Diagnostik im Dialog - Roche Diagnostics

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Medizin von morgen Auf die richtige Kombination kommt es an – Mehrfachfärbungen erweitern die Möglichkeiten der Tumordiagnostik Der gleichzeitige Nachweis von zwei Biomarkern an einem Gewebeschnitt kann für die Prognose des Patienten oder die richtige Therapieauswahl oft wesentlich mehr Fragen beantworten als die Summe von zwei Einzelfärbungen. Ist ein therapierelevanter Marker nur in einer be - stimmten Tumorzellpopulation vorhanden? In welchem Verhältnis stehen zwei Proteine im Gewebe zueinander, die im Hinblick auf ihre biologische Funktion in Wechselwirkung stehen könnten? Sind sie ko-lokalisiert, also in identischen Bereichen eines Tumors nachweisbar, oder werden sie von verschiedenen Anteilen gebildet? Die räumliche Beziehung zwischen Gewebebiomarkern zu kennen, kann das Verständnis der Wirkmechanismen neuer zielgerichteter Therapien entscheidend verbessern. Die genaue Lokalisation von Biomarkern im Gewebe und deren Zuordnung zu bestimmten Differenzierungs- oder Aktivierungszuständen der Tumorzellen ist besonders dann von Bedeutung, wenn diese Marker nicht von allen Tumorzellen gleichermaßen gebildet werden, der Tumor also heterogen ist. Maligne Tumoren können aus unterschiedlichen Zellpopulationen zusammengesetzt sein, die zwar einen gemeinsamen genetischen Fingerabdruck besitzen, aber dennoch ganz unterschiedliche Funktions- und Differenzierungszustände aufweisen. Ein Beispiel sind die sogenannten „Tumorstammzellen“, eine kleine Anzahl von Zellen, die hinsichtlich ihrer Regenerations- und Teilungsfähigkeit besondere „stammzellähnliche“ Eigenschaften besitzen und sich darin von der Masse der Tumorzellen unterscheiden. Ein weiteres Beispiel für ein heterogenes Erscheinungsbild von invasiv wachsenden Tumoren sind Unterschiede zwischen dem Tumorzentrum, wo Tumorzellen weitgehend von ihresgleichen umgeben sind, und dem Tumorrand, wo sich maligne Zellen in direktem Kontakt mit nichtmalignem Umgebungsgewebe befinden. Schließlich kann es sogar eine gewisse genetische Heterogenität innerhalb von Tumoren geben, oder Entzündungszellen verändern die Expression von Biomarkern im Tumor. Gewebeschnitte sind Spiegelbilder des Tumors Im Verständnis dieser „Tumorheterogenität“ liegt der besondere Vorteil der mikroskopischen Untersuchung gegenüber proteinbiochemischen oder RNAbasierten Nachweisverfahren an zerkleinertem, homogenisiertem Tumorgewebe. Wenn Gewebe zerkleinert und vermischt wird, spiegeln die Untersuchungsergebnisse einen Mittelwert der Biomarkerexpression in allen Zellen der Probe wider. Ein Marker, der zwar stark, aber nur in wenigen Tumorzellen exprimiert wird, kann durch Verdünnungseffekte das gleiche Signal ergeben wie ein schwach, aber von vielen Zellen produziertes Protein. Gefärbte Gewebeschnitte zeigen dagegen nicht nur die einfache Anwesenheit oder Gesamtmenge eines Biomarkers, sondern auch dessen Bezug zu Struktur und Nachbarschaft des Tumors. Die wichtigste Methode für den Proteinnachweis im Gewebe ist die Immunhistochemie, ein mehrstufiger Färbeprozess, bei dem die spezifische Bindung eines sogenannten „Primärantikörpers“ an den nachzuweisenden Biomarker mit verschiedenen Detektionsreagenzien sichtbar gemacht wird. Dabei wird entweder mit chemischen Farbreaktionen („Chromogenen“) gearbeitet, die in herkömmlicher Hellfeldmikroskopie sichtbar sind, oder mit Fluoreszenzfarbstoffen, die Licht in einem gut definierten Wellenlängenbereich emittieren und mit speziellen Mikroskopen