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Konfokale Einzelmolekülmikroskopie
Abbildung 9 : Ortsabhängige Lichtunterdrückung durch eine Lochblende in der
Zwischenbildebene. Der Anregungsstrahlengang wurde hier weggelassen.
Die Kombinationn beider Prinzipien führt im Vergleich zu einem
herkömmlichen
Mikroskop zu wesentlich gesteigertem
lateralen Auflösungsvermögen.
Unter der Annahme, dass Anregungs- und Emissionswellenlängen gleich sind
( λ = λ
ab
= λ em
) , ergibt sich folgendes (optimales) Auflösungsvermögen :
0.4λ
HWB lateral
= und HWB ax
NA
xial
=
0,45λ
NA
(8)
Meistens liegen aber Anregungs-
eine gesonderte Betrachtung
jeweils für die
und Emissionswellenlänge mehr als 10 nm
auseinander, so
dass eigentlich
Absorption und die Emission vorgenommenn werden müsste. NA ist hier die
numerische Apertur des verwendetenn Mikroskopobjektives
(siehe Abbildung 4).
Bisher wurde genau ein Punkt der Probe angeregt und dessen Emission beobachtet.
Um ein
zwei- oder drei-dimensionaless Bild der Probe zu erhalten, wird die Probe mit
Hilfe eines Piezoscanners vor dem Objektiv bewegt, d.h. abgerastert.
Die konfokale
Fluoreszenzmikroskopie hat sich als Schlüsseltechnologie zur
spektroskopischen Untersuchung einzelner Moleküle erwiesen. Sind sie in einer
Probe weiter als das oben angegebene Auflösungsvermögen voneinander entfernt,
könnenn einzelne Moleküle unterschieden werden: man erhält einzelne Leuchtobjekte.
Neben der Intensität können prinzipiell alle möglichen spektroskopischen Parameter
einzelner Moleküle bestimmt werden wie Fluoreszenzlebensdauern, Emissions- und
Absorptionsspektren, Polarisationseigenschaften, Triplettkinetik,
photochemische
Prozesse etc. .
Johannes Gutenberg - Universität
Institut für Physikalische Chemie
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Grundmodul
Physikalische Chemie