Doktorarbeit Nina Ewerdwalbesloh - Universität zu Lübeck
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Material und Methoden<br />
2.2.1.4 Tissue Freezing Medium<br />
Die Sphäroide wurden für die Gefrierschnitte mit möglichst wenig Medium in Jung<br />
Tissue Freezing Medium (Leica Instruments, Nussloch) pipettiert und bei -20°C gelagert.<br />
2.2.2 MIB-1-Färbung für humane Gefrierschnitte<br />
MIB-1 (DAKO Cytomation, Hamburg) (1 µg/ml) wurde mit TBS / 10% FCS 1:75<br />
verdünnt. Die wie unter Absatz 2.2.1.2 (Aceton / Chloroform) fixierten Zellen wurden<br />
mit 100 µl 1:75 verdünntem MIB-1-Primärantikörper eingedeckt und für 1 Stunde in<br />
einer feuchten Kammer bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dreimaligem Waschen für je<br />
3-5 Minuten mit 1:10 verdünnten TBS wurde 100 µl Peroxidase-konjugierte Ziege-anti-<br />
Maus-PO-IgG (Dianova, Hamburg) als erster Sekundärantikörper aufgetragen. Dieser<br />
Antikörper wurde vorher mit TBS/10% FCS 1:50 verdünnt. Nach 30-minütiger<br />
Inkubationszeit wurden die Objektträger wiederum mit 1:10 verdünntem TBS dreimal<br />
gewaschen. Als zweiter Sekundärantikörper wurde Peroxidase-konjugierte Hase-anti-<br />
Ziege-IgG (DAKO) verwendet, der vorher auf gleiche Weise 1:50 verdünnt wurde. Nach<br />
30 Minuten in der feuchten Kammer wurde der Objektträger nochmals mit 1:10<br />
verdünntem TBS gewaschen (3x). Nach diesen Arbeitsschritten wurden die Sphäroid-<br />
Schnitte mit 2-3 Tropfen AEC (Vector Laboratories, USA) entwickelt. Nach 10 Minuten<br />
wurden diese wieder mit 1:10 verdünntem TBS (3x) und anschließend in Aqua dest.<br />
gewaschen. Die Zellkerne wurden für 10 Minuten mit Hämalaun (Merck-Eurolab,<br />
Darmstadt) gegengefärbt und darauf für 10 Minuten unter fließendem Leitungswasser<br />
gebläut. Nach nochmaligem Waschen mit destilliertem Wasser wurden die Schnitte mit<br />
Kaiser’s Glycerin Gelatine eingedeckelt.<br />
2.3 Zellvialibitäts-Assays<br />
2.3.1 MTT-Assay<br />
2.3.1.1 Mit Oligonukleotiden behandelte Zellen im Monolayer<br />
Mit dem MTT-Assay kann die Anzahl lebender, proliferierenden Zellen bzw. ihr<br />
Aktivitätsniveau gemessen werden (Mosmann, 1983).<br />
Bei MTT (3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) (Sigma,<br />
Deisenhofen) handelt es sich um ein gelbes Tetrazolium Salz, das von mitochondrialen<br />
Dehydrogenasen in lebenden Zellen <strong>zu</strong> blauem Formazan reduziert wird. Da Formazan<br />
nicht vollständig löslich ist, muss es durch DMSO (Dimethylsulfoxid) (Roth, Karlsruhe)<br />
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