Skript - Staff.uni-mainz.de

Konfokale Einzelmolekülmikroskopie
. 23 −1
Mit NA
= 6.02210 mol lässt sich die Anzahl der Farbstoffmoleküle N
Farbstoff
in dem
Volumen V
Det
berechnen:
N
.
.
. 14
Farbstoff
NA
c
Farbstoff
VDet
≈ 2.5 10
= (2)
2.2 Fluoreszenzmessung an einzelnen Farbstoffmolekülen
Um die Fluoreszenzeigenschaften einzelner Moleküle untersuchen zu können,
werden oft extrem stark verdünnte Proben untersucht. Die Konzentration der zu
untersuchenden Spezies wird so gewählt, dass sich immer nur maximal ein Molekül
im Fokus des Mikroskopobjektivs befindet. Außer bei Messungen in der Gasphase
befinden sich die Fluorophore in einer festen oder flüssigen Matrix. Als feste Matrix
können amorphe (z.B. Polymere) oder Kristalle verwendet werden.
Abbildung 4: Bei genügend gro0em Abstand können zueinander können einzelne
Fluorophore getrennt betrachtet werden
Oft zeigt die Matrix auch eine schwache Fluoreszenz, die durch Verunreinigungen
verursacht wird. Daneben treten Streueffekte (Rayleigh- und Ramanstreuung) an den
Molekülen der Matrix auf. Reflexionen an den Phasengrenzflächen sind eine weitere
Ursache für ungewünschte Effekte. Daher ist es vorteilhaft, möglichst kleine
Anregungs- und Detektionsvolumina zu verwenden. Je kleiner das beleuchtete
Volumen ist, in dem sich der Fluorophor befindet, desto signifikanter kann das
Fluoreszenzsignal auf dem Lichtuntergrund detektiert werden. Ausschlaggebend ist
dabei nicht die Höhe des Untergrundes selbst, sondern die zeitliche Änderung
(Fluktuation) des Untergrundes (Signal/Rausch-Verhältnis). Je kleiner das
Detektionsvolumen ist, desto geringer wird auch das Hintergrundrauschen bei einer
Messungen sein
Neben einer sehr empfindlichen Photonendetektion müssen auch die Fluorophore
bestimmten Anforderungen genügen, damit signifikante Messergebnisse resultieren
können:
(A) Der Absoptionsquerschnitt σ
B
eines Moleküls B muss bei der verwendeten
Anregungswellenlänge λ
ex
möglichst groß sein, damit der fluoreszenzfähige Zustand
von dem Molekül effizient besetzt werden kann. Im Zusammenhang mit Einzel-
Johannes Gutenberg - Universität
Institut für Physikalische Chemie
Seite 8
Grundmodul
Physikalische Chemie