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Konfokale Einzelmolekülmikroskopie
1 Die Fluoreszenz einzelner Moleküle – Vergleich zu
konventionellen Ensemblemessungen
Bei der konventionellen Fluoreszenzspektroskopie wird eine hinreichend große
Anzahl (ein Ensemble) von Molekülen auf ihr Fluoreszenzverhalten hin untersucht.
Die gemessene Fluoreszenz entsteht durch Überlagerung der Beiträge einzelner
Moleküle in dem Probenvolumen. Wenn alle Moleküle zeitlich und spektral genau
gleiches Verhalten zeigen, wird die Messung an einem einzelnen Molekül genau die
gleichen Ergebnisse liefern wie Ensemblemessungen, allerdings mit einem deutlich
ungünstigerem Signal-zu-Rausch Verhältnis.
In den meisten Systemen unterscheiden sich jedoch die Fluoreszenzeigenschaften
der Moleküle untereinander. Dabei sind Unterschiede sowohl in den spektralen
Eigenschaften wie auch im zeitlichen Verhalten möglich. Nimmt beispielsweise die
Fluoreszenz einer Farbstofflösung mit zunehmender Bestrahlungsdauer ab, kann
nicht ohne weiteres entschieden werden, ob nun jedes einzelne Farbstoffmolekül
weniger abstrahlt oder aber ob ein zunehmender Anteil der Moleküle überhaupt nicht
mehr fluoresziert – oder ob beide Effekte gleichzeitig auftreten.
Viele spektroskopische Eigenschaften von Farbstoffmolekülen können erst durch die
Untersuchung einzelner Moleküle bestimmt werden. Im folgenden werden Beispiele
für die beiden wichtigen Aspekte – spektrale Eigenschaften und zeitliches Verhalten
– skizziert.
1.1 Homogene und inhomogene Linienform
Die Farbstoffmoleküle liegen typischerweise in einer Lösung oder eingebettet in eine
feste Matrix vor. Je nach Art der Umgebungsmoleküle und deren räumlicher
Anordnung um einen Farbstoff werden dessen spektrale Eigenschaften beeinflusst.
Als Beispiel werden die Emissionsspektren des Farbstoffs Terrylendiimid gezeigt. Es
sind deutliche Unterschiede in den Spektren zu sehen. Je nach lokaler Umgebung
werden die Maxima der Spektra verschoben. In einer Ensemblemessungen würde
man nur ein Gesamtspektrum erhalten, die lokale Information wäre nicht zugänglich.
Johannes Gutenberg - Universität
Institut für Physikalische Chemie
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Grundmodul
Physikalische Chemie