
Shotton, Springer; 1 edition (January 1997) , ISBN: 0387915141
- Confocal and Two-Photon Microscopy: Foundations, Applications, and
Advances - Alberto Diaspro (editor) Wiley-Liss; 1 edition (November 22,
2001) , ISBN: 0471409200
- Confocal Microscopy (Methods in Enzymology - Volume 307) - P. Michael
Conn (editor), Academic Press; 1 edition (September 7, 1999) , ISBN:
0121822087
- Principles of Three-Dimensional Imaging in Confocal Microscopes - Min Gu,
Wspc (July 29, 1996) , ISBN: 9810225504
- Three-Dimensional Confocal Microscopy: Volume Investigation of Biological
Systems - John K. Stevens, Linda R. Mills, and Judy E. Trogadis (editors),
Academic Press; 1 edition (September 15, 1994) , ISBN: 0126683301
- Confocal Scanning Optical Microscopy and Related Imaging Systems -
Timothy R. Corle and Gordon S. Kino, Academic Press; 1 edition (September
12, 1996) , ISBN: 0124087507
- Confocal Microscopy - Tony Wilson (editor), Academic Press (November 11,
1990) , ISBN: 0127572708
- Selected Papers on Confocal Microscopy - Barry R. Masters and Brian J.
Thompson (editors), SPIE Press (November 15, 1996) , ISBN: 0819423726
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8 Gefährdungsbeurteilung des Versuches
Laserstrahlung kann potentiell schädlich für die Augen sein. Es sind die
entsprechenden Sicherheitsbestimmungen einzuhalten.
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9 Tabellen für die Messwerte
(A) räumliches Auflösungsvermögen
#
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
amp 1
cts/5ms
σ 1
Pixel
amp 2
cts/5ms
σ 2
Pixel
(B) Intensitätsfluktuationen, Autokorrelationfunktion
# A B k β
1 1
2 1
3 1
4 1
5 1
6 1
7 1
8 1
9 1
10 1
1
1
1
1
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