Doktorarbeit Nina Ewerdwalbesloh - Universität zu Lübeck

Material und Methoden
2.4.2 DNA-Verdau
Zuerst wurde ein Master-Mix, bestehend aus 1 µl DNase (Invitrogen, Karlsruhe), 1 µl
Puffer (Invitrogen) und 1 µl Merck-Wasser pro Probe, hergestellt. Nun wurden 7 µl
RNA-Probe (700 ng / 7 µl) und 3 µl Master-Mix in ein PCR-Strip (Sarstedt) gegeben und
für 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. DNase verdaut die störende DNA der
Probe. Nach 15 Minuten wurde die DNase mit je 1 µl EDTA (25 nM) (Invitrogen)
abgestoppt und für 10 Minuten bei 65 °C im Cycler (i-Cycler, Bio-rad, München)
inkubiert.
2.4.3 Reverse Transkription (RT-PCR)
Master-Mix 1: 1 µl Random-Primer (Invitrogen)
4 µl dNTP-Mix (Invitrogen) (je 10 nM dATP, dGTP, dCTP, dTTP da
1 :4 verdünnt Endkonzentration 2,5 nM)
pro Probe
Master-Mix 2: 4 µl First Strand Puffer (Invitrogen)
2 µl 0,1 M DTT (Invitrogen)
1 µl RNase Out (Invitrogen)
pro Probe
7 µl der RNA-Verdau-Probe wurden in den Deckel eines PCR-Strips und 5 µl des
Master-Mix in das zugehörige Gefäß pipettiert. Die Probe wurde für 1 Minute bei 1000
RPM und 4 °C herunterzentrifugiert und für 5 Minuten bei 65 °C im Cycler inkubiert.
Danach wurden 7 µl des Master-Mix 2 in den Deckel des Strips pipettiert und nochmals
für 1 Minute bei 4 °C herunterzentrifugiert. Die Proben wurden nun für 10 Minuten bei
25 °C (Streckung der Random-Primer) und für 2 Minuten bei 42 °C (Hybridisierung der
Primer) inkubiert. Nach diesem Schritt wurde ein 1 µl Suprascript II (Invitrogen) in den
Deckel pipettiert, 1 Minute bei 1000 RPM und 4°C herunterzentrifugiert, für 50 Minuten
bei 42°C und 15 Minuten bei 70°C inkubiert. Nach dieser Behandlung wurden die Proben
auf 4°C abgekühlt.
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