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Konfokale Einzelmolekülmikroskopie
5 Aufgabenstellung
Für die Durchführung der Aufgaben ist es notwendig, die vorhergehenden Kapitel
gelesen zu haben. Für die aktuellen Versuche wird als Anregungslichtquelle ein roter
Diodenlaser ( λ = 635nm)
verwendet. Die Aufgaben teilen sich in zwei unterschiedliche
Bereiche. Beachten Sie sämtliche Fragen und diskutieren Sie diese.
5.1 Bestimmung des räumlichen Auflösungsvermögen
Das laterale Auflösungsverhalten des Mikroskops lässt sich am einfachsten mit einer
Probe bestimmen, die stark fluoresziert und Strukturen aufweist, die kleiner sind als
die mögliche Auflösung des Mikroskops. Wir verwenden in dem Versuch
Polymerkugeln, die mit Farbstoffen markiert sind (Tetraspeck - Molecular Probes).
Die Kugeln befinden sich auf einem Deckgläschen ohne weitere Matrix und haben
einen Durchmesser von 100nm.
(a) Setzen Sie eine Probe mit Tetraspeck-Kugeln in das Mikroskop ein. Hier ist
äußerste Sorgfalt geboten, um das Mikroskopobjektiv nicht zu beschädigen.
(b) Fokussieren Sie das Objektiv (siehe Bedienungsanleitung).
(c) Scannen Sie die Probe so, dass Sie insgesamt mindestens 10 Polymerkugeln
vollständig erfasst haben. Beginnen Sie dafür zuerst mit sehr niedriger
Anregungsleistung und erhöhen Sie diese sukzessive, bis eine maximale Zählrate
von 200 cts/5ms gemessen wird. Die Daten der gescannten Bilder sollen
abgespeichert werden und mit der beschriebenen Software (IMAGE1) ausgewertet
werden.
Folgende Größen sollen bestimmt werden:
- maximale Intensität APD1 und APD2 (woher kann der Unterschied
herrühren?)
- Breite der Spots : Als Ergebnis soll die mittlere FWHM für beide Kanäle
und die Standardabweichung angegeben werden (Full Width at Half
Maximum)
Wie groß ist nun das optische Auflösungsvermögen des Mikroskops?
Welche Rolle spielt die Größe der untersuchten Teilchen bei der Berechnung der
Auflösung?
Johannes Gutenberg - Universität
Institut für Physikalische Chemie
Seite 32
Grundmodul
Physikalische Chemie