sichtbar werden. In der Routinediagnostik kommen vorwiegend Einfachfärbungen mit chromogenen Detektionssystemen zum Einsatz. Dies hat vor allem pragmatische Gründe: Chromogene Färbungen können mit Routinemikroskopen ausgewertet werden und bleichen nicht aus – sie können daher im Hellen gefärbt, transportiert, analysiert und archiviert werden. Wenn eine größere Anzahl von Markern erfor derlich ist, wie z.B. bei der Immunphänotypisierung maligner Lymphome oder Bestimmung von Hormonrezeptor- und HER2-Status von Brustkrebsgewebe, werden mehrere Färbungen oft an konsekutiven Schnitten durchgeführt. Mehrfachfärbungen unterstützen die Entwicklung neuer Krebstherapien Das beschriebene Vorgehen ist für Tumormarker, die homogen im ganzen Tumor exprimiert werden, gut etabliert und ausreichend. Mit den immer stärker zielgerichteten Ansätzen zur Krebstherapie („Personalisierte Medizin“) wachsen auch die Ansprüche an die Histopathologie. Mehrfachfärbungen erweitern den Informationsgehalt noch einmal erheblich, weil sie die für einen Biomarker positiven Tumorzellen oder deren Umgebung innerhalb des Gewebeverbandes genauer charakterisieren. Doppel- und Mehrfachmarkierungen werden daher immer öfter für Biomarkeranalysen in klinischen Studien angefragt. Denn je präziser Tumorzellen charakterisiert sind, desto zielgerichteter kann an neuen Wirkstoffen gearbeitet werden. Beispielsweise kann es um folgende Fragen gehen: O Wird ein neuer Biomarker in allen Tumorzellen exprimiert, oder nur in Subpopulationen am invasiven Tumorrand, oder in Tumorzellen mit stammzellähnlichen Eigenschaften? O Wie greift das Immunsystem des Patienten den Tumor unter einer neuen Therapie an? O In welchen Bereichen werden Signalproteine der Zelle unter Behandlung vom Zytoplasma in den Zellkern verlagert? Früher konnten nur aufwendige Fluoreszenzmarkierungen an relativ wenigen Proben diese Fragestellungen beantworten. Neue Technologien ermöglichen es jedoch, bisher bestehende Grenzen zu durchbrechen und Mehrfachmarkierungen auch mit chromogenen Farbstoffen in größerem Umfang durchzuführen, selbst wenn diese Farben für das menschliche Auge kaum unterscheidbar sind. 20 Ausgabe 30 • 10/2010
Eine dieser neuen Technologien ist die Bearbeitung mikroskopischer Bilder durch Multispektralanalyse. Der Computer erfasst die spektralen Eigenschaften von Farbstoffen und stellt die Farbintensität für getrennte Farbkanäle dar. Diese können anschließend mit speziellen Bildverarbeitungsprogrammen analysiert und in einer für das menschliche Auge gut erkennbaren Weise dargestellt werden. (Abb.). Der grundsätzliche Ansatz dieser histopathologischen Bilddatenanalyse ist ähnlich der Technologie für das „in-vivo Optical Imaging“, einer Methode, mit der Tumorantigene durch fluoreszenz-markierte Antikörper nicht-invasiv im Versuchstier nachgewiesen werden können. Interdisziplinäre Zusammenarbeit als Motor Die Multispektralanalyse und das „in-vivo Optical Imaging“ gehören zum technologischen Repertoire am Roche Standort Penzberg. Die in dieser Technik erfahrenen Wissenschaftler der onkologischen Forschung und das Pathologie-Team arbeiten eng zusammen und stellen so die Verbindung her zwischen experimenteller Forschung und der Anwendung neuer Biomarker in frühen klinischen Studien. Interdisziplinäre Zusammenarbeit wird auch nach der mikroskopischen Gewebeuntersuchung bei der statistischen Analyse der Bilddaten groß geschrieben: Biostatistiker, Bioinformatiker und Naturwissenschaftler kooperieren mit dem Team der experimentellen Pathologie schon in