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Konfokale Einzelmolekülmikroskopie
3 Konfokale Fluoreszenzmikroskopie
Diese experimentelle Methode hat sich in den letzten Jahren als Standardmethode
für Fluoreszenzmesungen an einzelnen Moleküle etabliert. Die Beschreibung des
experimentellen Aufbaus ist in zwei Teile untergliedert.
In den folgenden Abschnitten wird schrittweise das Prinzip der konfokalen
Fluoreszenzmikroskopie beschrieben (3.1.) , danach folgt der im Praktikum
verwendete Aufbau (3.2.).
3.1 Das Prinzip der konfokalen Mikroskopie
3.1.1 Auflösungsvermögen
Um tatsächlich nur einzelne Moleküle optisch anzuregen, muss das Anregungslicht
sehr stark fokussiert werden. Allerdings sind der Fokussierung von Licht, z.B. mit
einem Mikroskopobjektiv, durch das Beugungslimit Grenzen gesetzt. Der laterale
Durchmesser (senkrecht zur Ausbreitungsrichtung) der erreichbaren Strahltaille w
(Stelle im Strahlengang mit dem geringsten Durchmesser) ist abhängig von der
Wellenlänge λ des Lichtes, von dem Brechungsindex n des Mediums (in dem sich
das Licht ausbreitet) und vom Öffnungswinkel 2 α des Lichtkegels.
Die radiale Ortsabhängigkeit der Intensitätsverteilung I ( x)
in der Taille, beschrieben
durch die Koordinate x, ist näherungsweise gaußförmig,
2
⎛ x ⎞
I − . (4)
( x) ∝ exp
⎜
⎟ 2
⎝ w ⎠
Der Öffnungswinkel hängt mit der Strahltaille über die Beziehung
NA
λ
= n sin α =
(5)
π w
zusammen. Dabei bezeichnet NA die numerische Apertur. Hohe numerische
Aperturen werden mit extrem kurzbrennweitigen Objektiven erreicht, deren
Johannes Gutenberg - Universität
Institut für Physikalische Chemie
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Grundmodul
Physikalische Chemie