frühen Phasen der Test entwicklung, damit die Auswertung von histologischen Schnittpräparaten von Anfang an so robust und reproduzierbar wie möglich gemacht wird. Der Brückenschlag von der experimentellen Pathologie in die frühe klinische Forschung ist ein wichtiger Schritt in der Biomarkerentwicklung. Das langfristige Ziel aber ist die Anwendung gewebebasierter Nachweismethoden in großen klinischen Studien und letztendlich in der klinischpathologischen Diagnostik. Von Anfang an arbeiten dafür bei Roche in Penzberg Pathologen und Naturwissenschaftler der globalen Funktion „Translational Research Sciences“ zusammen mit Kollegen von Roche Tissue Diagnostics / Ventana. Das „Joint Histopathology Laboratory“ wurde eigens aufgebaut, um zukünftig das Potenzial von Biomarkern aus onkologischen Forschungsprojekten für die breite Anwendung in der pathologischen Routinediagnostik nutzbar zu machen. Arbeitsabläufe innovativer Lösungen für Mehrfachmarkierungen in der Gewebediagnostik sollen unmittelbar an automatisierte Protokolle der Ventana-Färbeautomaten angepasst werden. Das sind die besten Voraussetzungen für einen späteren hohen Probendurchsatz. A C Abb.: Der Computer detektiert mittels Multispektralanalyse Farbunterschiede, die für das menschliche Auge kaum erkennbar sind. In einer chromogenen Doppelfärbung wurde ein Marker mit einem braunen Farbstoff, und ein weiterer mit einem roten Farbstoff nachgewiesen. Die linken Bilder (A&C) stellen zwei unterschiedliche Tumorschnitte dar und zeigen jeweils die Ansicht im Lichtmikroskop, bei der das menschliche Auge den Unterschied zwischen braun und rot nur unzureichend erkennen kann. Die rechten Bilder (B&D) zeigen das jeweils entsprechende Ergebnis der Multispektralanalyse, bei der die ursprünglich braune Färbung leuchtend grün dargestellt wird. Die zunächst blassrote Markierung wird in ein leuchtendes Rot umgewandelt, und die im Original blassblauen Zellkerne erscheinen in einem kräftigen Dunkelblau. Damit wird sichtbar, was man mit dem konventionellen Mikroskop nur ahnen konnte: Während die beiden Marker im Lichtmikroskop (A&B) eher in getrennten Arealen nachweisbar sind, zeigt die Multispektralanalyse (C&D) eine Vermischung der Farbkanäle in ein gelbliches Grün, was auf Kolokalisation hinweist. Würde man die beiden Gewebeproben homogenisieren und eine Biomarkeranalyse am Lysat durchführen, könnten durchaus ähnliche Messwerte resultieren. Die mikroskopische Lokalisation der Marker gibt dagegen wichtige Hinweise auf den unterschiedlichen Funktionszustand der Zellen in den beiden Tumorproben. B D Die Expertise des Pathologen bleibt unersetzbar Mehrfachmarkierungen können die diagnostischen Möglichkeiten erheblich erweitern – die Expertise erfahrener Pathologen in der Tumordiagnostik wird jedoch durch zusätzliche Marker und ausgefeilte computergestützte Analysemethoden keinesfalls ersetzt. Außerdem kann die beste Technologie zur Auswertung von Färbeergebnissen nur so gut sein wie das Ausgangsmaterial – die Qualität der Gewebeprobe ist also einer der Schlüsselfaktoren für die Diagnostik aber auch zur erfolgreichen Entwicklung neuer Biomarker. Ebenso wichtig wie die Nutzung neuer Analyse werkzeuge ist deshalb, dass klinisch tätige Ärzte, das Personal im Operationssaal, Pathologen in der Diagnostik und Wissenschaftler im Forschungslabor gut zusammenarbeiten, damit die therapieentscheidenden biologischen Informationen aus dem Tumorgewebe korrekt entziffert werden können. Ausgabe 30 • 10/2010 21
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